礦物藥青礞石對戊四氮點燃癲癇大鼠血清中IL-1β和IL-2等細胞因子水平的影響△

袁鵬，馬瑜璐，劉圣金*，房方，楊文國，卞勇，徐晨昱，王迎，吳思澄，張志杰，奧·烏力吉

1.南京中醫(yī)藥大學 藥學院/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室，江蘇 南京 210023；

2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；

3.內(nèi)蒙古民族大學，內(nèi)蒙古 通遼 028000

癲癇（epilepsy，EP）是一種以反復性、持久性、具有致癇傾向為特征的慢性腦部疾病，是由腦部神經(jīng)元過度放電引起的功能障礙疾病[1]。早期針對癲癇發(fā)病的機制研究主要集中在氧化應激、神經(jīng)遞質(zhì)水平改變、細胞凋亡等。近年來，越來越多研究證實炎癥反應與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。炎癥因子能夠影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成釋放、神經(jīng)元間電傳遞等，異常升高的炎癥因子能夠破壞海馬結(jié)構(gòu)、誘導細胞凋亡、破壞血腦屏障完整性[3]，此外還能觸發(fā)自由基的形成和誘導谷氨酰胺神經(jīng)傳遞的改變，導致神經(jīng)元興奮性的增加，引起神經(jīng)元異常放電，從而促進癲癇的發(fā)生或加劇癲癇癥狀[4]。長期的炎癥因子失衡還可能造成持續(xù)性的神經(jīng)損傷，不利于大腦功能的正常發(fā)揮，從而導致多種神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，青礞石混懸液能夠顯著降低大鼠海馬區(qū)病變程度，且檢測到腦組織皮層與海馬中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、天冬氨酸含量顯著降低，青礞石對于癲癇有較好的治療效果[5-6]。本研究在前期藥效學研究的基礎上，利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）研究礦物藥青礞石（Chloriti Lapis）對戊四氮（PTZ）點燃慢性癲癇大鼠血清中炎癥細胞因子表達水平的干預情況，探討青礞石可能通過影響免疫反應參與治療慢性癲癇的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠55 只，體質(zhì)量180～220 g，購于浙江省醫(yī)學科學院，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2019-0002。大鼠于適宜條件下適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食飲水，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，12 h晝夜交替，室溫20～24 ℃，相對濕度50%左右。動物實驗通過南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準，批準文號為20190A029。

1.2 試藥

青礞石藥材由亳州礦石專營店提供（批號：20140412），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室吳德康教授鑒定為中藥材青礞石（Chloriti Lapis），經(jīng)南京大學地球科學與工程學院孔慶友教授鑒定為變質(zhì)巖類黑云母片巖（Biotite Schist），樣品留存于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室；卡馬西平片（批號：X1395，北京諾華制藥有限公司）；PTZ（批號：1002905179，美國Sigma 公司）；白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司）；IL-2、超敏C 反應蛋白（hs-CRP）、γ-干擾素（IFN-γ）、高遷移率族蛋白B-1（HMGB-1）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG 400，化學純，批號：20170515，上海凌峰化學試劑有限公司）。

1.3 儀器

Infinite M200 PRO NANOQUANT型酶標儀（瑞士Tecan 公司）；TDL-240B 型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

2 方法

2.1 模型制備

采用PTZ點燃法制備癲癇大鼠模型[5-7]，用0.9%氯化鈉溶液將PTZ配成質(zhì)量濃度為0.01 g·mL-1的溶液，每日固定時間以腹腔注射方式（35 mg·kg-1）造模。持續(xù)給藥4周后，停1周，再以同劑量PTZ給藥，參照Racine 分級標準，包括有無驚厥、面部陣攣、節(jié)律性點頭、前肢陣攣及跌倒等特征，以大鼠連續(xù)表現(xiàn)5 次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥反應為達到點燃標準。Ⅰ級標準：面部陣攣；Ⅱ級標準：面部陣攣并伴節(jié)律性點頭；Ⅲ級標準：面部陣攣、伴節(jié)律性點頭及前肢陣攣；Ⅳ級標準：面部陣攣、伴節(jié)律性點頭、前肢陣攣及后肢站立；Ⅴ級標準：面部陣攣、伴節(jié)律性點頭、前肢陣攣、后肢站立并跌倒。大鼠若出現(xiàn)持續(xù)Ⅴ級無明顯間歇的癲癇發(fā)作狀態(tài)，給予7%的水合氯醛1 mL緩解發(fā)作。

2.2 樣品的制備

卡馬西平片溶于0.9%氯化鈉溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.02 g·mL-1的卡馬西平溶液。青礞石藥材去除石英等雜質(zhì)，置瑪瑙研缽中研磨成細粉，過六號篩，用PEG400為介質(zhì)配成含青礞石細粉0.5 g·mL-1的混懸液，每次給藥前超聲混勻。

2.3 分組與給藥

實驗動物共分為5 組。0.9%氯化鈉溶液處理的大鼠作為對照組，10 只；造模成功的大鼠共32 只，隨機均分為4組，每組8只，分別為模型組、陽性對照卡馬西平組、青礞石高劑量組、青礞石低劑量組。對照組和模型組大鼠給予5 mL·kg-10.9%氯化鈉溶液灌胃；卡馬西平組大鼠按100 mg·kg-1（5 mL·kg-1）劑量灌胃給藥；按青礞石臨床用量的20、5 倍（臨床等效劑量）設計給藥高、低劑量，分別為2000、500 mg·kg-1（4、1 mL·kg-1），灌胃給藥。每天固定時間給藥1 次，持續(xù)給藥4 周。每周稱量體質(zhì)量2 次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整劑量。

2.4 血清中細胞因子檢測

末次給藥后次日，異氟烷吸入麻醉后處死各組大鼠，腹主動脈取血5 mL，室溫放置1 h，3000 r·min-1離心15 min（離心半徑16 cm）取上清，分裝待測。采用ELISA 試劑盒測定血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.5 數(shù)據(jù)處理及分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

各組大鼠體質(zhì)量隨時間增加，增速相似，無明顯差異。大鼠造模1周左右毛色逐漸發(fā)黃，第2周開始出現(xiàn)Ⅱ級驚厥反應，造模第4 周，大鼠出現(xiàn)Ⅱ級及以上驚厥反應；造模測試中，大鼠多出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥反應，達到PTZ 點燃癲癇大鼠模型標準，造模成功率70.0%以上。

3.2 血清中IL-1β、IL-2等細胞因子表達水平

各組間不同細胞因子表達水平見表1。單因素方差分析結(jié)果可知，IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP表達水平在各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中炎癥因子表達水平（）

表1 各組大鼠血清中炎癥因子表達水平（）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與卡馬西組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

進一步進行事后多重比較分析（Post-hoc test），見表1。與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、hs-CRP 含量均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，給予卡馬西平和高、低劑量青礞石混懸液后，大鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 水平呈顯著降低趨勢，除卡馬西平組IL-2、IFN-γ、HMGB-1 外，其他組各細胞因子差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與卡馬西平組比較，青礞石高、低劑量組大鼠血清中HMGB-1 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；青礞石低劑量組大鼠血清中TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）。3 個給藥處理組間IL-1β、IL-2、IL-6、hs-CRP 水平變化差異無統(tǒng)計學意義。

3.3 細胞因子間相關性分析

細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 之間相關性分析見表2，可以看見各細胞因子之間呈正相關，IL-1β與IL-2、IL-6、TNF-α、hs-CRP呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），IL-2與IL-6呈顯著正相關（P＜0.05），IL-6與TNF-α、hs-CRP 呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α與hs-CRP呈顯著正相關（P＜0.01），IFN-γ與HMGB-1呈顯著正相關（P＜0.05）。

表2 血清中細胞因子相關性分析

3.4 炎癥細胞因子與結(jié)腸中特定腸道菌群相關性分析

本課題組前期對青礞石干預PTZ 點燃癲癇大鼠結(jié)腸腸道微生物進行研究[8]，發(fā)現(xiàn)各組大鼠的優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其中厚壁菌門占比最大，其次是擬桿菌門。青礞石干預后疣微菌門、變形菌門、Akkermansia菌屬豐度下降，乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度升高。結(jié)果表明，青礞石對PTZ 點燃癲癇大鼠腸道菌群物種組成的豐富度具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可有效干預腸道微生態(tài)的重建。結(jié)合該研究，將血清中炎癥等細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 含量與大鼠結(jié)腸中特定菌群厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、變形菌門、乳桿菌屬、Akkermansia菌屬豐度間進行相關性分析，結(jié)果見表3。其中疣微菌門豐度與炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP 含量呈顯著正相關（P＜0.05）；Akkermansia菌屬豐度與IL-6、TNF-α、hs-CRP 含量也呈顯著正相關（P＜0.05）。進一步證實了青礞石通過干預細胞因子（IL-6、TNF-α、hs-CRP）、Akkermansia菌屬對PTZ點燃癲癇大鼠產(chǎn)生治療作用。

表3 血清中各細胞因子含量與結(jié)腸中特定菌群豐度相關性分析

4 討論

健康狀態(tài)下的炎癥反應能激活神經(jīng)保護及修復其所需的激活通路，但當炎癥因子過度表達時，會對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴重且持續(xù)的損傷，引發(fā)包括癲癇在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9]。大量研究證明，炎癥反應參與癲癇的發(fā)生發(fā)展，炎癥因子能夠破壞海馬結(jié)構(gòu)，誘導癲癇的發(fā)生[4]。Zhou 等[10]利用天麻素聯(lián)合葉酸、維生素B12治療腦卒中后癲癇患者，檢測其治療前后血清中HMGB-1、IL-2、IL-6 水平。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥治療后，患者血清中HMGB-1、IL-2、IL-6 水平顯著下降，其中與癲癇關系密切的IL-6 減少趨勢最明顯，表明癲癇會引起相關炎癥反應，天麻素聯(lián)合用藥能一定程度上通過抑制炎癥反應來緩解癲癇發(fā)生發(fā)展。江衛(wèi)[11]給予PTZ 點燃癲癇大鼠腹腔注射生理濃度內(nèi)的硫氫化鈉溶液，利用熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和蛋白印跡法（Western blotting）檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）/p65 的mRNA和蛋白相對表達量，結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB/p65 的mRNA 和蛋白相對表達量顯著降低，表明適度增加硫化氫濃度可以通過抑制NF-κB信號通路的激活來降低炎癥反應，發(fā)揮治療癲癇的作用。

本實驗中，PTZ 點燃的癲癇模型大鼠血清中各炎癥細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 表達水平顯著升高，在給予陽性藥卡馬西平和不同劑量青礞石后，這些因子水平顯著降低，其中青礞石高劑量效果一定程度上優(yōu)于低劑量。表明礦物藥青礞石可能影響癲癇發(fā)生時的炎癥反應，通過免疫途徑作用于大腦，緩解癲癇的發(fā)生發(fā)展。

在癲癇相關的炎癥反應中，發(fā)揮主要作用的是各類細胞因子，如IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 等[12]。IL-1β是IL-1 家族中的一員，IL-1 家族成員是先天免疫和炎癥的中樞介質(zhì)，具有多種局部和全身效應的多效細胞因子，在多發(fā)性炎癥疾病中起關鍵作用[13]。IL-1β是一類促炎因子，其異常高表達表明機體發(fā)生了嚴重的炎癥反應，持續(xù)過度表達的IL-1β會造成更嚴重的神經(jīng)損傷。此外，Roseti 等[14]發(fā)現(xiàn)高濃度的IL-1β顯著降低了顳葉癲癇患者海馬和皮質(zhì)中的γ-氨基丁酸（GABA）電流振幅，通過減少GABA 介導的神經(jīng)傳導促進癲癇發(fā)作。IL-6 主要由膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，在炎性反應中具有雙向調(diào)節(jié)性。研究表明，低劑量的IL-6 能夠有效保護神經(jīng)免受損傷，但當IL-6 長期過度暴露后會引起膠質(zhì)細胞增生，產(chǎn)生神經(jīng)毒性反而加重癲癇的發(fā)生[15]。TNF-α同IL-6 一樣針對炎性反應具有雙向調(diào)節(jié)作用，正常生理狀態(tài)下，TNF-α參與保護神經(jīng)細胞，當其含量劇烈升高時，通過TNF受體1（TNFR1）受體通路產(chǎn)生神經(jīng)毒性，促進癲癇發(fā)生[16]。此外，癲癇發(fā)作會破壞血腦屏障完整性，從而使TNF-α入侵大腦，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，加劇癲癇的發(fā)生發(fā)展[16]。研究顯示，IL-2 可以通過調(diào)節(jié)淋巴細胞平衡來達到縮短癲癇潛伏期的作用，從而影響癲癇的發(fā)作[17]。HMGB-1 是腦內(nèi)重要的促炎因子，在與癲癇相關的炎癥反應中處于關鍵位置。HMGB-1 本身會在神經(jīng)元受損后調(diào)節(jié)IL-2、IL-6、IFN-γ等炎癥因子的釋放，此外，HMGB-1 還能與腦缺血后晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合激活NF-κB 信號通路，調(diào)節(jié)IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的釋放；與TLR4 結(jié)合激活星形膠質(zhì)細胞；與IL-1β結(jié)合形成復合物加劇炎癥反應。HMGB-1 通過上述多種方式誘發(fā)炎癥反應，參與癲癇的發(fā)生發(fā)展過程[18]。hs-CRP 是由于炎癥反應刺激產(chǎn)生的急性蛋白，在臨床中也常用作檢測炎癥發(fā)生的標志物。張敏等[19]通過檢測115 例癲癇患者腦電圖放電情況和血hs-CRP 含量，發(fā)現(xiàn)具癲癇樣放電患者體內(nèi)hs-CRP 含量更高，說明癲癇發(fā)生可能與炎癥的發(fā)生具有相關性，為hs-CRP 臨床用于驗證癲癇發(fā)作后腦損傷程度提供了一定依據(jù)。研究顯示，這些炎癥相關細胞因子常協(xié)同參與癲癇發(fā)生發(fā)展過程。HMGB-1 與IL-2、IL-6 表達水平呈正相關，HMGB-1 的釋放促進分泌IL-2、IL-6，IL-2、IL-6 的增加又會促進釋放HMGB-1[20]；TNF-α也能促進IL-2、IL-6 等炎癥因子的釋放，這些炎癥因子的級聯(lián)作用會加劇炎癥反應，提高神經(jīng)元興奮性，誘導并且加重癲癇發(fā)生[21]。本實驗中對于炎癥等細胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、HMGB-1、hs-CRP 間進行了相關性分析，結(jié)果顯示各因子間呈正相關，也反映了各因子間可相互協(xié)同，促進癲癇的發(fā)生發(fā)展。

“腦-腸軸”學說提出，腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)實現(xiàn)雙向交流的其中一條途徑是免疫途徑[22]。腸道菌群在生命初期就會刺激先天免疫，塑造初期免疫系統(tǒng)，促進相關淋巴系統(tǒng)的成熟[23]。無菌小鼠表現(xiàn)為先天免疫系統(tǒng)缺失，易于觸發(fā)焦慮、抑郁等神經(jīng)精神疾病，當接收來自健康小鼠的糞便移植后，這些癥狀會得到一定程度的緩解[24]。腸道菌群能夠活化T 細胞分化造成局部炎癥反應或識別自身抗原，抑制調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）表達，從而影響外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[25]。Toll樣受體（TLR）會與腸道菌群表面相關受體結(jié)合，血腦屏障受損后TLR4 能夠穿過血腦屏障進入大腦引起炎癥反應[26]。腸道菌群及其代謝物質(zhì)如脂多糖、短鏈脂肪酸也會參與免疫反應的發(fā)生，促進促炎因子的產(chǎn)生，或直接刺激迷走神經(jīng)，或通過血腦屏障直接影響大腦[27]。Dou等[28]給予膠原誘導關節(jié)炎（CIA）大鼠口服姜黃素2周，結(jié)果可見CIA 大鼠腸道、大腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體表達顯著增加，迷走神經(jīng)元興奮性顯著提高，但切斷迷走神經(jīng)后姜黃素的恢復作用消失，表明姜黃素具有調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)的功能，通過“腦-腸軸”減弱CIA 發(fā)生。本研究中，結(jié)腸中特定菌群與炎癥因子相關性結(jié)果顯示腸道菌群與細胞因子間存在一定相關性，表明一些特定腸道菌群可能通過影響炎癥因子表達水平，參與炎癥反應的發(fā)生，從而實現(xiàn)對癲癇發(fā)生發(fā)展的干預。

雖然大量研究均顯示癲癇的發(fā)生與炎癥反應有關，本實驗中對于治療癲癇有明確作用的青礞石也能顯著降低炎癥因子表達水平，但關于癲癇與炎癥免疫之間的具體作用機制仍需要更深入的研究。本研究為從減輕炎癥反應緩解癲癇發(fā)生發(fā)展角度治療癲癇提供基礎理論依據(jù)。