白槍桿幼苗葉片形態(tài)和生理性狀對鈣的響應(yīng)

張 梅，董 瓊，段華超，葉 瀾，李燕燕，金友帆

（西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

鈣作為植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子及必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，不僅對維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和膜結(jié)合蛋白具有一定的穩(wěn)定性，而且還可作為細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的第二信使耦合外部信號(hào)[1]。鈣能提高植物組織細(xì)胞的多種抗性，如植物抗寒[2]、抗旱[3]、抗病[4]、抗重金屬毒害[5]及耐鹽脅迫[6]等逆境。鈣還具有改善植物光合作用，提高植物葉片中葉綠素含量的作用[7]。鈣對增強(qiáng)植物葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)及其他相關(guān)保護(hù)酶的活性起著重要作用[8]。植物種類不同，對鈣的適宜濃度不同，鈣濃度過高或過低都會(huì)影響植物的生長發(fā)育，當(dāng)鈣濃度適宜時(shí)才能促進(jìn)植物生長發(fā)育。白槍桿Fraxinus malacophylla是木犀科Oleaceae梣屬Fraxinus雙子葉落葉喬木，樹高約10 m，主要分布于云南和廣西，是石漠化治理中優(yōu)良的闊葉伴生樹種[9]。其樹皮灰白色，芽裸露，翅果匙形，根系發(fā)達(dá)，萌蘗力強(qiáng)。白槍桿不僅可以制作家具與農(nóng)具，而且還具有極高的藥用價(jià)值[10-12]，有較好的發(fā)展前景[13]。白槍桿主要分布在中國石漠化治理重點(diǎn)區(qū)域，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。該區(qū)域的生態(tài)治理也是國家高度重視的問題之一，土壤中鈣含量是非巖溶地區(qū)的2～3倍。目前，有關(guān)白槍桿的相關(guān)研究集中在激素和肥料[13-14]、造林技術(shù)[15]和土壤水分[16-17]等方面，但關(guān)于白槍桿幼苗野外生長對環(huán)境中不同鈣濃度的適應(yīng)機(jī)制尚不清楚。本研究以1年生白槍桿幼苗為材料，研究了不同鈣濃度對白槍桿幼苗葉片形態(tài)及生理特性的影響，以期為白槍桿培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況及材料

研究材料為1年生白槍桿實(shí)生苗，2020年1月播種，2020年6月由云南建水移至西南林業(yè)大學(xué)樹木園。煉苗15 d后植入營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽上口徑160 mm，下口徑110 mm，高120 mm，基質(zhì)配比為V(紅壤)∶V(河沙)∶V(珍珠巖)=5∶3∶2，每盆種植1株幼苗。7月5日，選取長勢均勻一致的苗木開始試驗(yàn)。于2020年7月5日至11月13日在西南林業(yè)大學(xué)格林溫室(25°03′N，102°45′E)進(jìn)行。溫室海拔為1 904 m，溫度為 16～30 ℃，空氣相對濕度為 23%～67%，大氣二氧化碳質(zhì)量濃度為 400～412 mg·L-1，光照充足。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，4個(gè)施鈣(氯化鈣)處理分別為0 (對照)、25、50和75 mmol·L-1，每個(gè)處理10株苗，重復(fù)3次，共計(jì)120株苗。

在不同處理組每盆幼苗的根系周圍澆灌50 mL不同鈣濃度溶液，對照組則施加50 mL去離子水，每隔15 d施鈣1次，連續(xù)施鈣8次。試驗(yàn)期間，正常管理苗木。

1.3 數(shù)據(jù)采集與測定方法

處理120 d后，采用YMJ-C智能葉面積測量儀測定白槍桿幼苗的葉長、葉寬、葉長寬比、葉面積和葉周長。將白槍桿幼苗葉片剪碎混合進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測定，其中用乙醇浸提法測定葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[18]，用愈創(chuàng)木酚比色法測定POD活性[18]，用氮藍(lán)四唑光法測定SOD活性[19]，用紫外吸收法測定CAT 活性[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較不同鈣濃度處理下白槍桿幼苗葉片形態(tài)指標(biāo)、葉片相關(guān)指標(biāo)、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶活性的差異，運(yùn)用LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較；采用Graphpad Prism 8.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈣濃度處理對白槍桿幼苗葉片形態(tài)指標(biāo)的影響

由表1可知：白槍桿幼苗的葉片形態(tài)指標(biāo)隨著鈣濃度升高均呈先上升后下降的趨勢。白槍桿幼苗的葉片數(shù)在不同鈣濃度處理下與對照差異顯著(P＜0.05)，在鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，葉片數(shù)達(dá)到最大值，且葉片數(shù)是對照的1.33倍。白槍桿幼苗的葉長、葉寬、葉長寬比、葉周長及葉面積在不同鈣濃度處理下與對照均無顯著差異(P＞0.05)，在鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，葉長、葉寬、葉長寬比、葉周長及葉面積均達(dá)到最大值，且葉長、葉寬、葉長寬比、葉周長和葉面積分別是對照的1.22、1.01、1.08、1.21和1.17倍。

表1 不同鈣濃度處理下白槍桿幼苗葉片形態(tài)指標(biāo)的變化Table 1 Change of leaf shape determination result of F. malacophylla seedling under different calcium concentrations

白槍桿幼苗葉片生長發(fā)育過程中，不同鈣濃度對白槍桿幼苗葉片的葉面積指數(shù)、葉生物量、比葉長、比葉面積有不同的影響。白槍桿幼苗在不同鈣濃度處理間幼苗葉面積指數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，隨著鈣濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，葉面積指數(shù)達(dá)到最大值，且葉面積指數(shù)是對照的1.17倍；當(dāng)鈣濃度為75 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗葉生物量與其他3個(gè)處理有顯著差異(P＜0.05)，隨著鈣濃度的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，葉生物量達(dá)到最大值；當(dāng)鈣濃度為75 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗比葉長及比葉面積與其他3個(gè)處理差異顯著(P＜0.05)，隨著鈣濃度的升高而升高，均在鈣濃度為75 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。

2.2 不同鈣濃度處理對白槍桿幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由表2可知：白槍桿幼苗不同鈣濃度處理間葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著(P＜0.05)，隨著鈣濃度的增加，白槍桿幼苗葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈先上升后下降的趨勢，均在鈣濃度為50 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)到最大值，其中，葉綠素 a為 (2.14±0.32) mg·g-1，葉綠素 b 為 (0.62±0.10) mg·g-1，葉綠素 (a+b)為(2.77±0.42) mg·g-1，葉綠素 a/b 為 3.44±0.10，與對照相比，增幅分別為 32.92%、21.57%、30.66% 和8.52%。當(dāng)鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，對白槍桿幼苗葉片的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有促進(jìn)作用。

表2 不同鈣濃度處理下白槍桿幼苗葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 2 Change of chlorophyll content determination of F. malacophylla seedling under different calcium concentrations

2.3 不同鈣濃度處理對白槍桿幼苗酶活性的影響

2.3.1 不同鈣濃度處理對白槍桿幼苗 POD 活性的影響 由圖 1A 可知：當(dāng)鈣濃度為 50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗POD活性與其他處理差異顯著(P＜0.05)，隨著鈣濃度的增加，白槍桿幼苗葉片中POD活性呈先增加后下降的趨勢，施鈣處理的POD活性均高于對照。與對照相比，20、50和75 mmol·L-1鈣濃度處理的白槍桿幼苗葉片中的POD活性分別增加了12.42%、41.56%和19.63%。當(dāng)鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗葉片中POD活性最強(qiáng)。

2.3.2 不同鈣濃度處理對白槍桿幼苗SOD活性的影響 由圖1B可知：白槍幼苗不同鈣濃度處理間SOD的活性差異不顯著(P＞0.05)。隨著鈣濃度的增加，白槍桿幼苗葉片中SOD活性呈先增加后下降的趨勢。在鈣濃度為75 mmol·L-1時(shí)，SOD活性最低。與50 mmol·L-1鈣濃度處理相比，對照、25和75 mmol·L-1鈣濃度處理下白槍桿幼苗葉片SOD活性分別降低了4.56%、1.69%和13.56%。當(dāng)鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗葉片中的SOD活性最強(qiáng)。

2.3.3 不同鈣濃度處理對白槍桿幼苗CAT活性的影響 由圖1C可知：隨著鈣濃度的增加，白槍桿幼苗CAT活性呈先增加后下降的趨勢，50 mmol·L-1鈣濃度處理與對照差異顯著(P＜0.05)。在4個(gè)處理中，50 mmol·L-1鈣濃度處理的CAT活性最高，對照的CAT活性最低。鈣濃度過高會(huì)抑制白槍桿幼苗CAT活性的增加，但施鈣處理CAT活性均高于對照。因此，施鈣處理能有效提高白槍桿幼苗葉片的CAT活性，在鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗CAT活性最強(qiáng)。

圖1 不同鈣濃度處理下白槍桿幼苗酶活性的變化Figure 1 Change of enzymatic activity of F. malacophylla seedling under different calcium concentrations

3 討論

在植物生長發(fā)育過程中需要相當(dāng)數(shù)量的鈣才能維持正常生長，土壤環(huán)境中鈣較多的石漠化區(qū)域，植物亦經(jīng)常受到鈣脅迫抑制。部分植物通過減少葉片數(shù)、葉長、葉寬和葉生物量等來適應(yīng)脅迫下的生長[20]。吳朝波等[8]研究表明：鈣濃度過高會(huì)抑制檳榔Areca catechu幼苗生長。李香君等[21]研究發(fā)現(xiàn)：鈣濃度過低或過高會(huì)抑制沙地樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica幼苗的生長，適宜的鈣濃度可促進(jìn)沙地樟子松幼苗生長發(fā)育。本研究表明：隨著鈣濃度的升高，白槍桿幼苗的葉片數(shù)、葉長、葉寬和葉面積等葉片形態(tài)指標(biāo)均呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)鈣濃度為50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗的葉片數(shù)、葉長、葉寬、葉面積、葉周長和葉生物量等達(dá)到最大值。當(dāng)鈣濃度為75 mmol·L-1時(shí)，對白槍桿幼苗的葉片形態(tài)及相關(guān)指標(biāo)有抑制作用。綜上所述，適宜的鈣濃度可以促進(jìn)白槍桿幼苗的生長，而鈣濃度過高會(huì)抑制白槍桿幼苗的生長。

植物的葉面積直接影響著植物對光和碳的獲取能力，比葉面積則反映不同植物獲取資源的能力及對生存環(huán)境的適應(yīng)性。江志標(biāo)等[20]研究表明：比葉面積小對干旱貧瘠的地方適應(yīng)能力較強(qiáng)，比葉面積大則獲取資源和保持體內(nèi)營養(yǎng)的能力越強(qiáng)。本研究表明：隨著鈣濃度的增加，葉面積呈先增加后減少的趨勢。中、低鈣濃度對白槍桿幼苗的生長有促進(jìn)作用，當(dāng)鈣濃度過高時(shí)，白槍桿幼苗會(huì)通過減少葉片面積來適宜高鈣環(huán)境。白槍桿幼苗葉片的比葉面積隨著鈣濃度的升高而增大，說明白槍桿幼苗在不同鈣濃度處理下獲取資源和保持體內(nèi)營養(yǎng)的能力增強(qiáng)。

植物中的葉綠素則是光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及重要色素[22]，因此，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低在一定程度上反映了植物光合能力的強(qiáng)弱。孫悅[23]研究表明：鈣濃度的增加會(huì)使油松Pinus tabuliformis幼苗葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先增加后減少的趨勢。李香君等[21]表明：鈣濃度的增加會(huì)降低檳榔葉片中的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本研究表明：隨著鈣濃度的增加，白槍桿幼苗葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈先升高后降低的趨勢。所以，適宜的鈣濃度可以提高植物葉片中的葉綠素a、葉綠素b及葉綠素(a+b)，過高的鈣濃度可以抑制白槍桿幼苗中的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加。

鈣在植物細(xì)胞中可以活化多種酶，還可以維持植物細(xì)胞生理平衡。SOD活性是鑒定植物抗逆性的重要生理生化指標(biāo)，主要功能是將超氧陰離子自由基(O2-)轉(zhuǎn)化為雙氧水(H2O2)和氧氣(O2)[24]。POD和CAT是防止細(xì)胞內(nèi)氧化的保護(hù)酶，主要功能是去除植物體內(nèi)的過氧化物和H2O2，從而減少對細(xì)胞膜的損傷[25-27]。因此，SOD、POD和CAT的平衡有助于清除植物中的活性氧物種并維持細(xì)胞功能[28]。吳朝波等[8]、孫悅[23]研究發(fā)現(xiàn)：鈣濃度過高會(huì)抑制植物體內(nèi)酶活性。在本研究中，POD、SOD和CAT活性隨鈣濃度的增加先升高后降低；當(dāng)鈣濃度≤50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗葉片的POD、SOD和CAT活性升高。當(dāng)鈣濃度＞50 mmol·L-1時(shí)，白槍桿幼苗葉片的POD、SOD和CAT活性降低，說明鈣濃度過高抑制了的POD、SOD和CAT活性的提高。白槍桿幼苗在25和50 mmol·L-1鈣濃度處理下，酶活性均隨鈣濃度的增加而增加，表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，可以維持細(xì)胞活性氧平衡。當(dāng)鈣濃度達(dá)75 mmol·L-1時(shí)，3種酶活性不同程度降低，表明超出了白槍桿的耐鹽能力，植株體內(nèi)活性氧過多對保護(hù)酶造成損害，導(dǎo)致酶活性降低，造成活性氧清除能力降低，抑制白槍桿幼苗生長。

4 結(jié)論

鈣濃度會(huì)影響白槍桿幼苗葉片的形態(tài)指標(biāo)、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶活性，白槍桿的葉片形態(tài)指標(biāo)除比葉長和比葉面積隨鈣濃度的增加而增加外，其余相關(guān)指標(biāo)均呈先上升后下降的趨勢，白槍桿幼苗的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶活性隨著鈣濃度的升高均呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)鈣濃度在50 mmol·L-1時(shí)，對白槍桿幼苗的葉片生長發(fā)育有一定促進(jìn)作用，提高了白槍桿幼苗葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增加了白槍桿幼苗葉片中的POD、SOD、CAT活性。中、低鈣濃度對白槍桿幼苗生長有不同程度的促進(jìn)作用，說明白槍桿對中、低鈣濃度處理具有一定的喜適性。