何首烏提取物大鼠體內(nèi)組織蓄積比較研究△

汪祺，楊建波a，王瑩，李妍怡，2，馬雙成*，張玉杰

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

何首烏是蓼科植物何首烏Polygonum multijiorumThunb.的干燥塊根，主要成分包括蒽醌類（大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等）、二苯乙烯苷類（2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-D-葡萄糖苷）和鞣質(zhì)（沒食子酸、兒茶素等）等[1]。目前對于何首烏致肝毒性的物質(zhì)成分的研究主要集中在蒽醌類（此類研究多認(rèn)為二苯乙烯苷類成分無肝毒性）[2-4]和二苯乙烯苷類（此類研究多認(rèn)為蒽醌類成分無肝毒性）成分[5-6]，另有少量研究則認(rèn)為鞣質(zhì)具有肝毒性[7]。由于大黃、決明子和虎杖等中藥材都含有豐富的蒽醌類成分，卻少見肝毒性報道，何首烏肝毒性成分難以確認(rèn)。目前毒性成分研究存在的另一個問題是，研究主要基于體外細(xì)胞實驗，對于長期給藥后體內(nèi)成分累積和暴露情況缺乏了解。組織中藥物的蓄積是造成該組織毒性的重要前提條件，尤其是在長期給藥的情況下。另外成分間的相互作用也是需要考慮的因素，因而研究藥物化學(xué)成分在體內(nèi)各組織的分布和蓄積對于探索何首烏肝毒性具有重要的意義。

本研究對連續(xù)灌胃42 d 何首烏70%乙醇提物（PME）和水提物（PMW）的大鼠肝、腎、血漿和膽汁樣品中大黃素，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷進(jìn)行了定量分析，考察這些成分在大鼠體內(nèi)的蓄積狀況，旨在進(jìn)一步闡明何首烏可能的肝毒性成分。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC/XEVO TQ-S 型超高效液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（TQ-S 型四級桿質(zhì)譜，美國Waters 公司）；電噴霧電離源（ESI）；MassLynx V4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Sartorius BS 110 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TGL20M 型高速冷凍離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；VORTEX GENIVS 3 型漩渦混勻儀（美國Scientific Industries 公司）；MTN-2800D 型氮氣吹干儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

何首烏飲片（北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號：20160414）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，美國MREDA 公司）；超純水；其他試劑均為分析純。

對照品二苯乙烯苷（批號：110844-202116，純度為94.8%）、大黃素（批號：110756-201512，純度為98.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：B20241，純度≥98%）、1,8-二羥基蒽醌（批號：B21740，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，美國Sigma 公司，純度為99.0%）。

1.3 實驗動物

無特定病原體（SPF）級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠30 只，體質(zhì)量（200±20）g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK-2011-0004。標(biāo)準(zhǔn)動物房中飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，相對濕度55%～60%，光照12 h 時明暗交替，喂以SPF級標(biāo)準(zhǔn)飼料。經(jīng)國家藥物安全評估中心（NCSED）機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會（IACUC）批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為IACUC-2017-K023。

2 方法

2.1 色譜質(zhì)譜條件

AcQuity UPLC ?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm，美國Waters 公司）；流動相為乙腈（A）-5 mmol·L-1乙酸銨（B），pH=7.5，梯度洗脫（0～1 min，80%B；1～6 min，80%～15%B；6～7.5 min，15%B；7.5～8 min，15%～80%B；8～10 min，80%B）；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL；樣品架溫度：10 ℃。

質(zhì)譜條件：負(fù)離子檢測模式；毛細(xì)管電壓：2500 V；錐孔氣流速：50 L·h-1；脫溶劑溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：900 L·h-1；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子掃描模式。

2.2 溶液的制備

2.2.1何首烏提取物的制備 取何首烏藥材5 kg，用10 倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，并濃縮、干燥，得PWE 粉末，得率為20%。取何首烏藥材5 kg，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，并濃縮、干燥得PMW 粉末，得率為25%。精密稱取PMW 和PWE 適量，加0.5%的CMC-Na溶液混懸并定容，制成質(zhì)量濃度為0.6 g·mL-1的PME 混懸液和0.75 g·mL-1的PMW 混懸液（相當(dāng)何首烏生藥質(zhì)量濃度3 g·mL-1），置于4 ℃，備用。

2.2.2對照品溶液的配制 分別精密稱取大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷和1,8-二羥基蒽醌（內(nèi)標(biāo)）對照品適量于10 mL量瓶，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.10 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 大鼠組織供試品的制備

將SD 大鼠隨機(jī)分為PMW 給藥組、PME 給藥組和對照組，每組各10 只。分別給予PMW（劑量：15 g·kg-1、20 mL·kg-1，相當(dāng)于60 g·kg-1生藥量）、PME（劑量：12 g·kg-1、20 mL·kg-1，相當(dāng)于60 g·kg-1生藥量）和同體積0.5%的CMC-Na溶液，連續(xù)給藥42 d。末次給藥后立即腹腔注射25%的烏拉坦0.5 mL麻醉，通過膽管插管接取膽汁1 h，置于離心管中，存于-20℃，待測。然后由腹主動脈取血，置于肝素化的試管中，15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清血漿存于-20 ℃，待測。并脫頸處死大鼠，取肝臟、腎臟，用濾紙吸干表面水分，稱質(zhì)量。

2.3.1血漿和膽汁供試品的制備 分別取大鼠血漿和膽汁樣品100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液40 μL，再加入4倍量甲醇，渦旋振蕩1 min，混勻，以15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取出全部上清液，氮氣吹干。殘渣分別用甲醇400 μL，超聲（250 W，50 kHz）復(fù)溶，以15 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用于分析。

2.3.2肝臟和腎臟供試品的制備 分別取大鼠的肝臟和腎臟樣品各0.5 g，剪碎，加入約2倍量0.9%氯化鈉勻漿，以15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取出上清勻漿液400 μL。加入內(nèi)標(biāo)溶液40 μL，再加入4 倍量甲醇，渦旋振蕩1 min，混勻，以15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液，氮氣吹干。殘渣分別用甲醇400 μL，超聲（250 W，50 kHz）復(fù)溶，以15 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性試驗 按2.3 項下方法分別制備對照組及給藥組供試品（肝、腎、血漿和膽汁），采用2.1 項下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行分析測定，混合對照品溶液直接進(jìn)樣分析。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 混合對照品溶液用甲醇稀釋至不同質(zhì)量濃度，氮氣吹干后用1 mL 不同組織樣品復(fù)溶，制備不同質(zhì)量濃度的對照品組織樣品溶液，按2.1 項下色譜質(zhì)譜條件通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）分析測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對照品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運算，分別建立對照品的線性回歸方程。

2.4.3精密度試驗 取混合對照品溶液用甲醇稀釋成低、中、高3 個質(zhì)量濃度，氮氣吹干后，再用肝臟組織樣品復(fù)溶，采用2.1 項下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行分析測定。同天內(nèi)對各質(zhì)量濃度的肝臟樣品（每個質(zhì)量濃度5 批）進(jìn)行測定，連續(xù)測定3 d，計算批間RSD。對照組腎臟、血漿和膽汁樣品同上操作。

2.4.4加樣回收率試驗 取組織樣品（肝臟、腎臟、膽汁和血漿）3 份，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，配置成含對照品組織樣品，按2.3項下處理條件處理后，采用2.1項下色譜質(zhì)譜方法分析測定，記錄色譜峰面積，每個質(zhì)量濃度平行操作5次。根據(jù)上述2.4.2項下標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算待測物質(zhì)量濃度，并以加入量之比計算加樣回收率。

2.4.5穩(wěn)定性試驗 精密吸取混合對照品溶液，用甲醇稀釋成低、中、高3 個質(zhì)量濃度（每個質(zhì)量濃度5 份），分別加入離心管中，氮氣吹干后分別用組織樣品（肝、腎、膽汁、血漿）復(fù)溶，按照2.3 項下的方法處理，分別考察室溫下穩(wěn)定性，凍融穩(wěn)定性和長期凍存穩(wěn)定性。具體方法：1）室溫（25 ℃）放置24 h后進(jìn)樣，考察室溫下放置穩(wěn)定性；2）置于-20 ℃冰箱中冷凍，取出室溫下解凍，反復(fù)凍融3次，最后一次室溫解凍后進(jìn)樣，考察凍融穩(wěn)定性；3）放置-20 ℃冰箱冷凍30 d，室溫解凍后進(jìn)樣，考察長期凍存穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1專屬性 對照品質(zhì)譜信息見表1。按2.1 項下色譜質(zhì)譜條件測定，大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷和1,8-二羥基蒽醌的峰形良好、分離完全、無雜質(zhì)峰干擾，說明對照組樣品對測定無干擾，專屬性強(qiáng)，見圖1。

圖1 大鼠各組織樣品的總離子流圖

表1 對照品和內(nèi)標(biāo)的MRM參數(shù)、錐孔電壓和碰撞能量

3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 3個成分在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，信噪比（S/N）=10為定量限（表2）。

表2 大鼠組織中二苯乙烯、大黃素及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的回歸方程、線性范圍和定量限

3.1.3精密度試驗 3 個質(zhì)量濃度的大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及二苯乙烯苷，在各個含藥組織中日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于15%，符合試驗要求。

3.1.4加樣回收率試驗 3 個質(zhì)量濃度的大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷及二苯乙烯苷，在各個含藥組織中的回收率見表3，均符合試驗要求。

表3 大鼠組織中二苯乙烯、大黃素及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的加樣回收率

3.1.5穩(wěn)定性試驗 大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、二苯乙烯苷的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和長期凍存穩(wěn)定性試驗的RSD均小于15%，說明穩(wěn)定性良好。

3.2 PME和PMW在大鼠體內(nèi)分布比較

經(jīng)過42 d 灌胃PME 和PMW 后，大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷在大鼠肝、腎、血漿和膽汁中的含量見表4。

表4 大鼠組織中大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=10）

表4 大鼠組織中大黃素、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和二苯乙烯苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=10）

注：與PME組各成分含量相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

分析PMW 與PME 組給藥后，化學(xué)成分在大鼠體內(nèi)不同組織的分布情況見圖2。兩給藥組中3個主要成分選擇性蓄積的靶器官基本相同。二苯乙烯苷主要蓄積在肝臟中，大黃素主要蓄積在腎臟中，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷主要蓄積在膽汁中，而血漿中3 個成分的含量均較低。進(jìn)一步分析化學(xué)成分在各個組織中的蓄積差異見圖3，肝臟、腎臟中二苯乙烯苷蓄積量PME組遠(yuǎn)高于PMW 組，大黃素次之，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷差異較小。血漿和膽汁中蓄積成分以二苯乙烯苷和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為主，同樣為PME組高于PMW 組。以上結(jié)果提示，大鼠口服PME 與PMW 后，PME 組大鼠體內(nèi)成分蓄積更顯著。

圖2 PME和PMW組給藥后化學(xué)成分在大鼠各組織中分布對比

圖3 PME和PMW組給藥后3個成分在大鼠不同組織中的蓄積對比

4 討論

本研究首先建立了大鼠體內(nèi)肝、腎、血漿、膽汁組織中二苯乙烯苷、大黃素及大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的定量測定方法。此外，在連續(xù)灌胃42 d PME和PMW后，對3個成分在不同組織中的含量進(jìn)行了定量分析，考察其在大鼠體內(nèi)的蓄積狀況，以期通過蓄積成分發(fā)現(xiàn)何首烏引發(fā)不良反應(yīng)的原因。

本研究對何首烏藥材分別采用不同提取工藝制備成PME 和PMW 后給予大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PME 給藥組大鼠體內(nèi)不同組織中相同成分蓄積量明顯高于PMW組。此外，2個給藥組3個成分均存在明顯的組織選擇性，且趨勢相同。二苯乙烯苷主要蓄積在肝臟中，大黃素主要蓄積在腎臟中，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷主要蓄積在膽汁中，而血漿中3個成分的含量均較低，提示不同類成分對組織有明顯的選擇性蓄積。有研究表明PME 的肝毒性高于PMW，推測這可能與PME 給藥后體內(nèi)蓄積成分含量高相關(guān)[8-10]。研究中還發(fā)現(xiàn)，無論是PME還是PMW給藥組，二苯乙烯苷均大量蓄積于大鼠肝臟中，以往文獻(xiàn)表明，該成分直接毒性作用較小[2-4]，因此該成分是否通過藥物相互作用等其他作用機(jī)制產(chǎn)生毒性值得進(jìn)一步研究。由于何首烏引發(fā)肝損傷的主要表現(xiàn)為膽汁淤積，而大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷主要蓄積在膽汁中，因此推測其為潛在毒性成分。此外，有文獻(xiàn)表明，何首烏中的蒽醌類成分為其主要肝毒性成分[11-14]，但筆者發(fā)現(xiàn)大黃素主要蓄積部位為腎臟，因此其與肝毒性是否直接相關(guān)也值得探討。