ATP檢測(cè)技術(shù)在自來(lái)水處理中的應(yīng)用

楊石紅， 趙益杰， 宋 飛， 文 聞

(1.昆明通用水務(wù)自來(lái)水有限公司， 云南 昆明 650021； 2.威立雅(中國(guó))環(huán)境服務(wù)有限公司北京分公司， 北京 100073；3.?？谕潘畡?wù)有限公司， 海南 ?？?570203)

為保障飲用水衛(wèi)生安全，自來(lái)水公司通常根據(jù)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)對(duì)出廠水和管網(wǎng)水的菌落總數(shù)、總大腸菌群等微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。但這些指標(biāo)都有一定的局限性：它們的檢測(cè)方法均屬于培養(yǎng)法，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)(1～3 d)；這些檢測(cè)都只能在實(shí)驗(yàn)室里面進(jìn)行，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)；菌落總數(shù)并不能真正檢測(cè)總的細(xì)菌數(shù)，而只能檢測(cè)部分可以培養(yǎng)的異養(yǎng)菌，還有大量有活性但不能被培養(yǎng)的細(xì)菌(VBNC)不能被檢出[1]。因此，僅采用這些指標(biāo)越來(lái)越難以滿足不斷提高的水質(zhì)管理需求：①自來(lái)水處理系統(tǒng)從源頭到水龍頭，都需要了解微生物總量的變化情況，以便進(jìn)行更加科學(xué)的消毒處理；②需要及時(shí)了解水廠消毒工藝運(yùn)行效果，從而要求對(duì)微生物進(jìn)行快速測(cè)定；③管網(wǎng)中水力條件的改變，可能導(dǎo)致水中微生物穩(wěn)定狀態(tài)的變化，需要使用快速檢測(cè)手段來(lái)掌握微生物狀態(tài)；④在用戶投訴以及管道泄漏等緊急情況下，除了余氯、濁度等指標(biāo)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)手段以外，特別需要微生物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，以便初步判斷是否存在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

三磷酸腺苷(ATP)存在于從微生物到高等動(dòng)植物所有生物體細(xì)胞中，是所有活細(xì)胞中主要的能量載體，為細(xì)胞代謝提供所需能量，正常生物體細(xì)胞內(nèi)的ATP含量是相對(duì)穩(wěn)定的。ATP含量可以直接反映細(xì)胞活性以及微生物的數(shù)量，可以代表真正的細(xì)菌總數(shù)[2]。以熒光染色技術(shù)為基礎(chǔ)的ATP測(cè)定儀具有便攜快速的特點(diǎn)，可以在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)于數(shù)分鐘之內(nèi)完成單個(gè)樣品檢測(cè)，并通過(guò)水樣濃縮使靈敏度達(dá)到菌落總數(shù)(平皿法)的水平。它在食品衛(wèi)生、工業(yè)水處理以及自來(lái)水水質(zhì)管理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。筆者在本文中探討了ATP檢測(cè)技術(shù)在自來(lái)水處理中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

1.1.1檢測(cè)儀器和方法原理

所采用的ATP測(cè)試儀為HACH TX1315 便攜式生物毒性分析儀，主機(jī)包含照度計(jì)和通訊模塊，第二代ATP測(cè)試套裝(通用型)。

活性微生物細(xì)胞經(jīng)過(guò)破壁處理后，釋放出的ATP和螢光素酶催化反應(yīng)而發(fā)光，使用照度計(jì)來(lái)測(cè)量發(fā)光的強(qiáng)度(RLU)，從而對(duì)樣品中 ATP 濃度進(jìn)行定量分析，反應(yīng)式如下：

(1)

檢測(cè)時(shí)，用套裝內(nèi)的注射器過(guò)濾裝置過(guò)濾50 mL(Vsample)水樣，在濾頭上加入1 mL破壁劑Ultralyse，然后用注射器將其推入9 mL UltraLute熒光酶溶液中，混勻，取100 μL混合液用照度計(jì)測(cè)量照度(RLUcATP)，同時(shí)取100 μL ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 000 pg/mL)測(cè)量照度(RLUATP1)，樣品ATP的值表示為：

(2)

1.1.2其它設(shè)備和檢測(cè)方法

游離氯測(cè)定使用余氯儀 HACH DR300, 菌落總數(shù)按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)配置所有器皿試劑并測(cè)試。

1.2 應(yīng)用研究方法

先驗(yàn)證ATP檢測(cè)儀器的精密度和檢出限，然后對(duì)水廠出廠水和管網(wǎng)水進(jìn)行初步常規(guī)測(cè)定，建立基準(zhǔn)線，再應(yīng)用到供水管網(wǎng)敏感取樣點(diǎn)、二次供水等場(chǎng)景，討論檢測(cè)結(jié)果對(duì)于水質(zhì)管理的意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的基本參數(shù)驗(yàn)證

2.1.1儀器精密度檢查

使用同一管網(wǎng)水樣品，過(guò)濾50 mL，進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表1。

檢測(cè)平均值為1.06，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.07，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6%，這對(duì)于微生物檢測(cè)來(lái)說(shuō)，方法有足夠的精密度。

2.1.2方法檢出限的確定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)，按照樣品分析的全部步驟，重復(fù)11次空白試驗(yàn)，將各測(cè)定結(jié)果換算為ATP值，結(jié)果見(jiàn)表2(平均校準(zhǔn)值RLU=14 809)。計(jì)算得到11次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.08，MDL=0.21。

表2 ATP檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.2 MDL of ATP detection pg·mL-1

2.2 水廠出水常規(guī)檢測(cè)

采用同一方法，對(duì)10個(gè)水廠的出廠水取3個(gè)平行樣并檢測(cè)ATP，同時(shí)檢測(cè)菌落總數(shù)。菌落總數(shù)結(jié)果均為0 CFU/mL，ATP檢測(cè)結(jié)果(n=3)見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，不同出廠水的ATP含量略有差異，除了1#水廠，其余各水廠的組內(nèi)平行樣結(jié)果差異不大(相對(duì)偏差小)。其中4#水廠、7#水廠、3#水廠、8#水廠的平均ATP含量均小于1.0 pg/mL。

圖1 出廠水ATP常規(guī)檢測(cè)的平均值和最值圖Fig.1 Average value and maximum/minimum value of ATP routine detection of treated water

參考文獻(xiàn)[3]中的方法，建立一個(gè)基準(zhǔn)線(參考限值)，以便判斷后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果是否在正常范圍內(nèi)。根據(jù)實(shí)際的檢測(cè)結(jié)果，這些樣品的菌落總數(shù)都未檢出，水質(zhì)滿足當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)要求，而個(gè)別出廠水ATP檢測(cè)結(jié)果卻出現(xiàn)明顯偏高的現(xiàn)象。這可能是水中的消毒劑接觸時(shí)間不夠造成，也可能是水中有其他的微生物或不當(dāng)操作造成的。個(gè)別偏高的值和其他數(shù)值有顯著性差異，應(yīng)該被當(dāng)做水質(zhì)異常而視為離群值，在計(jì)算基準(zhǔn)線時(shí)予以去除。

將這些數(shù)據(jù)從小(x1)到大(x30)排列后，計(jì)算平均值：

查Grubbs臨界值表，檢測(cè)數(shù)量p=30時(shí)，1%臨界值為3.236，5%臨界值為2.908，G30>3.236，所以最大值x30為離群值。

按此方法逐步確認(rèn)剩余數(shù)據(jù)的最大值是否為離群值，結(jié)果表明x29不是離群值。

2.3 管網(wǎng)水常規(guī)檢測(cè)

對(duì)管網(wǎng)水日常22個(gè)取樣點(diǎn)的31個(gè)樣品測(cè)量ATP含量和菌落總數(shù)。大部分取樣點(diǎn)第1次ATP測(cè)試結(jié)果很低，所以對(duì)這些取樣點(diǎn)只測(cè)試1次；少部分取樣點(diǎn)第1次測(cè)試結(jié)果比較高，所以這些取樣點(diǎn)測(cè)試2次以上。這些樣品的菌落總數(shù)結(jié)果為0 cfu/mL，ATP的檢測(cè)結(jié)果平均值如圖2所示。

圖2 管網(wǎng)水的ATP檢測(cè)平均值和最值Fig.2 Average value and maximum/minimum value of ATP detection of pipe network water

古代打官司不準(zhǔn)代理，有身份的官員、士大夫、婦女可以由家人代為訴訟，訴訟雙方當(dāng)事人必須親自到庭。也不準(zhǔn)“教唆詞訟”，不準(zhǔn)教別人如何打官司。為人起草訴狀是可以的，但是不得加減情節(jié)和訴訟請(qǐng)求。

從數(shù)值上看，管網(wǎng)水的ATP基準(zhǔn)線小于水廠，似乎不合乎情理，但這可能是兩方面的原因造成的：管網(wǎng)水大都來(lái)自7#水廠，而7#水廠的平均值為0.58 pg/mL；而水廠的基準(zhǔn)線是剔除離群值后的所有水廠數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算結(jié)果，其中有幾個(gè)水廠的檢測(cè)結(jié)果比較高但又不是離群值。因此，采用所有水廠的結(jié)果來(lái)計(jì)算限值的方法有一定局限性，應(yīng)該每個(gè)水廠單獨(dú)考慮，并分析比較ATP檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異的水廠之間的運(yùn)行差異。

2.4 敏感取樣點(diǎn)管網(wǎng)水檢測(cè)

選取包含以下4個(gè)特征的8個(gè)管網(wǎng)水取樣點(diǎn)：2019—2021年微生物超標(biāo)2次以上的管網(wǎng)水；老舊區(qū)域管網(wǎng)水；輸水距離最遠(yuǎn)(19.5 km)的管網(wǎng)水；在不同時(shí)間取樣4次并檢測(cè)ATP、菌落總數(shù)、余氯和濁度，菌落總數(shù)均未檢出的點(diǎn)位。8個(gè)取樣點(diǎn)管網(wǎng)水中ATP檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 敏感取樣點(diǎn)管網(wǎng)水的ATP檢測(cè)平均值和最值Fig.3 Average value and maximum/minimum value of ATP detection of pipe network water at sensitive sampling points

以上管網(wǎng)點(diǎn)樣品的余氯平均值為0.44 mg/L，最小值為0.15 mg/L；濁度平均值為0.24 NTU，最大值為0.44 NTU。ATP的檢測(cè)結(jié)果只有1次(2.68 pg/mL)，超過(guò)參考限值1.73 pg/mL，該樣品的余氯為0.15 mg/L，大于管網(wǎng)水要求限值0.05 mg/L。這說(shuō)明：①以前的微生物超標(biāo)情況確屬于偶發(fā)現(xiàn)象，或者生物膜突然脫落被檢出[5]，或者操作過(guò)程偶發(fā)影響因素所致；②最遠(yuǎn)端的取樣點(diǎn)距水廠19.5 km，但是ATP的最大值是1.01 pg/mL，該處管道系1996年建設(shè)的灰口鑄鐵管，數(shù)據(jù)表明管道內(nèi)的水質(zhì)受水齡和管材影響很小。③離水廠最近的老舊管道(1997年建設(shè)的灰口鑄鐵管)，其出水ATP的4次檢測(cè)值均小于1.0 pg/mL，水質(zhì)未受老舊管道影響；④這些取樣點(diǎn)微生物指標(biāo)的穩(wěn)定，很有可能與水中較高的余氯水平有關(guān)。但余氯也不宜控制得太高，否則會(huì)有消毒副產(chǎn)物增加和嗅味超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

2.5 不同工藝出水和出廠水中ATP的變化

在實(shí)驗(yàn)室里模擬不同水齡管網(wǎng)水并測(cè)試ATP。在水廠取原水、沉淀水、濾后水和出廠水，分別測(cè)定其ATP，以考察不同工藝出水中微生物量的變化；在濾后水中加入一定量的次氯酸鈉溶液，使余氯大于出廠水的余氯量，和沉淀水、出廠水一起放置一定時(shí)間測(cè)試菌落總數(shù)和ATP，以便了解在不同余氯的情況下，水中微生物量的變化情況，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 不同消毒劑接觸時(shí)間下ATP的變化趨勢(shì)Tab.3 Variation of ATP under different disinfection contact time

從檢測(cè)結(jié)果看，接觸0 h時(shí)，原水、沉淀水和濾后水余氯讀數(shù)為0.06 mg/L，但實(shí)際上當(dāng)天原水水樣未加氯，濾后水取樣點(diǎn)在加氯點(diǎn)前，所以原水、沉淀水和濾后水的余氯視為未檢出。ATP含量沿著生產(chǎn)工藝線明顯降低，沉淀水和濾后水無(wú)法及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室，未測(cè)定菌落總數(shù)，原水和出廠水的菌落總數(shù)為當(dāng)日日常取樣的檢測(cè)結(jié)果。從數(shù)值上看，從原水到出廠水，ATP的變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌落總數(shù)的變化，推測(cè)是兩種方法測(cè)定原理的差異，菌落總數(shù)是1 mL樣品經(jīng)過(guò)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)48 h后檢測(cè)的結(jié)果，檢測(cè)的只是能培養(yǎng)的異養(yǎng)好氧菌，而ATP含量反映的是50 mL樣品過(guò)濾后所有的生物量，后者顯然比前者有更強(qiáng)的代表性。放置水樣的測(cè)定結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

濾后水取回實(shí)驗(yàn)室加氯后測(cè)得的余氯值為3.8 mg/L，此時(shí)(4.0 h)測(cè)定的菌落總數(shù)和未加氯的沉淀水的菌落總數(shù)分別為4和8 CFU/mL，實(shí)際上不能據(jù)此分辨消毒效果。相比之下，沉淀水和濾后水的ATP含量卻有很大差異，而加氯后的濾后水的ATP含量和出廠水接近。

繼續(xù)放置和測(cè)定沉淀水(無(wú)氯)、濾后水(高氯)和出廠水(低氯)，23 h后濾后水和出廠水的余氯進(jìn)一步降低，ATP含量也進(jìn)一步降低，濾后水的降低更加明顯，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊挠嗦瘸掷m(xù)接觸的結(jié)果。而未加氯的沉淀水的ATP含量基本不變。

考慮到最長(zhǎng)的管網(wǎng)水停留時(shí)間(約20 h)，實(shí)驗(yàn)選取27 h的極端情況進(jìn)行測(cè)試。放置27 h后，濾后水和出廠水的余氯繼續(xù)下降，但ATP含量已經(jīng)沒(méi)有下降的空間。數(shù)據(jù)結(jié)果說(shuō)明當(dāng)前出廠水的余氯完全能抑制管網(wǎng)中微生物生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，氯的濃度和接觸時(shí)間的乘積(CT值)與ATP含量降低程度成明顯負(fù)相關(guān)，這可以解釋管網(wǎng)水的ATP含量整體上低于出廠水。

因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATP檢測(cè)除具有檢測(cè)快速、取樣量大且更有代表性的優(yōu)點(diǎn)以外，消毒前后ATP含量的變化比菌落總數(shù)的變化更大，用ATP含量來(lái)評(píng)估消毒效果更為科學(xué)。

2.6 二次供水中ATP和菌落總數(shù)之間的關(guān)系

測(cè)試了供水區(qū)域內(nèi)部分二次供水取樣點(diǎn)的ATP，包括水池進(jìn)出水和龍頭水，同時(shí)檢測(cè)菌落總數(shù)，一共71組數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)和ATP之間的關(guān)系見(jiàn)圖4，其中圖4.a為所有樣品檢測(cè)結(jié)果，包括大量未檢出菌落總數(shù)的樣品，圖4.b僅為菌落總數(shù)高于100 CFU/mL樣品。

圖4 菌落總數(shù)與ATP之間的相關(guān)性Fig.4 Correlation between bacteria and ATP

從圖4.a看，有很多樣品在菌落總數(shù)為0或者低于限值的情況下，仍有很高的ATP含量。也就是說(shuō)，菌落總數(shù)在低于限值的情況下，ATP仍可能被檢出且在較高濃度水平。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊奈⑸镌谒蟹植疾痪鶆?，菌落總?shù)取1 mL測(cè)試，ATP取50 mL進(jìn)行測(cè)試，兩者所取樣品中微生物的單位含量不盡相同；另外一種可能是因?yàn)樵谖⑸锏蜐舛人?，平皿?jì)數(shù)法檢測(cè)菌落總數(shù)有極大的選擇性，只能檢出部分微生物，因此彼此之間的一致性在這一濃度水平下并不好。從圖4.b看，在菌落總數(shù)為100～1 000 CFU/mL的水樣里，菌落總數(shù)和ATP含量仍然沒(méi)有良好的線性關(guān)系。

Narsaiah等[7]的實(shí)驗(yàn)表明，ATP含量和菌落總數(shù)之間只針對(duì)指定菌種在一定濃度范圍內(nèi)有一定相關(guān)性，比如在Bacillus、Pseudomonas、and Staphyllococcus這3種菌的人工合成樣測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诰淇倲?shù)的對(duì)數(shù)為2～8時(shí)，ATP含量和菌落總數(shù)有明顯的對(duì)數(shù)線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.88。而在出廠水和管網(wǎng)水這種微生物水平本來(lái)就很低的樣品中，很難找到ATP含量和菌落總數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，也就很難找到菌落總數(shù)限值(100 CFU/mL)所對(duì)應(yīng)的ATP含量數(shù)值。

ATP含量作為一個(gè)衡量水中微生物綜合情況的指標(biāo)，應(yīng)該擺脫菌落總數(shù)而建議一個(gè)獨(dú)立的參考限值，也可以建立一個(gè)運(yùn)行控制基準(zhǔn)線。在日常的水質(zhì)管理中，如果ATP含量超出這個(gè)基準(zhǔn)線，就可以及時(shí)檢查水廠生產(chǎn)運(yùn)行情況、管網(wǎng)污染等問(wèn)題，同時(shí)進(jìn)行其他常規(guī)指標(biāo)檢驗(yàn)。

3 結(jié)論與建議

① ATP檢驗(yàn)技術(shù)用于自來(lái)水中微生物的檢測(cè)，和菌落總數(shù)相比具有檢測(cè)更快速、檢測(cè)細(xì)菌更全面、操作更方便的特點(diǎn)，可以用于對(duì)水廠消毒效果的確認(rèn)，從而及時(shí)調(diào)整工藝；也可以用于水質(zhì)管理的應(yīng)急檢驗(yàn)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能的微生物污染。

② ATP含量和菌落總數(shù)在出廠水和管網(wǎng)水樣品中沒(méi)有明顯的相關(guān)性，不能參考菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)限值計(jì)算ATP含量的限值。在具體應(yīng)用中，需要根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的水質(zhì)特點(diǎn)，建立獨(dú)立的基準(zhǔn)線，通過(guò)基準(zhǔn)線去評(píng)估檢測(cè)結(jié)果是否正常。