沒食子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

塔布斯·馬那爾，蘇來曼·哈力克

新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥（維藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054

沒食子（Infectoriae Galla）為殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoriaG.Oliver 幼枝上形成的干燥蟲癭，由沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallaetinctoriaeOliv.幼蟲寄生而成，分布于希臘、土耳其、敘利亞、伊朗及印度等地，我國(guó)無(wú)分布記載。本品為維吾爾族醫(yī)常用的進(jìn)口藥材，維吾爾族語(yǔ)稱“moza”，漢語(yǔ)音譯即“沒扎”，收載于《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書·維吾爾醫(yī)學(xué)卷》[1]和《中華本草·維吾爾藥卷》[2]。沒食子性質(zhì)二級(jí)寒、三級(jí)干，具生干生寒、燥濕收斂、固牙止痛、清熱消炎、祛腐愈傷、涼血止血、止瀉止痢等作用，臨床用于牙齦腫痛、牙齒松動(dòng)、咽喉腫痛、瘡瘍腐爛、傷口不愈、濕性白帶過多、子宮出血、瀉痢不止等濕熱性或血液性疾病。中醫(yī)認(rèn)為其具有澀腸、固精、止咳、止血、斂瘡之功效；主治久瀉久痢、遺精、盜汗、咳嗽、咯血、便血、痔血、創(chuàng)傷出血、瘡瘍久不收口、口瘡、齒痛。

沒食子中含鞣質(zhì)（50%～70%）、沒食子酸（2%～4%）、并沒食子酸及樹脂等成分[3]。劉延麟[4]報(bào)道沒食子含沒食子酸、間-二沒食子酸、對(duì)-二沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、1,2,3,6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1,2,3,4,6-五-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1-O-沒食子酰基-O-β-D-葡萄糖、1,6-二-O-沒食子?；?O-β-D-葡萄糖。龍飛[5]報(bào)道沒食子還含異丙隆、6-甲基-十八烷、鄰苯二甲酸丁酯、3-戊基-環(huán)氧乙烷-2-庚酸-甲酯、異膽酸乙酯、8-(1,2-二溴-2-苯基乙基)-3,7-二氫-1,3,7-三甲基-1-唑嘌呤-2,6-二酮、17-烯-35 烷、(Z)-9-油酸-3-烷氧基-丙酯?，F(xiàn)代研究表明，沒食子具有抑菌、殺菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射等藥理活性，具有較大的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值[6-10]。沒食子還是《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)》[11]收載的西帕依固齦液等10 種成方制劑處方的主要藥味，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》（上冊(cè)）僅收載性狀和試管鑒別項(xiàng)[3]。為了更好地控制沒食子質(zhì)量，本研究系統(tǒng)分析了進(jìn)口沒食子樣品性狀、顯微特征，對(duì)其進(jìn)行薄層色譜鑒別及水分、總灰分、浸出物、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留和沒食子酸含量測(cè)定，建立了比較完善的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀，包括SPD-M10A型二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS型柱溫箱、LC So1ution型色譜工作站（日本島津公司）；TC-C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Agilent 公司）；AE200 型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托雷多公司）；CPA225 D 型萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KLZ-UP 型超純水儀（臺(tái)灣艾柯成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠）；REPROSTAR3 型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG 公司）；BX-51 型生物顯微照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；SK7210LHC 型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率50 kHz）；QJGW-2 型箱式電阻爐（北京煤化所煤質(zhì)儀器研制中心）；GZX-9140MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；XT-1000A 型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市太陽(yáng)機(jī)電有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品沒食子酸（批號(hào)：110831-201204，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；沒食子酸甲酯（批號(hào)：AB152M，純度≥98%，天津一方科技有限公司）；沒食子對(duì)照藥材（批號(hào)：20140304，新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院）；聚酰胺薄膜（15 cm×15 cm，英國(guó)Chemicals Ltd Poole England 公司）；乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

沒食子藥材樣品11 批，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院蘇來曼·哈力克主任藥師鑒定為正品沒食子，來源信息見表1，其中樣品7～9從巴基斯坦進(jìn)口。

表1 沒食子樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品呈類球形，直徑1.0～2.5 cm，偶見短柄。外表面黃白色、黃棕色、黃綠色或墨綠色，具不規(guī)則點(diǎn)狀或波狀突起，底端具喙?fàn)钔蛊鸬谋鷼埢?。表面色淺者腰部多具1 個(gè)直徑2～4 mm 的圓形孔道，偶見2～3 個(gè)或更多（圖1）。橫切面中央多有圓形空隙，殘留幼蜂尸體或蛹蛻殼。質(zhì)硬而脆，斷面不平坦，邊緣黃白色至黃棕色，中央棕色至棕褐色。氣微，味澀、極苦。

圖1 沒食子樣品外觀

2.2 鑒別

2.2.1顯微鑒別 沒食子橫切面：取供試品，水浸軟化后徒手制橫切片，加甘油乙酸試液透化，置解剖鏡下觀察。外表皮層由2～3 層橢圓形厚壁細(xì)胞組成，內(nèi)含棕色塊；皮層為橢圓形或圓形細(xì)胞，壁稍厚；中間層具外韌型維管束，略木質(zhì)化；中央為多角形或不規(guī)則薄壁細(xì)胞（圖2）。

圖2 沒食子橫切面顯微組織特征（×100）

沒食子粉末：呈黃白色。石細(xì)胞橢圓形、類長(zhǎng)方形或不規(guī)則，壁厚，胞腔小，長(zhǎng)60～280 μm，寬20～90 μm；網(wǎng)紋細(xì)胞長(zhǎng)橢圓形或卵形，胞腔大，具圓形紋孔；淀粉粒單?；驈?fù)粒，圓形或橢圓形，臍點(diǎn)呈十字形或人字形，直徑15～30 μm。草酸鈣簇晶直徑20～40 μm；導(dǎo)管為螺紋；棕色樹脂分泌物圓形、長(zhǎng)方形，直徑10～20 μm（圖3）。

圖3 沒食子粉末顯微組織特征

2.2.2薄層色譜鑒別 取本品粉末（過三號(hào)篩）0.1 g，置具塞試管加甲醇5 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理15 min，靜置，上清液作為供試品溶液。取對(duì)照品沒食子酸和沒食子酸甲酯，加甲醇制成0.5 mg·mL-1溶液，作為對(duì)照品溶液。另取沒食子對(duì)照藥材0.1 g，同供試品方法制成對(duì)照藥材溶液。采用薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（四部）通則0502]，吸取上述4 種溶液各1 μL，分別條狀點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以50%乙醇為展開劑，展開，取出，揮干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖4。

圖4 沒食子樣品薄膜色譜圖

2.3 水分測(cè)定

分別取11 批供試品適量，按照《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）通則0832 第二法測(cè)定水分。結(jié)果顯示，沒食子樣品水分為8.5%～9.7%，平均值為9.1%，暫定水分應(yīng)不得超過12.0%。

2.4 總灰分測(cè)定

分別取11 批供試品適量，按《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2302 規(guī)定測(cè)定總灰分。結(jié)果顯示，沒食子樣品總灰分為1.2%～1.5%，平均值為1.3%，暫定總灰分應(yīng)不得超過2.0%。

2.5 酸不溶性灰分測(cè)定

分別取11 批供試品適量，按《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2302 規(guī)定測(cè)定酸不溶性灰分。結(jié)果顯示，沒食子樣品酸不溶性灰分為0.02%～0.11%，平均值為0.07%，暫不列入標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 重金屬及有害元素測(cè)定

11 批沒食子樣品送新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督研究院，按《中國(guó)藥典》2020 年版四部（通則）2321 鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定法測(cè)定重金屬及有害元素。結(jié)果顯示，重金屬及有害元素含量較低或未檢出，均符合規(guī)定，因此未列入標(biāo)準(zhǔn)。

2.7 農(nóng)藥殘留測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020 年版四部（通則）2341 農(nóng)藥殘留量測(cè)定法，11 批沒食子樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥（六六六、滴滴涕、林丹、七氯、艾氏劑、三氯殺螨醇）殘留、菊酯類農(nóng)藥（氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯）殘留均未檢出。

2.8 浸出物測(cè)定

分別取11 批供試品適量，按《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2201 熱浸法測(cè)定，70%乙醇為溶劑。結(jié)果顯示，浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.8%～91.0%，平均值為88.8%，暫定浸出物應(yīng)不得少于80.0%。

2.9 沒食子酸含量測(cè)定

2.9.1色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.5%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，97%A；15～30 min，97%～80%A；30～31 min，80%～97%A；31～40 min，97%A）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm；理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于6000。高效液相色譜（HPLC）圖見圖5。

圖5 沒食子中沒食子酸HPLC圖

2.9.2對(duì)照品溶液的制備 取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成40 μg·mL-1的溶液，即得。

2.9.3供試品溶液的制備 精密稱取沒食子樣品粉末（過三號(hào)篩）0.1 g，置于25 mL 棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理15 min，放至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.9.4線性關(guān)系考察 精密稱取沒食子酸對(duì)照品13.80 mg，置于25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得552.0 μg·mL-1儲(chǔ)備液。分別精密吸取儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 于10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為13.80、27.60、55.20、110.40、165.60、220.80 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=35 135.016 39X+9 487.378 89（r=0.999）。沒食子酸在13.80～220.80 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.9.5精密度試驗(yàn) 精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液（47.12 μg·mL-1），重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，測(cè)定沒食子酸的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，沒食子酸峰面積的RSD為0.069%，顯示精密度良好。

2.9.6重復(fù)性試驗(yàn) 取沒食子1 號(hào)樣品0.1 g，精密稱定，按2.9.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，按干燥品計(jì)算沒食子酸含量，RSD 為1.29%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取沒食子1 號(hào)樣品0.1 g，精密稱定，按2.9.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25 h 進(jìn)樣測(cè)定，沒食子酸峰面積的RSD 為1.67%。說明供試品溶液室溫下25 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.9.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品0.05 g（沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.78%），共取9份，置于9個(gè)25 mL 棕色量瓶中，分別加入80%、100%、120%沒食子酸對(duì)照品溶液（沒食子酸質(zhì)量濃度為55.79 μg·mL-1），按2.9.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果沒食子酸平均回收率為101.6%，RSD為1.56%。結(jié)果見表2。

表2 沒食子中沒食子酸加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9.9樣品測(cè)定 分別精密稱11 批不同產(chǎn)地沒食子粉末各0.1 g，按2.9.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.52%～4.72%，平均值為2.90%，SD為±1.087 69。根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，暫定沒食子中含沒食子酸（C7H6O5）按干燥品計(jì)，應(yīng)不得少于1.20%。結(jié)果見表3。

表3 11批沒食子樣品中沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=2）

3 討論

3.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高的意義和必要性

本研究為國(guó)家藥典委員會(huì)《中國(guó)藥典》品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂科研項(xiàng)目?jī)?nèi)容之一。沒食子原標(biāo)準(zhǔn)收載只有性狀、顯微和簡(jiǎn)單試管鑒別。本研究對(duì)性狀和顯微鑒別作了全面修訂，刪除專屬性差的試管鑒別，增加了對(duì)照品、對(duì)照藥材的薄層色譜鑒別，增加了水分、總灰分、浸出物、HPLC 沒食子酸含量測(cè)定等項(xiàng)，使質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到全面提高。經(jīng)過多次復(fù)核，本研究沒食子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草的各項(xiàng)指標(biāo)基本合理，方法可行，重復(fù)性較好。

3.2 薄層色譜條件的選擇

沒食子含鞣質(zhì)、沒食子酸、丁香酸、鞣花酸（并沒食子酸）、沒食子酸甲酯等成分。針對(duì)沒食子酸、鞣花酸、沒食子酸甲酯及沒食子對(duì)照藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別試驗(yàn)。1）硅膠G薄層色譜：取本品粉末0.1 g，加甲醇20 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL 作為供試品溶液。取沒食子酸對(duì)照品加甲醇制成2 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）通則0502 薄層色譜法，吸取供試品溶液5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254 薄層板上，以二氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶5∶1）為展開劑，展開，取出，揮干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。2）聚酰胺薄膜色譜：展開劑分別用50%乙醇和30%乙醇，50%乙醇效果優(yōu)于30%乙醇；點(diǎn)樣量用1、2 μL，分別點(diǎn)狀和條狀點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上（進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)），結(jié)果點(diǎn)樣量1 μL 效果優(yōu)于2 μL，條狀點(diǎn)樣效果優(yōu)于點(diǎn)狀點(diǎn)樣。綜合考慮，方法2操作簡(jiǎn)單、色譜斑點(diǎn)清晰、展開劑經(jīng)濟(jì)且對(duì)環(huán)境污染小，故列入標(biāo)準(zhǔn)。薄層色譜耐用性考察結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)聚酰胺薄膜（上海試劑四廠）和進(jìn)口聚酰胺薄膜（BDH chemicals Ltd Poole England）色譜斑點(diǎn)均清晰穩(wěn)定，便于識(shí)別。

3.3 液相色譜條件選擇

謝成根等[12]采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)法測(cè)定沒食子中沒食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為112.6 mg·g-1。楊建華等[13]報(bào)道分別采用HPLC、干酪素比色法測(cè)定沒食子藥材中沒食子酸和總鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.76%和42.85%。周露等[14]對(duì)沒食子藥材HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了研究。本研究對(duì)沒食子藥材中沒食子酸進(jìn)行了HPLC含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便易行。選用乙腈-0.5%磷酸水溶液（3∶97），流速為1.0 mL·min-1，柱溫為35 ℃，進(jìn)行等度洗脫，沒食子峰基線分離，檢測(cè)時(shí)間為70 min，過長(zhǎng)。故選用梯度洗脫，方法方便、快捷。經(jīng)二極管陣列光譜掃描沒食子酸峰純正，紫外最大吸收波長(zhǎng)為273 nm，故采用273 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 供試品溶液的制備

實(shí)驗(yàn)中考察了沒食子不同提取溶劑水、甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、丙酮、50%丙酮，結(jié)果水、甲醇、50%乙醇提取液的沒食子酸峰可基線分離，因此進(jìn)行了水提取液、甲醇提取液24 h 穩(wěn)定性考察，結(jié)果沒食子酸在甲醇中24 h 內(nèi)穩(wěn)定，在水中不穩(wěn)定，24 h 內(nèi)沒食子酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2.87%增加到4.11%，RSD 為14.35%，隨著時(shí)間的推移鞣質(zhì)類水解生成更多游離的沒食子酸，所以本樣品的提取不適合使用含水溶劑，故選用甲醇為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)中考察了不同超聲提取時(shí)間（15、20、25、30、40 min），結(jié)果超聲15、40 min 時(shí)沒食子酸含量基本穩(wěn)定，為節(jié)省時(shí)間，選擇15 min。

3.5 液相色譜耐用性考察

考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、不同柱溫（30、35、40 ℃）、不同色譜柱Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Wondasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、不同品牌儀器（島津LC-20AT 型高效液相色譜儀和安捷倫1260 型高效液相色譜儀）、不同實(shí)驗(yàn)室（新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院和上海市食品藥品檢驗(yàn)所），結(jié)果表明耐用性均較好。