基于特征圖譜結(jié)合色彩圖像技術(shù)的白芍與炒白芍差異研究△

紀(jì)玉華，洪婉敏，干麗，姚曉璇，鐘文峰，黃貴發(fā)，魏梅*

1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；

2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

白芍為毛茛科芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根[1]，全國(guó)各地種植廣泛，產(chǎn)自浙江、安徽、四川、河南、湖南等地，以四川中江、安徽亳州、浙江磐安所產(chǎn)白芍為道地藥材[2]。白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的功效，可用于治療血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈等癥[1]。白芍藥材中含有單萜及其苷類、黃酮及其苷類、三萜類等化學(xué)成分[3]。藥理研究表明，白芍具有保護(hù)心血管、保肝、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等作用[4]。炒白芍為《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版收載的白芍炮制品，白芍經(jīng)炒制后外觀性狀和功效均發(fā)生了顯著變化。古人對(duì)白芍炒制前后的功效變化描述為“生則伐肝，炒則入脾肺”“伐肝生用，止痛炒用”[5]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，白芍炒制前后功能主治發(fā)生的變化可能是多種成分共同作用的結(jié)果，炒制后不同類別化學(xué)成分呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律[5-6]。

《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）僅以芍藥苷含量作為白芍藥材、炒白芍飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)，不能全面反映白芍的質(zhì)量，具有一定局限性。為了體現(xiàn)中藥多成分的特點(diǎn)，確保其內(nèi)在質(zhì)量均一、穩(wěn)定，可以采用中藥特征圖譜技術(shù)對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行整體控制[7]。近年來(lái)，基于色彩圖像分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)中藥顏色客觀量化的研究越來(lái)越多，色度分析已被應(yīng)用于梔子、陳皮、山楂等中藥炮制程度的判別[8-11]，但對(duì)于白芍炮制程度的量化判別未見(jiàn)報(bào)道。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)，以白芍藥材和炒白芍為研究對(duì)象，建立超高效液相色譜法（UPLC）特征圖譜分析方法，結(jié)合Lab 模式色度值讀取，建立更加全面合理的白芍藥材、炒白芍鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[12-13]。

1 材料

1.1 儀器

TS7700 型分光測(cè)色儀（深圳市三恩時(shí)科技有限公司）；Vanquish 型超高效液相色譜儀（賽默飛公司）；ME204E 型萬(wàn)分之一電子分析天平、XP26 型百萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q-Direc 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201605，純度：90.8%）、5-羥甲基糠醛（5-HMF，批號(hào)：111626-201912，純度：99.2%）、兒茶素（批號(hào)：110877-202005，純度：95.1%）、芍藥苷（批號(hào)：110736-202044，純度：96.8%）、苯甲酸（批號(hào)：100419-201703，純度：99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖（批號(hào)：wkq19011402，純度：98.3%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)：wkq18052205，純度：99.2%）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；對(duì)照品苯甲酰芍藥苷（批號(hào)：ST05580220MG，純度：96.4%）購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙腈（德國(guó)Merck公司）、磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）均為色譜純；其他試劑為分析純。

1.3 樣品

經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定，15 批白芍藥材均為毛茛科芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 15批白芍及炒白芍樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 炒白芍的制備

按《中國(guó)藥典》2020 年版白芍【炮制】項(xiàng)下的規(guī)定制備白芍飲片，再按清炒法（通則0213），取白芍飲片于炒鍋內(nèi)，設(shè)置電陶爐加熱功率為800 W，翻炒至表面微黃，用紅外測(cè)溫儀測(cè)定飲片表面溫度，其溫度為114～128 ℃。

2.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脫（0～5 min，3%A；5～10 min，3%～12%A；10～16 min，12%～13%A；16.0～26.5 min，13%～20%A；26.5～30.0 min，20%A；30～36 min，20%～35%A；36～40min，35%～50%A；40.0～40.1min，50%～3%A；40.1～45.0 min，3%A）。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10 min，280 nm；10～45 min，230 nm。柱 溫：30 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：1μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱定對(duì)照品沒(méi)食子酸、5-HMF、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖、苯甲酰芍藥苷適量，加甲醇制成上述8 個(gè)成分質(zhì)量濃度分別為72.69、62.10、33.49、219.32、364.78、79.20、26.16、39.59 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2（炒）白芍供試品溶液的制備 取（炒）白芍中粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（300 W，40 kHz），放冷，稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.4 白芍、炒白芍UPLC特征圖譜的建立

2.4.1精密度試驗(yàn) 取按2.3.2 項(xiàng)下方法制備的炒白芍（CBS1）供試品溶液，按2.2 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，參照峰（S）確定為9 號(hào)色譜峰（芍藥苷），計(jì)算可得各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.13%，相對(duì)峰面積RSD 為0.15%～3.09%，表明儀器精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取按2.3.2 項(xiàng)下方法制備的炒白芍（CBS1）供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按2.2 項(xiàng)下色譜分析方法依次進(jìn)樣，參照峰（S）確定為9 號(hào)色譜峰（芍藥苷），計(jì)算可得各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.02%～0.41%，相對(duì)峰面積RSD為0.21%～3.96%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 獨(dú)立平行取6 份按2.3.2 項(xiàng)下方法制備的炒白芍（CBS1）供試品溶液，按2.2 項(xiàng)下色譜分析方法進(jìn)樣測(cè)定，參照峰（S）確定為9 號(hào)色譜峰（芍藥苷），計(jì)算可得各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.02%～0.28%，相對(duì)峰面積RSD 為0.21%～4.22%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.4白芍、炒白芍UPLC 特征圖譜的建立 取15 批（炒）白芍，按2.3.2 項(xiàng)下方法制樣和2.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以.cdf 格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 年版），確定15 批（炒）白芍UPLC 特征圖譜及其共有色譜峰。通過(guò)15批白芍、炒白芍的UPLC 特征圖譜的疊加，生成白芍、炒白芍的對(duì)照特征圖譜。15 批白芍UPLC 特征圖譜標(biāo)定了15個(gè)共有色譜峰，與之對(duì)應(yīng)的15批炒白芍UPLC 特征圖譜標(biāo)定了17 個(gè)共有色譜峰，經(jīng)對(duì)照品的保留時(shí)間和二極管陣列全波掃描光譜確定，2、3、6、8、9、11、13 和16 號(hào)色譜峰分別為沒(méi)食子酸、5-HMF、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷。由結(jié)果可知，炒白芍特征圖譜的1號(hào)、3號(hào)色譜峰由白芍藥材炮制后產(chǎn)生（圖1）。

圖1 15批白芍及炒白芍的UPLC疊加圖譜及對(duì)照特征圖譜、混合對(duì)照品色譜圖

2.4.5白芍、炒白芍UPLC 特征圖譜的相似度評(píng)價(jià) 經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）分析，15 批白芍、15 批炒白芍樣品的UPLC 特征圖譜相似度分別為0.946～0.999、0.948～0.997，表明15 批白芍、炒白芍特征圖譜相似度較高，炒白芍炮制過(guò)程穩(wěn)定可行。

2.5 白芍、炒白芍UPLC 特征圖譜的主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法?判別分析（OPLS-DA）

PCA 是一種可概括原始指標(biāo)的無(wú)監(jiān)督多元統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理得到幾個(gè)主要信息互不相關(guān)的綜合指標(biāo)，從而獲得樣本間的內(nèi)在聯(lián)系和差異性因素[14]?；赑CA 基礎(chǔ)，進(jìn)一步結(jié)合有監(jiān)督的OPLS-DA，放大樣本間的差異性，獲得其顯著性影響差異因子，應(yīng)用在指紋圖譜的質(zhì)量控制上具有一定優(yōu)勢(shì)[15]。將15 批白芍和15 批炒白芍樣品UPLC 特征圖譜各共有色譜峰峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后導(dǎo)入SIMCA 14.0 軟件，進(jìn)行PCA（色譜峰缺失的峰面積以“0”計(jì)）。PCA 結(jié)果提取4 個(gè)主成分，主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表2。以第1、第2 主成分為變量的二維載荷圖中，第1 主成分變量的權(quán)重前三名依次為15 號(hào)、1 號(hào)、11 號(hào)（苯甲酸）色譜峰，由此判定15 號(hào)、1 號(hào)、11 號(hào)（苯甲酸）色譜峰在區(qū)分白芍生品與炮制品指紋圖譜中占決定性作用。PCA得分圖見(jiàn)圖2，PCA的二維載荷圖見(jiàn)圖3。

圖2 白芍和炒白芍UPLC特征圖譜共有峰峰面積PCA得分圖

圖3 白芍和炒白芍UPLC特征圖譜共有峰峰面積PCA二維載荷圖

表2 白芍、炒白芍前4個(gè)主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率

進(jìn)一步采用OPLS-DA 進(jìn)行分析，在OPLS-DA得分圖中每個(gè)點(diǎn)分別代表1 個(gè)樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離代表各個(gè)樣品之間存在的差異程度。

15批白芍藥材及炒白芍在OPLS-DA模型中分類聚集明顯，且兩者分布在圖中兩個(gè)不同的區(qū)域，表明白芍、炒白芍的UPLC 特征圖譜有明顯差別。其中所建模型對(duì)Y 矩陣的解釋率（R2Y）為1，模型的預(yù)測(cè)能力（Q2）為0.787，表示該模型擬合程度和預(yù)測(cè)能力良好；對(duì)模型中變量重要性投影（VIP）值進(jìn)行分析，選擇VIP 值＞1 的化學(xué)成分作為區(qū)分白芍生品及炒白芍的重要特征峰，依次為峰11（苯甲酸）、峰1、峰15、峰10、峰3（5-HMF）、峰2（沒(méi)食子酸）。OPLS-DA得分圖、VIP值得分圖分別見(jiàn)圖4～5。結(jié)合圖5 也可明顯看出，這些色譜峰變量離原點(diǎn)的距離遠(yuǎn)，提示這些色譜峰是引起白芍炮制前后差異性的主要標(biāo)志性成分。

圖4 白芍和炒白芍UPLC特征圖譜共有峰峰面積OPLS-DA得分圖

圖5 15批白芍及炒白芍UPLC特征圖譜共有峰峰面積的OPLS-DA VIP值得分圖（, n=30）

2.6 白芍、炒白芍色度值讀取

取15 批白芍、15 批炒白芍，破碎，過(guò)四號(hào)篩，取適量壓制于載玻片上，壓制厚度約為1 mm，色差儀設(shè)置光源為D65，采用白板進(jìn)行校正，讀取白芍與炒白芍的粉末色度值（L*、a*、b*），每個(gè)樣品平行讀取3 次，取平均值。白芍、炒白芍粉末圖像見(jiàn)圖6，15批白芍、炒白芍粉末色度值見(jiàn)表3，15批白芍、炒白芍粉末的色差值見(jiàn)表4。

表3 15批白芍及炒白芍粉末色度值

表4 15批白芍及炒白芍粉末色差值

圖6 15批白芍及炒白芍色彩圖像

Lab 色彩模式中L*值表示物體明暗程度，a*、b*值代表不同色彩通道的色度（a通道包括的顏色是從低亮度值的深綠色到灰色再到高亮度值的亮粉紅色，b 通道則是從低亮度值的深藍(lán)色到灰色再到高亮度值的黃色），樣品顏色可用總色值（E*）表達(dá)。

△E*用于表達(dá)生品到炮制品的顏色變化，△E*值越大，代表炮制品與生品色度值相差越大，當(dāng)△E*＞3.5 時(shí)，其色差可被肉眼識(shí)別。由表2 可知，△E*為8～20，表明可明顯識(shí)別同批次炒白芍炮制品與白芍生品。為1～7，為9～21，從b*范圍也能看出，炮制后黃色明顯加深，表明可從b*值來(lái)區(qū)分白芍的生品與炮制品。

3 討論

3.1 供試品提取考察

本研究對(duì)不同提取溶劑進(jìn)行考察，UPLC 特征圖譜結(jié)果顯示，以水與50%甲醇提取時(shí)，13 號(hào)色譜峰（1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖）丟失；以乙醇為溶劑提取時(shí)，沒(méi)食子酸的峰形不佳；以甲醇、稀乙醇為提取溶劑時(shí)，各峰峰形較好，因稀乙醇毒性較低，選取稀乙醇為提取溶劑?；亓魈崛∨c超聲提取2 種提取方式對(duì)特征圖譜的影響較小，因超聲提取較簡(jiǎn)便，選取超聲提取；各共有峰提取率隨著超聲時(shí)間的增加有所增加，30 min后峰面積無(wú)明顯變化，選取超聲30 min。

3.2 色譜條件的考察

沒(méi)食子酸最大吸收波長(zhǎng)為215、275 nm，1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖最大吸收波長(zhǎng)為215、275 nm，兒茶素最大吸收波長(zhǎng)為282 nm，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)為230 nm[12]。5-HMF最大吸收波長(zhǎng)為280 nm[13]。因此，選擇0～10 min時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，10 min 后為230 nm，炒白芍色譜峰豐富且5-HMF 響應(yīng)值較高。本研究比較了0.5%冰乙酸、0.1%甲酸、0.05%磷酸和0.2%磷酸等流動(dòng)相對(duì)白芍、炒白芍UPLC 特征圖譜的影響，結(jié)果表明，流動(dòng)相為0.05%磷酸溶液時(shí)，特征圖譜峰信息較豐富，分離效果和響應(yīng)值最優(yōu)，因此選取流動(dòng)相為0.05%磷酸溶液。考察了柱溫25、30、35 ℃和流速0.20、0.25、0.30 mL·min-1，結(jié)果表明當(dāng)柱溫為30 ℃、流速為0.3 mL·min-1時(shí)，特征圖譜色譜峰分離度高、峰形對(duì)稱，可滿足分析要求。

3.3 炒白芍炒制時(shí)間考察

本研究初步考察了炒制時(shí)間對(duì)炒白芍UPLC 特征圖譜的影響。設(shè)置電陶爐功率為800 W，當(dāng)鍋底溫度達(dá)到140 ℃時(shí)，取白芍飲片置炒鍋內(nèi)，分別炒5、10、15、20、30 min，結(jié)果未檢測(cè)到白芍藥材中有3 號(hào)色譜峰（5-HMF），炒制10 min 后5-HMF 出現(xiàn)，隨著炒制時(shí)間繼續(xù)增加，3 號(hào)（5-HMF）、2 號(hào)（沒(méi)食子酸）、11 號(hào)（苯甲酸）色譜峰峰面積逐漸增加，6 號(hào)（兒茶素）、8 號(hào)（芍藥內(nèi)酯苷）、9 號(hào)（芍藥苷）、16 號(hào)（苯甲酰芍藥苷）色譜峰峰面積逐漸降低，13 號(hào)（1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖）色譜峰峰面積有增有減，無(wú)明顯規(guī)律；炒白芍的顏色也逐漸加深。白芍飲片經(jīng)炒制后產(chǎn)生5-HMF，5-HMF 的產(chǎn)生與溫度、炒制時(shí)間有關(guān)。本研究表明，飲片顏色的變化與成分含量有一定的相關(guān)性，后續(xù)可進(jìn)一步探究。

5-HMF又名5-羥甲基-2-呋喃甲醛，分子中含有1個(gè)呋喃環(huán)，其由葡萄糖或果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水生成，在炮制的高溫高熱過(guò)程中隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)其含量增加。5-HMF 存在藥理活性但含有一定的不良反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，生脈散中的5-HMF 成分可能是益氣生脈的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗氧、保肝、改善血液微循環(huán)等藥理作用[16]。而因5-HMF 有一定的遺傳毒性、生殖毒性、致癌性，《中國(guó)藥典》2020 年版對(duì)葡萄糖注射液、蜂蜜和某些含蜂蜜的制劑中的5-HMF 均進(jìn)行了含量控制。本研究通過(guò)UPLC 特征圖譜結(jié)合色度值，可有效鑒別白芍與炒白芍，為下一步對(duì)5-HMF 限量控制的研究、量化炒白芍炮制程度提供參考。