基于體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛作用研究△

盧顯興，奉建芳，2，丘琴，2*，黃秋艷，陳玉敏

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；

2.廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200

絲穗金粟蘭Chloranthus fortunei（A.Gray）Solms-Laub 為金粟蘭科金粟蘭屬植物，俗稱剪草、翦草、四塊瓦，為我國(guó)瑤族常用藥材，多以全草入藥，具有活血止痛、祛風(fēng)除濕的功效；臨床常用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性腸胃炎、咳嗽、跌打腫痛等；主要分布在廣西、江蘇、浙江、江西、湖南、貴州等地[1-2]。目前，對(duì)絲穗金粟蘭的研究?jī)?nèi)容主要側(cè)重于化學(xué)成分研究，其體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛藥效作用及機(jī)制尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以構(gòu)建疾病-藥物相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示藥物與疾病的關(guān)聯(lián)，從整體研究藥物與疾病的關(guān)系，目前已廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域的研究[3-4]。本實(shí)驗(yàn)研究絲穗金粟蘭水提物的體內(nèi)抗炎鎮(zhèn)痛作用，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為其后期開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試藥

絲穗金粟蘭藥材采自廣西金秀瑤族自治縣桐木鎮(zhèn)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟實(shí)驗(yàn)師鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物絲穗金粟蘭Chloranthus fortunei（A.Gray）Solms-Laub；醋酸地塞米松（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：20305）；羅通定（四川迪菲特藥業(yè)有限公司，批號(hào)：200601）；角叉菜膠（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10207866）；二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110613，分析純）；冰乙酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20200722，分析純）；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器

Simplicity 型超純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)有限公司）；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SQP 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；RB-200 型智能熱板儀（成都太盟軟件有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種（KM）小鼠，150只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水?dāng)z食3 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審定，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定，審批號(hào)為DW20201025-137。

2 方法

2.1 絲穗金粟蘭水提物抗炎鎮(zhèn)痛作用體內(nèi)研究

2.1.1水提物制備 取絲穗金粟蘭干品，剪碎成長(zhǎng)約1 cm，稱取500 g，用10 倍量蒸餾水浸泡30 min，回流提取2 次，每次1.5 h，用醫(yī)療紗布濾過(guò)，合并2 次濾液并濃縮成浸膏。用蒸餾水100 mL 溶解，配成0.5 g·mL-1（以生藥量計(jì)）的粗提物為藥液備用。

2.1.2小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[5]方法，取KM小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半。分別設(shè)模型組（灌胃等體積蒸餾水），陽(yáng)性藥地塞米松組（6 mg·kg-1），絲穗金粟蘭水提物高、中、低劑量（7.28、3.64、1.82 g·kg-1，以生藥量計(jì)）組。給藥體積為20 mL·kg-1，每日1 次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥45 min后，于小鼠右耳廓前后均勻涂擦二甲苯30 μL，致炎30 min 后，將小鼠頸椎脫臼處死。沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑6 mm打孔器分別在雙耳同一部位打下圓耳片，以左、右耳片質(zhì)量之差作為腫脹度。

2.1.3小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[6]方法，動(dòng)物分組及給藥同2.1.2 項(xiàng)下方法，于末次給藥30 min后，在每只小鼠左后肢足跖皮下注射1%角叉菜膠的0.9%氯化鈉溶液0.05 mL。于致炎后2 h 處死小鼠，從踝關(guān)節(jié)處剪下左、右后足，于萬(wàn)分之一天平上稱定質(zhì)量，以左、右后足質(zhì)量之差作為腫脹度。

2.1.4乙酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[7]方法，動(dòng)物分組及給藥同2.1.2項(xiàng)下方法，陽(yáng)性組換為羅通定54.6 mg·kg-1，末次給藥后1 h后，腹腔注射0.6%乙酸溶液（10 mL·kg-1），記錄15 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。

2.1.5數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用One-way ANOVA分析，給藥組與模型組比較，方差齊，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）分析，方差不齊采用Dunnett′s T3 法分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 通過(guò)文獻(xiàn)查閱得到現(xiàn)階段絲穗金粟蘭中已發(fā)現(xiàn)的化合物，利用PubChem 平臺(tái)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取其3D 結(jié)構(gòu)信息，將其導(dǎo)入SwissADME（http://www.swissadme.ch）進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。以滿足Lipinski規(guī)則中至少3項(xiàng)和GI absorption為“High”作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出絲穗金粟蘭中與抗炎鎮(zhèn)痛關(guān)聯(lián)的成分，通過(guò)SwissTargetPrediction 平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch）預(yù)測(cè)成分潛在的作用靶標(biāo)，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）進(jìn)行校正后作為候選靶標(biāo)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）以“pain”和“inflammation”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得疾病靶點(diǎn)，采用韋恩分析獲取潛在的絲穗金粟蘭鎮(zhèn)痛抗炎靶點(diǎn)。

2.2.2成分-靶點(diǎn)-抗炎鎮(zhèn)痛相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用STRING 平臺(tái)（https://www.string-db.org）探尋絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)蛋白之間的關(guān)系，以蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)信息為橋梁，通過(guò)Cytocape 3.7.0軟件及插件Merge功能將絲穗金粟蘭潛在抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)PPI 信息，活性成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)，構(gòu)建絲穗金粟蘭活性成分-鎮(zhèn)痛抗炎可視化網(wǎng)絡(luò)，利用插件cytoHubb 篩選出網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)。

2.2.3抗炎鎮(zhèn)痛通路富集分析 將2.2.2 項(xiàng)下獲取的潛在鎮(zhèn)痛抗炎靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）進(jìn)行通路富集分析，篩選條件為“Homo sapien”“P＜0.05”。

2.2.4關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接 選取在2.2.3項(xiàng)下網(wǎng)絡(luò)中度值較高5個(gè)核心靶點(diǎn)，從RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www1.rcsb.org/）下載蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，利用PyMol軟件進(jìn)行受體處理（去水分子、加氫等），利用AutoDock Vina與其對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行分子對(duì)接。

3 結(jié)果

3.1 絲穗金粟蘭水提物對(duì)小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用

與模型組比較，絲穗金粟蘭水提物3 個(gè)劑量組和陽(yáng)性藥地塞米松組小鼠耳廓腫脹度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，絲穗金粟蘭水提物中、高劑量組和陽(yáng)性藥地塞米松組小鼠足腫脹度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。與模型組比較，絲穗金粟蘭水提物3個(gè)劑量組和陽(yáng)性藥羅通定組小鼠扭體次數(shù)顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 絲穗金粟蘭水提物對(duì)小鼠耳廓腫脹和足腫脹的影響（, n=10）

表1 絲穗金粟蘭水提物對(duì)小鼠耳廓腫脹和足腫脹的影響（, n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；表2同。

表2 絲穗金粟蘭水提物對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響（, n=10）

表2 絲穗金粟蘭水提物對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響（, n=10）

3.2 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛活性成分預(yù)測(cè)及靶點(diǎn)的篩選

基于參考文獻(xiàn)[8-13]，共獲取46 個(gè)符合篩選原則的絲穗金粟蘭活性成分，其相關(guān)藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

通過(guò)SwissTargetPrediction 平臺(tái)預(yù)測(cè)到604 個(gè)成分靶點(diǎn)。在GeneCards 平臺(tái)篩選得到抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)疾病靶點(diǎn)，按Score 值由大到小排列，分別選擇前500 個(gè)作為后續(xù)研究靶點(diǎn)。利用韋恩圖將活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲取得到絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)的40個(gè)潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，見(jiàn)圖1。

圖1 疾病靶點(diǎn)與絲穗金粟蘭成分靶點(diǎn)韋恩圖

3.3 成分-靶點(diǎn)-抗炎鎮(zhèn)痛網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將上述獲取得到的40 個(gè)潛在抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，利用Cytocape 3.7.0 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-抗炎鎮(zhèn)痛網(wǎng)絡(luò)，分別利用插件cytoHubb 篩選出該網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 絲穗金粟蘭的活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

結(jié)果顯示，絲穗金粟蘭中有31 個(gè)成分涉及的40個(gè)靶點(diǎn)可能與疼痛和炎癥存在聯(lián)系。其中前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、白蛋白（ALB）在網(wǎng)絡(luò)中度值較大，可能是其發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)存在1個(gè)成分關(guān)聯(lián)多個(gè)靶點(diǎn)，1個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)多個(gè)成分的情況，說(shuō)明絲穗金粟蘭的抗炎鎮(zhèn)痛作用是基于多成分多靶點(diǎn)的相互作用產(chǎn)生，見(jiàn)表4。

表4 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛網(wǎng)絡(luò)的主要成分及靶點(diǎn)

3.4 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛通路富集分析

KEGG 富集分析結(jié)果顯示，絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛可能與腫瘤壞死因子（TNF）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）等62 條通路密切相關(guān)（P＜0.05），顯著性最高的前20條通路見(jiàn)圖3。

圖3 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3.5 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛主要活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

將篩選出絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛活性成分-靶點(diǎn)-抗炎鎮(zhèn)痛網(wǎng)絡(luò)中度值較高5 個(gè)核心靶點(diǎn)PTGS2、MMP9、MAPK1、STAT3、ALB 與其對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行分子對(duì)接處理。結(jié)合活性與對(duì)接得分成正比，對(duì)接結(jié)果表明，其中乙酸松油酯、銀線草醇I 與PTGS2，金粟蘭內(nèi)酯與MAPK1，絲穗金粟蘭內(nèi)酯與MMP9，卡瓦胡椒素A 與ALB 結(jié)合活性相對(duì)較高，見(jiàn)表5和圖4。

圖4 絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖

表5 核心靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化合物結(jié)合活性得分

4 討論

藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，絲穗金粟蘭水提物可顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠引起的小鼠足腫脹及乙酸所致小鼠疼痛扭體次數(shù)，提示絲穗金粟蘭水提物具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。

網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析表明，絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛的主要物質(zhì)基礎(chǔ)可能為β-欖香醇、莽草酸、銀線草醇E、銀線草醇I 等成分。通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選出PTGS2、MMP9、MAPK1、STAT3、ALB 等40 個(gè)可能在絲穗金粟蘭治療炎癥和疼痛性疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵靶標(biāo)及334 條炎癥與疼痛交集靶點(diǎn)作用關(guān)系。

為進(jìn)一步研究絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛的潛在機(jī)制，利用篩選出的46 個(gè)活性成分與抗炎鎮(zhèn)痛的交集靶點(diǎn)進(jìn)行了通路富集分析。其中TNF 信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、Toll 樣受體（TLR）信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路顯著性較高。TNF 是一種促炎細(xì)胞因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡來(lái)協(xié)調(diào)組織穩(wěn)態(tài)，TNF 的急劇增加可導(dǎo)致疾病發(fā)作，研究表明通過(guò)調(diào)控TNF 信號(hào)通路能夠發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用[14]。NF-κB 信號(hào)通路是治療炎癥關(guān)鍵通路，研究表明疼痛、發(fā)熱、水腫等炎癥反應(yīng)與炎癥因子的異常表達(dá)有關(guān)，通過(guò)抑制該通路的活化可以達(dá)到治療該類疾病的效果[15-16]。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)存在各種模式識(shí)別受體（PRR），這些受體是借助識(shí)別特定的病原體相關(guān)分子模式（PAMP）來(lái)檢測(cè)危險(xiǎn)并發(fā)出特定的免疫反應(yīng)，在清除病原體時(shí)會(huì)存在無(wú)法區(qū)分“自身”和“非自身”分子。TLR 是最顯著的PRR，其在對(duì)病原體的感應(yīng)時(shí)會(huì)引起炎癥反應(yīng)。TLR 拮抗劑的開(kāi)發(fā)是目前免疫疾病研究的熱點(diǎn)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)40個(gè)潛在靶點(diǎn)中有6 個(gè)富集在TLR 信號(hào)通路上，分別為凋亡相關(guān)半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、PIK3CA、MAPK1、TNF、TLR4、V-REL 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA），可能為絲穗金粟蘭調(diào)控該通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

分子對(duì)接結(jié)果顯示絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)蛋白與相應(yīng)配體化合物的結(jié)合活性良好，其中酸松油酯、銀線草醇I 與PTGS2、金粟蘭內(nèi)酯與MAPK1、絲穗金粟蘭內(nèi)酯與MMP9、卡瓦胡椒素A與ALB 結(jié)合活性相對(duì)較高，本次篩選出的核心靶點(diǎn)中PTGS2 的度值最高，極有可能是該植物抗炎鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。前列腺素在炎癥中起調(diào)節(jié)作用，環(huán)氧合酶是催化花生四烯酸代謝和前列腺素合成的初始步驟，是炎癥的主要介質(zhì)，PTGS2 主要在炎癥細(xì)胞中表達(dá)，并在慢性和急性炎癥中明顯上調(diào)，成為許多藥理抑制劑的關(guān)鍵靶標(biāo)[19]。MAPK1 可以通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子改變基因表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，進(jìn)而參與抗炎作用[20]。因此，這2個(gè)靶點(diǎn)可能是絲穗金粟蘭抗炎鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5 結(jié)論

絲穗金粟蘭水提物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，絲穗金粟蘭可能是通過(guò)β-欖香醇、莽草酸、銀線草醇E、銀線草醇I 等活性成分通過(guò)靶向PTGS2、MMP9、MAPK1、STAT3、ALB進(jìn)而調(diào)控TNF、HIF-1、TLR、NF-κB、MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。