氮添加對毛竹林土壤磷組分的影響

王藝雄，張華鋒，李 全，張君波，王紹良，宋新章

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.杭州市臨安區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 311300）

磷是森林生態(tài)系統(tǒng)中重要的限制營養(yǎng)元素，參與生物體的各種代謝，其有效性在植物凈初級生產(chǎn)力和微生物活性中起著重要作用[1]。為研究土壤磷的有效性，一般將磷分為無機磷和有機磷兩大類，利用不同的化學(xué)提取液對土壤磷進(jìn)行分級[2]。植物根系結(jié)合微生物利用一系列機制增加土壤磷的有效性[3]，傳統(tǒng)的化學(xué)分級方法沒有充分反映植物根系和微生物介導(dǎo)磷轉(zhuǎn)化過程?；诖?，DELUCA等[4]提出了基于生物有效性的磷分級方法(biologically based phosphorus method，BBP法)，定義了4種形式的生物可利用土壤磷組分，分別為用氯化鈣提取的根系攔截和擴散的可溶性無機磷(CaCl2-P)，用檸檬酸鹽提取的吸附在黏土顆粒上或弱結(jié)合在無機沉淀物上的活性無機磷(Citrate-P)，用酶提取被酸性磷酸酶和植酸酶水解的有機磷(Enzyme-P)，用鹽酸提取被植物和微生物產(chǎn)生的具有可溶性的活性無機磷質(zhì)子(HCl-P)。該方法考慮到土壤根際與微生物分泌活化的磷表征磷組分[5]，有助于深入理解生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)驅(qū)動磷轉(zhuǎn)化的生物學(xué)機制。

由于人為排放的活性氮含量增加，大氣氮沉降加劇[6]。中國亞熱帶地區(qū)是氮沉降最嚴(yán)重的地區(qū)之一，在過去30 a里氮沉降量的增幅約60%[7-8]。相關(guān)研究表明：長期高強度氮輸入會改變土壤微生物生物量和活性，增加土壤酸性磷酸酶活性，從而影響土壤磷循環(huán)過程[9-11]。因此，在氮沉降背景下維持有效磷的供應(yīng)來滿足較高森林生產(chǎn)力已成為重要問題。毛竹Phyllostachys edulis是東亞和東南亞地區(qū)廣泛栽植的竹種[12]，在中國面積為467.78萬 hm2，占全國竹林面積的72.96%，是重要的森林資源，在緩解氣候變化方面具有重要的潛力[7,13-14]。毛竹是無性繁殖植物，由復(fù)雜的地下根鞭上的筍芽發(fā)育而成[15]，地下根系生物量占地上生物量的30%～50%，遠(yuǎn)高于其他類型森林生態(tài)系統(tǒng)[7,16]。因此，毛竹林土壤磷循環(huán)尤其是生物有效磷組分極有可能與其他森林不同。毛竹主要分布在中國亞熱帶地區(qū)，其氮沉降量已經(jīng)達(dá)30 kg·hm-2·a-1[17]。LI等[11]研究發(fā)現(xiàn)：氮添加增加了毛竹林凋落物量、磷歸還量、土壤酸化、土壤微生物生物量磷和有效磷，但降低了葉片磷養(yǎng)分吸收率和叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)侵染率[18]，而氮沉降對毛竹土壤磷組分的研究還未見報道，制約了對大氣氮沉降增強背景下毛竹林生產(chǎn)力響應(yīng)機制的認(rèn)識。本研究擬在不同氮添加強度處理下，分析毛竹林土壤不同深度磷組分的含量及其影響因素，量化各組分對土壤有效磷的貢獻(xiàn)程度，為改進(jìn)毛竹林經(jīng)營管理措施、提升毛竹林生產(chǎn)力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

樣地位于浙江省杭州市臨安區(qū)青山湖街道。該地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫為15.6 ℃，年均降水量為1 420 mm，年均日照時數(shù)為1 847 h，年均無霜期約230 d，地形地貌為低山丘陵，海拔為100～300 m，土壤類型屬于黃土壤[19]。

1.2 試驗設(shè)計

2012年11月在樣地內(nèi)設(shè)立了12個20 m×20 m的典型樣地，并在樣地間設(shè)置了20 m的緩沖隔離區(qū)以避免附近地塊的干擾。以當(dāng)?shù)仄骄髿獾两邓俾始s30 kg·hm-2·a-2和年平均銨態(tài)氮/硝態(tài)氮比值(NH4+/NO3-)1.28為依據(jù)，以硝酸銨(NH4NO3)為氮源[17]，設(shè)置了4個氮沉降處理水平，分別為對照(0 kg·hm-2·a-1，N0)、低氮 (30 kg·hm-2·a-1，N30)、中氮 (60 kg·hm-2·a-1，N60)和高氮 (90 kg·hm-2·a-1，N90)，每個處理重復(fù)3次。從2013年1月開始每月初配置對應(yīng)樣地所需質(zhì)量的NH4NO3溶于10 L水中，使用電動噴霧器將配好的溶液均勻地噴灑在每個樣地上，1 a進(jìn)行12次等量的噴灑，同時在對照組內(nèi)采用同樣的方法噴灑10 L水，避免加水對試驗的影響。受新冠病毒疫情影響，樣地從2020年1月起停止噴氮。

1.3 樣品采集與測定

2020年8月，在每個樣地內(nèi)隨機選取5個點，去除土壤上層凋落物，使用土鉆對各處理樣地的土壤分為表層(0～20 cm)和深層(20～40 cm)進(jìn)行采樣，將各土層的土樣均勻混合，裝入無菌袋后放入4 ℃便攜式恒溫箱中帶回實驗室。帶回后立即對土壤進(jìn)行預(yù)處理，剔除其中的石塊、根系等雜物后，過2 mm土篩，將土樣分為3份，分別作自然風(fēng)干及儲存于4 ℃和-20 ℃冰箱內(nèi)低溫保存處理。

土壤pH采用PHS-3C酸度計測定，土壤有機碳和土壤全氮通過碳氮元素分析儀測定，土壤全磷采用高氯酸-硫酸(HClO4-H2SO4)法測定，土壤有效磷采用0.5 mol·L-1碳酸氫鈉(NaHCO3)浸提，鉬藍(lán)比色法測定。土壤微生物生物量磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3作為土壤浸提劑的氯仿熏蒸浸提法[20]。土壤酸性磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸二鈉比色法測定[21]。

基于生物有效性的土壤磷分級測定采用DELUCA等[4]提出的BBP方法。分別稱取0.5 g土壤加入4個 15 mL 離心管，分別平行加 10 mL 提取液，其中 0.01 mol·L-1CaCl2提取液用于提取 CaCl2-P，10 mmol·L-1檸檬酸提取液用于提取 Citrate-P，0.02×16.67 μkat·L-1酶提取液用于提取 Enzyme-P，1 mol·L-1鹽酸提取液用于提取HCl-P，震蕩3 h，離心提取上清液。所有提取液稀釋并采用孔雀石綠法測定磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用可重復(fù)雙因素方差分析(two-way ANOVA)探討氮添加和土壤深度及兩者的交互作用對磷組分和土壤理化性質(zhì)的影響。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)探討不同氮添加處理間土壤理化性質(zhì)和磷組分差異，利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析土壤磷組分與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。采用SPSS 25.0軟件完成數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加對不同深度土壤理化性質(zhì)的影響

可重復(fù)雙因素方差分析(表1)表明：除總磷外，氮添加、土壤深度及兩者復(fù)合作用均顯著影響了土壤理化性質(zhì)(P＜0.05)。由表2可知：與對照組相比，表層土壤中，氮添加顯著降低了pH (P＜0.05)，降幅為5.2%～6.2%，顯著增加了表層土壤中的全磷、有效磷和微生物生物量磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酸性磷酸酶活性(P＜0.05)，增幅分別為14.3%～23.8%、62.4%～197.8%、100.1%～229.1%和47.9%～79.2%；添加低氮和高氮顯著增加了表層土壤有機碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅分別為27.2%和4.7%；添加中氮顯著降低了表層土壤有機碳質(zhì)量分?jǐn)?shù) (P＜0.05)，降幅為3.9%。在深層土壤中，氮添加顯著降低了土壤pH和有機碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，降幅分別為6.2%～11.6%和9.3%～33.3%；顯著增加了土壤全磷、有效磷和微生物生物量磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酸性磷酸酶活性 (P＜0.05)，增幅分別為26.5%～40.8%、36.4%～175.5%、34.3%～59.3%、23.7%～76.3%。在對照組和氮添加處理下，深層土壤中的pH顯著高于表層土壤(P＜0.05)，高3.5%～10.7%，而有機碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酸性磷酸酶活性顯著低于表層土壤(P＜0.05)，分別低49.6%～185.3%、320.9%～819.3%、26.3%～46.8%。深層土壤全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在低氮和中氮添加下分別顯著提高了32.7%和29.2% (P＜0.05)，微生物生物量磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在中氮添加下顯著增加了20.2% (P＜0.05)，在高氮添加下顯著降低了23.7% (P＜0.05)。

表1 氮添加和土壤深度及其交互作用對土壤磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和理化性質(zhì)的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA about the effects of N addition, soil depth and their interactions on the concentrations of P fraction content and soil physicochemical properties

表2 氮添加對表層和深層土壤理化性質(zhì)的影響Table 2 Soil physical and chemical properties of topsoil and subsoil under N addition treatments

2.2 氮添加對不同深度土壤磷組分的影響

可重復(fù)雙因素方差分析(表1)表明：氮添加和土壤深度及其復(fù)合作用，除CaCl2-P外，對其他幾種生物有效性磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均具有顯著影響(P＜0.05)。圖1顯示：氮添加顯著增加了基于生物有效性的土壤磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)。在表層土壤中，與對照組相比，低氮顯著增加了CaCl2-P和Citrate-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅分別為28.5%和43.5%；中氮顯著增加了CaCl2-P、Enzyme-P和HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅分別為 39.7%、32.4%和 101.0%；高氮顯著增加了 CaCl2-P和 HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅分別為63.3%和155.2%。在深層土壤中，與對照組相比，低氮顯著增加了CaCl2-P和Enzyme-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅分別為33.6%和33.6%；中氮顯著增加了CaCl2-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅為44.3%，而顯著降低了Citrate-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，降幅為24.3%；高氮顯著增加了CaCl2-P和Enzyme-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P＜0.05)，增幅分別為58.6%和33.6%；氮添加對HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著影響，HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨土壤深度的增加顯著降低。在中氮處理下，Citrate-P和Enzyme-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨土壤深度的增加顯著降低。

圖1 不同氮添加對不同深度土壤磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 1 Soil P fraction content in different soil depth and N addition treatments

2.3 磷組分與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

相關(guān)性結(jié)果(表3)表明：表層土壤有效磷與各磷組分均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，其中有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與 Citrate-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性最高 (r=0.696)，與 Enzyme-P (r=0.522)和 HCl-P (r=0.417)次之，與CaCl2-P最低(r=0.375)；深層土壤有效磷與Enzyme-P呈顯著正相關(guān)(P＜0.01，r=0.711)。

表3 不同土壤深度磷組分與有效磷之間的相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation coefficients between P components and available P in different soil depth

由圖2～5可見：土壤 pH與 CaCl2-P(P＜0.01)、Enzyme-P (P＜0.05)和 HCl-P (P＜0.01)呈顯著負(fù)相關(guān)，土壤酸性磷酸酶活性與CaCl2-P、Enzyme-P和HCl-P呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，土壤微生物生物量磷與CaCl2-P呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，土壤有機碳與Citrate-P (P＜0.01)和HCl-P (P＜0.05)呈顯著正相關(guān)。土壤pH和酸性磷酸酶活性對CaCl2-P (P＜0.01)的影響更為顯著。土壤有機碳對Citrate-P (P＜0.01)的影響更為顯著。

圖2 不同磷組分與土壤 pH 的相關(guān)性Figure 2 Relationship between different P fraction and soil pH

圖3 不同磷組分與土壤酸性磷酸酶的相關(guān)性Figure 3 Relationship between different P fraction and soil acid phosphate

圖4 不同磷組分與土壤微生物生物量磷的相關(guān)性Figure 4 Relationship between different P fraction and soil microbial biomass phosphorus

圖5 不同磷組分與土壤有機碳的相關(guān)性Figure 5 Relationship between different P fraction and soil organic carbon

3 討論

3.1 氮添加和土壤深度對土壤磷組分的影響

本研究中，除深層土壤中HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)外，氮添加顯著增加了各土層生物有效性磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。主要原因是氮添加導(dǎo)致了植物和土壤中氮磷摩爾比遠(yuǎn)小于陸地生態(tài)系統(tǒng)中的氮磷摩爾比[23]。在表層和深層土壤中，所有水平的氮添加顯著增加了CaCl2-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)，原因可能是氮添加增加了毛竹林根系生物量[7]，增加了根系對無機磷的攔截，從而提高了土壤中CaCl2-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在表層土壤中，Citrate-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅在低氮處理下顯著增加，而在中氮和高氮處理下無顯著變化，原因是中、高氮處理下土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮離子含量顯著提高，促使土壤中離子達(dá)到飽和狀態(tài)[24]，從而抑制了根系分泌的有機酸對磷的活化作用。中、高氮添加處理提高了Enzyme-P和HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這是由于中、高氮處理顯著增加了酸性磷酸酶(ACP)活性，降低了土壤pH。相關(guān)性分析也表明：Enzyme-P和HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)，而與ACP呈顯著正相關(guān)，支持了上述觀點。在深層土壤中，所有水平的氮添加均顯著增加了Enzyme-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但對HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著影響，表明氮添加促進(jìn)了深層土壤中的有機磷轉(zhuǎn)化，而對中等無機磷轉(zhuǎn)化無顯著影響。在對照和氮添加處理下，表層土壤中各磷組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于深層土壤，尤其是HCl-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這可能是因為毛竹林表層土壤中根系生物量和微生物量高于深層土壤，高的根系和微生物量和活性加劇了土壤磷的轉(zhuǎn)化，從而增加了土壤生物有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。陳紅等[25]研究發(fā)現(xiàn)：毛竹表層土壤(0～20 cm)的根系生物量是深層土壤(20～40 cm)的2.35倍，且毛竹土壤微生物生物量隨土壤深度的增加而減少[26]，支持了上述觀點。因此表層土壤會提供更多的生物有效磷。

對照及其氮添加處理下的4種磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由高到低依次是HCl-P、Citrate-P、CaCl2-P、Enzyme-P，氮添加未改變4種磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布模式，表明土壤生物有效性磷主要以無機形式存在，不會受氮添加的影響。表層土壤中有效磷與所有磷組分間均有顯著的正相關(guān)關(guān)系，與Citrate-P的相關(guān)系數(shù)最大，與Enzyme-P的相關(guān)系數(shù)次之，表明毛竹林表層土壤中的有效磷主要來自于有機酸活化釋放的無機磷。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)Citrate-P的貢獻(xiàn)最大[27]。深層土壤中有效磷僅與Enzyme-P呈顯著正相關(guān)，表明毛竹林深層土壤有機磷庫的酶礦化顯著影響了有效磷，DODD等[28]研究發(fā)現(xiàn)：土壤有機磷庫礦化直接轉(zhuǎn)化為有效磷，影響了有效磷的水平。

3.2 土壤磷素組分的其他影響因素

土壤pH顯著影響土壤磷組分，但影響程度和方向有所不同[29]。本研究發(fā)現(xiàn)：土壤pH與土壤磷組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，這與DELUCA等[4]的大尺度研究結(jié)果相反。氮添加導(dǎo)致土壤pH顯著降低，土壤pH降低會加速土壤有機磷的礦化，從而增加有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)[30]。有研究表明：酸性土壤中磷的有效性與鐵、鋁參與的化學(xué)過程密切相關(guān)，土壤有效磷增加會和可交換鋁離子(Al3+)和鐵離子(Fe3+)結(jié)合形成穩(wěn)定的磷[31]。短時間內(nèi)由于土壤磷限制，這些可利用磷會被植物和土壤中微生物利用，但長期的氮添加可能使土壤中的Al3+和Fe3+吸附和固定作用降低[32]，從而導(dǎo)致土壤生物有效性磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。因此，需要加強土壤pH與土壤磷組分關(guān)系的研究。

微生物在土壤磷的轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用[33-34]。土壤微生物是土壤生態(tài)環(huán)境中最為重要且對環(huán)境變化極其敏感的生物活性因子[35]。施氮會影響土壤微生物活動，DENG等[36]研究表明：低水平的氮添加促進(jìn)微生物生長，而當(dāng)?shù)砑拥牧砍^飽和點后會對微生物生長表現(xiàn)出抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)：氮添加顯著增加了土壤微生物生物量磷，從而增加了土壤的有效磷，主要原因是氮肥的成分硝酸銨中存在NH4+，且土壤pH降低，都有助于微生物分解無機磷。土壤微生物生物量磷與CaCl2-P質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，表明土壤磷與微生物顯著相關(guān)。土壤微生物的代謝和活性還與土壤有機碳密切相關(guān)[37]。氮添加加快了土壤表層凋落物分解，葉凋落物生物量與土壤有機碳呈負(fù)相關(guān)[38]，從而導(dǎo)致土壤有機碳含量增加。土壤中有機碳含量的增加有助于形成更豐富活躍的土壤微生物群落，促進(jìn)菌根的形成和無機活性質(zhì)子的增加[39]，從而增加生物有效性磷含量。土壤有機碳作為微生物活動能量的主要來源[40]，它的增加還可以提高脲酶和磷酸酶等的活性[41]。土壤酸性磷酸酶是酸性土壤中參加磷礦化的重要酶類。酸性磷酸酶與CaCl2-P、Enzyme-P和HCl-P呈顯著正相關(guān)。磷酸酶中的氮含量相對較高，在它們參與的反應(yīng)過程中需要大量的氮，因此氮添加可以顯著增加土壤酸性磷酸酶的產(chǎn)量和活性，從而提高磷的生物有效性[42-43]，減輕磷限制，有利于毛竹林生產(chǎn)力的提升[7]。