不同產(chǎn)地柴胡的皂苷含量和ITS序列比較△

周蕾，為盼盼，韓文靜，萬河妨，江偉，駱驕陽*，隋春*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；

2.尚藥堂大健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，天津 301600

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效，用于感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等癥[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，柴胡具有抗抑郁、抗炎、鎮(zhèn)痛、護(hù)肝、抗腫瘤等藥理作用[3]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定柴胡藥材為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”[2]。柴胡作為常用大宗中藥材之一，資源分布較為廣泛，主要源于栽培，主產(chǎn)于山西、河北、甘肅、四川等地[4]，形成了各產(chǎn)地特色栽培種質(zhì)。

不同產(chǎn)地柴胡藥材的有效成分含量差異較大[5]。有研究表明，不同產(chǎn)地柴胡中皂苷含量最大相差10倍[6]；柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.32%～13.9%[7]。柴胡的基原鑒定一直存在爭(zhēng)議，普遍認(rèn)為山西、河北、河南和陜西主產(chǎn)北柴胡，黑龍江主產(chǎn)南柴胡，四川主要是引種北柴胡、三島柴胡及當(dāng)?shù)氐闹袢~柴胡，甘肅除了種植北柴胡外還種植銀州柴胡[7]，同一地區(qū)也可能存在不同種的柴胡。基于柴胡種植范圍廣、地域環(huán)境和栽培種質(zhì)差異大，本研究收集了山西、甘肅、四川地區(qū)的柴胡藥材，測(cè)定了其皂苷含量及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，結(jié)合兩方面的數(shù)據(jù)，為分析地域因素和栽培種質(zhì)對(duì)柴胡品質(zhì)的影響、柴胡資源的收集評(píng)價(jià)和新品種選育提供借鑒。

1 材料

1.1 藥材

28 份不同產(chǎn)地的柴胡藥材，樣品編號(hào)和來源見表1，典型藥材橫切面圖見圖1。樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所隋春研究員鑒定，9號(hào)為傘形科柴胡屬纖細(xì)柴胡Bupleurum gracillimumKlotzsch，1、11、12、16號(hào)為北柴胡B.chinenseDC.，2、19、21、24號(hào)為狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.，5～8、10、14、15、25 號(hào)為竹葉柴胡B.marginatumWall.ex DC.，其余為太白柴胡B.dielsianumWolff。其中山西省18批（7批類似a形態(tài)、5批類似e形態(tài)、2批類似f形態(tài)、4批類似g形態(tài)）、甘肅省5批（3批類似b形態(tài)、1 批類似h 形態(tài)、1 批類似a 形態(tài)）、四川省5 批（3 批類似d 形態(tài)、2 批類似c 形態(tài)）。不同產(chǎn)地的柴胡在橫截面形態(tài)上有一定差異，主要表現(xiàn)在邊緣是否平坦、斷面是否顯纖維性、中間髓大小、內(nèi)皮層顏色、放射狀紋理排列方式等。

表1 柴胡藥材來源信息

圖1 典型柴胡藥材橫切面比較

從NCBI 中下載的ITS 序列為S1（北柴胡，GeneBank 登錄號(hào)：KR902794.1）、S2（狹葉柴胡，GeneBank 登錄號(hào)：MH712650.1）、S3（銀州柴胡，GeneBank 登錄號(hào)：HQ687967.1）、S4（竹葉柴胡，GeneBank 登錄號(hào)：KR133183.1）、S5（纖細(xì)柴胡，GeneBank 登錄號(hào)：LC489178.1）、S6（太白柴胡，GeneBank 登錄號(hào)：EU220932.1）、S7（大葉柴胡，GeneBank登錄號(hào)：HQ377215.1）。

1.2 儀器與試藥

1525 型高效液相分析系統(tǒng)、2487 型雙波長吸光度檢測(cè)器（美國Waters 公司）；Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent 公司）；041BK9248 型電泳儀、PTC-200 型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、721BR16894 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；QL-901 型渦旋混合器（其林貝爾儀器制造公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德來生物科技有限公司）；對(duì)照品柴胡皂苷a（批號(hào)：CHB-C-014）、柴胡皂苷c（批號(hào)：CHB-C-017）、柴胡皂苷d（批號(hào)：CHB-C-018）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司，純度≥98%；甲醇（分析純，北京化工廠）；濃氨水（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；乙腈[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

2 方法

2.1 柴胡皂苷含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液制備 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mg·mL-1的各對(duì)照品的儲(chǔ)備液。測(cè)試前，儲(chǔ)備液加甲醇稀釋成系列工作液濃度。

2.1.2供試品溶液制備 取柴胡樣品粉碎，過四號(hào)篩，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞后于30 ℃水溫中超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，濾過后用甲醇20 mL 分2 次洗滌容器及藥渣，合并洗液與濾液，回收溶劑至干。殘?jiān)屑尤爰状既芙?，移? mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3色譜條件 采用高效液相色譜法（HPLC），具體操作流程參照《中國藥典》2020 年版項(xiàng)下規(guī)定[2]，色譜柱：Agilent Extend-C18色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～50 min，25%～90%A；50～55 min，90%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長：210 nm。

2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

參照提取試劑盒使用說明提取基因組DNA。ITS 的PCR擴(kuò)增采用通用引物5F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′和4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體積為25μL，體系內(nèi)含PrimeSTAR HS（Premix）12.5μL、RNasefree Water 9.5μL、引物各0.5μL（10μmol·L-1）、模板DNA 2μL。擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s；52.5 ℃引物與模板結(jié)合30 s；72 ℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。使用CodonCode Aligner 5.12軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行拼接校對(duì)，即得用于比較分析的ITS 序列。每個(gè)地區(qū)樣品隨機(jī)選擇3個(gè)單根，但由于前期實(shí)驗(yàn)損耗，共有62 個(gè)單根用于ITS 序列對(duì)比測(cè)定。采用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，置信度用bootstrap method檢驗(yàn)，1000次循環(huán)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地柴胡藥材的柴胡皂苷含量

柴胡皂苷為柴胡藥材中的主要藥效成分，其中，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量較高，《中國藥典》2020年版對(duì)柴胡藥材品質(zhì)要求為其柴胡皂苷a、柴胡皂苷d總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于0.30%。另外，柴胡皂苷c也是柴胡中含量較高的皂苷單體。測(cè)定了不同產(chǎn)地柴胡中3個(gè)皂苷單體含量，典型色譜圖見圖2，結(jié)果見表2（樣品10、15未進(jìn)行含量測(cè)定）。柴胡皂苷a、柴胡皂苷d總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.063%～3.873%，高于《中國藥典》2020年版規(guī)定的有25份，僅1份未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。柴胡皂苷c質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%～0.292%，其中，樣品9（甘肅）的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和柴胡皂苷c質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最高。樣品2（四川）的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和柴胡皂苷c 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最低，3 個(gè)皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)與樣品9 相差35.3 倍。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%～0.200%，柴胡皂苷c 與柴胡皂苷a+柴胡皂苷d 含量關(guān)系式為Y=0.800 2X+0.736 5（r=0.138 9），無明顯相關(guān)性（圖3）。

表2 柴胡樣品中3個(gè)柴胡皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ ± s,n=3）

表2 柴胡樣品中3個(gè)柴胡皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ ± s,n=3）

圖2 柴胡樣品及柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d對(duì)照品HPLC圖

圖3 柴胡皂苷c質(zhì)量分?jǐn)?shù)與柴胡皂苷a、柴胡皂苷d總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性變化趨勢(shì)（n=25）

3.2 不同產(chǎn)地柴胡藥材的ITS序列分析

依據(jù)NCBI 中下載的柴胡的序列與測(cè)定藥材ITS序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4），可將柴胡樣品分為三類。S7（大葉柴胡）單獨(dú)聚為一類（Ⅰ），與其他柴胡序列差異明顯。樣品9（甘肅）與S5（纖細(xì)柴胡）單獨(dú)聚為一類（Ⅱ），與其他柴胡ITS 序列差異較大，推測(cè)該樣品與纖細(xì)柴胡相似度更高。其余聚為一大類（Ⅲ），其中，樣品2、19 的2 個(gè)單根和樣品21、24 的各1 個(gè)單根的ITS 序列相近，與S2（狹葉柴胡）聚為一類（a），推測(cè)該類內(nèi)的樣品與狹葉柴胡更為接近；Ⅲ類中的其他序列聚為一類（b），b 類內(nèi)樣品又可細(xì)分為3 小類。樣品13、17、26、27 的3 個(gè)單根，樣品3、18、28 的2 個(gè)單根，樣品4、20、22、23、25 的1 個(gè)單根和S6（太白柴胡）聚為一小類（i），推測(cè)該類內(nèi)的樣品與太白柴胡相似度更高，主產(chǎn)于山西、四川，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.682%～1.369%。樣品1、11的3個(gè)單根、樣品12、16的2個(gè)單根和樣品24的1個(gè)單根，S1（北柴胡），S3（銀州柴胡）聚為一小類（ii），其中樣品12的2個(gè)單根與樣品11的3號(hào)單根與S3（銀州柴胡）聚在一起，推測(cè)這3 個(gè)樣品相似度與銀州柴胡更為接近，其余樣品與S1（北柴胡）更為相似。聚為ii 中的柴胡主產(chǎn)于山西，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.627%～1.145%。樣品6、7、15的3個(gè)單根，樣品5、8、25的2 個(gè)單根，樣品10、14、19 的1 個(gè)單根和S4（竹葉柴胡）聚為一小類（iii），推測(cè)該類內(nèi)的樣品與竹葉柴胡的相似度更高，主產(chǎn)于山西、甘肅，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.663%～1.408%。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建不同產(chǎn)地的柴胡樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹

其中，來自甘肅的樣品有5～8（iii）和9（Ⅰ）；來自四川的樣品有2、21（Ⅱ），20、27（i）和1（ii）；來自山西的樣品有19、24（Ⅱ），3、4、13、17、18、22、23、25、26、28（i），11、12、16（ii）和14（iii）?？梢钥闯鰪耐坏貐^(qū)收集得到的柴胡處于ITS 的不同類中，可能由于種間差異所導(dǎo)致。另外也存在同一批樣品中測(cè)定的不同單根的ITS 序列差別較大，分屬不同類，可能由于種內(nèi)變異、不同栽培種質(zhì)的混合種植群體等因素導(dǎo)致。因此，存在3 種不同的分類，推測(cè)原因可能是種內(nèi)變異、種間差異。

4 討論

藥效成分含量是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，藥效成分的形成又是植物自身遺傳基因和外在環(huán)境共同作用的結(jié)果。柴胡自然分布較廣，栽培柴胡的地區(qū)也很廣泛，形成了多種栽培種質(zhì)。本研究測(cè)定了3 個(gè)省28 份柴胡藥材的柴胡皂苷含量和ITS 序列，進(jìn)行了比較分析。柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.063%～3.873%。以往研究報(bào)道，陜西、河南、河北、甘肅和內(nèi)蒙古等地的柴胡，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.39%～2.11%，最高的是甘肅柴胡，為2.11%[8]，與本研究中甘肅柴胡皂苷含量最高的結(jié)果一致。不同研究測(cè)定的材料來源有區(qū)別，得出的含量最高的地區(qū)也不同，但都可以得出同樣的結(jié)論，不同產(chǎn)區(qū)柴胡藥材的柴胡皂苷含量差異較大。ITS 序列比較結(jié)果顯示，存在與大多柴胡藥材序列差異較大的樣品，尤其是來源于甘肅的樣品9，皂苷含量最高，由于實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是藥材的ITS，沒有植株性狀參數(shù)作為鑒定依據(jù)，還不能確定是不是與其他大多柴胡藥材的植物基原分屬于不同的植物種。

柴胡藥理研究表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f 可共同作用于14個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過磷脂腺肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、Ras 等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗抑郁、抗腫瘤的作用[9]。柴胡皂苷c 能夠刺激白細(xì)胞介素-6，抑制乙型肝炎病毒（HBV）合成前基因組RNA（pgRNA）的合成，具抗乙肝病毒的作用[10]。有學(xué)者測(cè)定了柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f 的含量，數(shù)據(jù)顯示柴胡皂苷c、柴胡皂苷f 質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的11.46%、43.18%[8]，且柴胡皂苷c、柴胡皂苷f 與柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)無線性關(guān)系[6]，建議將柴胡皂苷c 和柴胡皂苷f 列入標(biāo)準(zhǔn)，以提高藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化。本研究除了測(cè)定《中國藥典》2020 年版規(guī)定的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 含量，也測(cè)定了柴胡皂苷c 的含量，結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.004%～0.200%，柴胡皂苷c 含量與柴胡皂苷a、d 含量無明顯變化規(guī)律。

我國柴胡藥材種植廣泛，雖然《中國藥典》2020 年版對(duì)柴胡藥材基原已作規(guī)范，但各地習(xí)用種仍存在差異，受基原植物種間差異、生長環(huán)境、栽培方法等條件限制，不同地區(qū)的柴胡藥材質(zhì)量參差不齊[11]。柴胡抗旱性較強(qiáng)，目前各地引種的較多，從本研究中可以看出，ITS 序列同屬于一個(gè)類或次級(jí)小類的不同地區(qū)的柴胡，柴胡皂苷含量存在差異，表明不同生態(tài)環(huán)境對(duì)藥材的品質(zhì)影響很大?；诓煌a(chǎn)地柴胡藥材藥效成分含量變化，建議從標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范化角度更深入地研究柴胡適宜發(fā)展地區(qū)。