植物乳桿菌LNL2-4-2對互隔交鏈孢霉的抑制作用

呂欣然，高永悅，杜 宏，葛永紅，勵建榮，白鳳翎

（渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧錦州 121013）

互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）隸屬于半知菌亞門、暗色孢科、交鏈孢屬，是一種廣泛存在于自然環(huán)境中的真菌?；ジ艚绘滄呙箍梢援a(chǎn)生互隔交鏈孢酚、細交鏈孢菌酮酸和互隔交鏈孢酚單甲醚等致病因子，引起采后蘋果、梨、西蘭花、胡蘿卜等果蔬的黑斑病和枯萎病，造成一定的經(jīng)濟損失[1-2]。通常用化學殺菌劑控制互隔交鏈孢霉的危害，然而，其存在藥物殘留，產(chǎn)生抗藥性和污染環(huán)境等問題。目前急需研發(fā)一種無殘留、無毒副作用和環(huán)境友好型的天然殺菌劑。Pane 等[3]研究發(fā)現(xiàn)野生辣椒提取物對互隔交鏈孢霉具有拮抗活性，以劑量依賴的方式影響菌絲體生長，抑制分生孢子萌發(fā)，菌絲體抑制率為43%～82%，孢子萌發(fā)抑制率為40%～53%，同時，可顯著減少人工感染的成熟番茄軟腐病發(fā)生。張偉等[4]發(fā)現(xiàn)鹿蹄草素對鏈格孢菌的抑制作用隨質(zhì)量濃度升高而增強，當質(zhì)量濃度為2.50，5.00 g/L 時，抑菌率均達100%。植物源活性物質(zhì)對互隔交鏈孢霉的抑制作用研究較多，而微生物制劑對互隔交鏈孢霉的抑制作用研究較少。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為一種生物制劑，其能夠分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸、脂肪酸、過氧化氫、羅伊氏菌素和細菌素，來抑制細菌和真菌的生長[5]。李院等[6]從醬菜中分離3 株對青霉及曲霉有較強拮抗作用的乳酸菌L511、L520、L544，它們的抑菌圈直徑均大于18 mm。石金鑫[7]從發(fā)酵食品中分離篩選出2 株對擴展青霉和黑曲霉有較強拮抗活性的乳酸菌SC3 和PC3，對擴展青霉的抑制率分別為61.92%和62.62%，對黑曲霉抑制率分別為65.96%和76.03%。Lv 等[8]篩選獲得1 株植物乳桿菌C10，對粉紅單端孢有顯著抑制作用，抑制率達93.93%；在甜瓜感染粉紅單端孢的體外應用研究中，經(jīng)植物乳桿菌C10 處理，感染區(qū)面積減少了19.58%。然而，目前乳酸菌對互隔交鏈孢霉的抑制作用鮮有研究報道。

本文以來自典型蘋果黑斑病果實的互隔交鏈孢霉為研究對象，采用菌餅法從發(fā)酵蔬菜中分離篩選對互隔交鏈孢霉有較強抑制作用的乳酸菌。研究不同濃度乳酸菌處理對互隔交鏈孢菌絲生長及孢子萌發(fā)、孢子膜完整性、丙二醛、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量以及超微結(jié)構(gòu)的影響，闡明乳酸菌對互隔交鏈孢霉的拮抗機制；并進一步探究乳酸菌對蘋果黑斑病的控制作用。本研究以期為研發(fā)乳酸菌生物制劑控制果蔬采后病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）菌株Bd-12：分離自典型蘋果黑斑病果實。

乳酸菌菌株：LNL1-4、LNL1-5、LNL2-4-1、LNL2-4-2、LNL2-5 分離自遼寧錦州百合食品有限公司腌漬蘿卜。

以上菌種均保藏于本院微生物學與分子生物學實驗室。

富士蘋果，遼寧省錦州市科技路市場。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、MRS 液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB），北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；Taq PCR Master mix、細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、DNA marker-D，生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天合微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；GI54DS 高壓滅菌鍋，至微儀器有限公司；DLCJ-2N 超級潔凈工作臺，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；THZ-D 臺式恒溫振蕩器，太倉市試驗設(shè)備廠；尼康Ti-s 雙端口倒置顯微鏡，上海衡浩儀器有限公司；UV2550 紫外分光光度計，日本島津；DDSJ-308A 電導率儀，上海精密儀器儀表有限公司；S-4800 掃描電鏡，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離 參照文獻[9]將準備好的錦州發(fā)酵蘿卜切成2 cm×2 cm 的塊狀，放入無菌生理鹽水中浸泡15 min，取樣品浸泡液1.0 mL 倒入生理鹽水制成10 倍稀釋液。在無菌條件下，吸取0.1 mL 稀釋液涂布在1.0%碳酸鈣的MRS 培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取具有溶鈣圈的白色單菌落在MRS 培養(yǎng)基上分區(qū)劃線純化，重復上述操作3 次，并進行革蘭氏染色和過氧化氫試驗。將純化后菌株接種于MRS 斜面，置于-20 ℃條件下保藏備用。

1.3.2 對互隔交鏈孢霉具有抑制活性乳酸菌的篩選 取保藏乳酸菌菌株以2.0%接種量在MRS 肉湯中活化，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活化至3 代。體外菌絲體生長的測量按照Tatsadjieu 等[10]的方法并稍作修改，將活化好的乳酸菌菌懸液以1.0%接種量分別添加在PDA 培養(yǎng)基平板表面，并用涂布器涂均勻，然后接種互隔交鏈孢霉菌餅。以MRS 液體培養(yǎng)基作對照，26 ℃避光培養(yǎng)7 d，觀察菌絲生長，測定其菌落直徑。當對照組平板中菌絲長滿平板表面時，用游標卡尺交叉測量菌落生長直徑（mm），并按式（1）計算乳酸菌對互隔交鏈孢霉的抑菌率。分析比較不同乳酸菌對互隔交鏈孢霉的抑菌效果，篩選1 株對互隔交鏈孢霉生長有較強拮抗作用的菌株，進行后續(xù)試驗。

式中，d0——對照組互隔交鏈孢霉菌落直徑（mm）；d1——試驗組互隔交鏈孢霉菌落直徑（mm）；d2——原菌餅直徑（mm）。

1.3.3 乳酸菌菌株鑒定 生理生化反應：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》對乳酸菌菌株進行生理生化鑒定[11-12]。

16S rDNA 序列鑒定：參照文獻[13]，PCR 應用25 μL 擴增反應體系：擴增引物為27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′，1492r：5′ -TACGGYTACCTTTGTTACGACTT -3′ 各 1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。PCR 擴增反應程序：94 ℃2 min，94 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃90 s，循環(huán)30 次，4℃保溫。PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳并照相，將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 同源性比對，MEGA5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.4 乳酸菌對互隔交鏈孢霉菌絲體的拮抗活性研究 將不同濃度（101，102，103，104，105，106，107，108，109CFU/mL） 的乳酸菌菌懸液按1.3.2 節(jié)的方法進行試驗，分析不同濃度乳酸菌對互隔交鏈孢霉菌絲體的拮抗作用。

1.3.5 乳酸菌對互隔交鏈孢霉孢子萌發(fā)的抑制作用 參照K?vanc 等[14]方法并稍作修改，向培養(yǎng)7 d長滿互隔交鏈孢霉的PDA 培養(yǎng)基中添加10.0 mL無菌水，刮下孢子后使用400 目無菌紗布過濾。用無菌水制成1.0×106spores/mL 的孢子懸浮液，備用。將孢子懸浮液與不同濃度乳酸菌菌懸液按照1∶1 混合均勻，取200 μL 混合液加入PDA 培養(yǎng)基，涂布器涂布均勻。封口膜密封，26 ℃恒溫培養(yǎng)。接種后每隔2 h 將不同濃度乳酸菌處理的菌種制片，在倒置顯微鏡下觀察其孢子萌發(fā)形態(tài)，并用計數(shù)器計數(shù)，每個濃度3 組數(shù)據(jù)，每組計1.0×102孢子。

1.3.6 乳酸菌對互隔交鏈孢霉抑菌機制研究

1.3.6.1 對互隔交鏈孢霉細胞膜完整性的影響參照夏曉明等[15]方法并稍作修改。將1.0×106spores/mL 的孢子懸浮液加入100 mL 的PDB 液體培養(yǎng)基中，搖床120 r/min 培養(yǎng)3 d 后，加入一定量的乳酸菌，以不加乳酸菌為陽性對照，只加乳酸菌為陰性對照。立即取出5.0 mL，用DDSJ-308A 電導率儀測定電導率，繼續(xù)培養(yǎng)2，4，6，8 h，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，將沉淀重懸于無菌水中測電導率，95 ℃水浴30 min 后冷卻至室溫測定最終電導率。相對電導率由式（2）計算：

式中，D1——初始電導率（μS/cm）；D2——最終電導率（μS/cm）。

1.3.6.2 對互隔交鏈孢霉胞外泄漏物的影響將1.0×106spores/mL 孢子懸浮液加入到100 mL PDB 中，26 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d 后加入乳酸菌，以不加乳酸菌為陰性對照組，只加乳酸菌為陽性對照組。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取培養(yǎng)液，于12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液用于丙二醛含量、可溶性蛋白以及可溶性糖含量的檢測。

丙二醛含量測定：參考文獻[16]測量丙二醛含量，取上述所得上清液2 mL，加入2 mL 0.5%的硫代巴比妥酸（溶于15%的三氯乙酸），混勻后沸水中放置20 min，冷卻后4 ℃，12 000 r/min 離心20 min。上清液分別在450，532，600 nm 波長處測定其吸光值。按公式（3）計算丙二醛含量：

可溶性蛋白含量測定：參考Bradford[17]的方法，取1 mL 上述上清液，加入5.0 mL 考馬斯亮藍G250 溶液，靜置2 min 測定OD595nm值。

可溶性糖含量測定：參照Morris[18]的方法，采用蒽酮比色法對胞外可溶性糖進行定量分析。取0.2 mL 上清液加入0.6 mL 蒸餾水與0.2 mL 蒽酮試劑混合，再加入2.0 mL 濃硫酸，沸水中放置1 min，冷卻后測定OD630nm值。

1.3.6.3 乳酸菌對互隔交鏈孢霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響 掃描電鏡樣品的制作：參考文獻[19]并稍作修改，將1.0 mL 孢子懸浮液（1.0×106spores/mL）與1.0 mL 乳酸菌菌懸液（1.0×109CFU/mL）混合，以不加乳酸菌菌懸液為對照組，在26 ℃200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，去上清。將沉淀用PBS（pH 6.8）洗滌3 次后，在4 ℃條件用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛固定12 h 后，PBS 溶液洗3 次，每次10 min；再用體積分數(shù)為1%的鋨酸溶液4 ℃下固定2 h 左右，用PBS 溶液洗3 次；將樣品用體積分數(shù)為30%，50%，70%，95%，100%的乙醇各脫水15 min。膠頭滴管吸取1滴于潔凈蓋玻片上，空氣干燥，真空噴金鏡檢。

1.3.7 乳酸菌對接種互隔交鏈孢霉的蘋果果實病變的影響 參照葛永紅等[20]方法并稍作修改。選擇大小、色澤和成熟度相似且無損傷的蘋果果實，用70%酒精對蘋果表面進行消毒，然后用無菌注射器在蘋果表面制備3 個小孔 （每個小孔深2 mm×寬2 mm），無菌風風干后，將0，101，103，105，107，109CFU/mL 的乳酸菌菌懸液20 μL 注射到每個小孔中。無菌風再次風干，在每個小孔中接種

20 μL 互隔交鏈孢霉孢子懸浮液 （1.0×106spores/mL）。處理后的蘋果用自封袋封起，并在自封袋留下呼吸孔，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d，相對濕度為70%～80%。記錄接種后2，4，6 d 的蘋果病變直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗重復3 次，數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示。SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

通過對錦州發(fā)酵蘿卜進行切塊、浸泡、培養(yǎng)、分離純化等操作，共分離得到有溶鈣圈、革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的40 株乳酸菌菌株，圖1 是菌株LNL2-4-2 的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果，由圖1a 可知，菌落呈乳酸菌典型生長特征：乳白色，表面光滑整齊，中央凸起，由圖1b 可知菌株LNL2-4-2 為革蘭氏陽性菌，直桿狀排列，無鞭毛，無芽孢。

圖1 菌株LNL2-4-2 的菌落形態(tài)圖（a）和革蘭氏染色圖（b，1 000×）Fig.1 Colony morphology （a） and Gram stain（b，1 000×） of strain LNL2-4-2

2.2 篩選對互隔交鏈孢霉具有拮抗活性的乳酸菌

表1是從40 株乳酸菌中篩選出對互隔交鏈孢霉有抑制作用的菌株及其抑菌率結(jié)果。從表1可以看出：菌株LNL2-4-2 的抑菌率達80.86%，效果最好；LNL1-5、LNL2-4-1 和LNL1-4 效果次之，分別為75.45%，72.16%，70.58%；LNL2-5 效果較差，抑菌率為60.29%。綜上所述，選擇菌株LNL2-4-2 進行后續(xù)試驗。

表1 乳酸菌對互隔交鏈孢霉的抑制作用Table 1 Inhibition rate of lactic acid bacteria against Alternaria alternata

2.3 乳酸菌菌株鑒定

2.3.1 生理生化鑒定 菌株LNL2-4-2 生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》可初步判斷菌株LNL2-4-2 為乳桿菌屬。

表2 菌株LNL2-4-2 生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test results of strain LNL2-4-2

2.3.2 16 S rDNA 鑒定 菌株LNL2-4-2 16S rDNA 基因擴增電泳圖如圖2所示。將PCR 產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 500 bp 左右出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標片段被成功擴增。菌株LNL2-4-2 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，由圖可知，菌株LNL2-4-2 和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） MF369877.1 的16S rDNA 最為相似，支持率為99%?？纱_證菌株LNL2-4-2 為植物乳桿菌。

圖2 菌株LNL2-4-2 的16S rDNA 基因擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA gene of strain LNL2-4-2

圖3 菌株LNL2-4-2 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree for sequences of strain LNL2-4-2

2.4 乳酸菌對互隔交鏈孢霉菌絲體的抑制作用

圖4是不同濃度植物乳桿菌LNL2-4-2 對互隔交鏈孢霉菌絲體生長的抑制結(jié)果，從圖中可以看出，不同濃度的乳酸菌對互隔交鏈孢霉菌絲的生長均有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越好。當植物乳桿菌LNL2-4-2 濃度為109CFU/mL 時，對互隔交鏈孢霉的菌絲體抑制作用最強（圖4A），抑制率為80.86%±0.32%（圖4B），可以顯著抑制菌絲體的生長（P<0.05）。

圖4 不同濃度植物乳桿菌LNL2-4-2 對互隔交鏈孢霉菌絲體抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of Lactobacillus plantarum LNL2-4-2 on the mycelium of A.alternata

2.5 乳酸菌對互隔交鏈孢霉孢子的抑制作用

圖5為不同濃度植物乳桿菌LNL2-4-2 對孢子萌發(fā)的抑制作用。由圖5可知隨著乳酸菌濃度升高，對孢子的抑制作用增強。培養(yǎng)10 h 后，對照組萌發(fā)率為91.67%，菌株LNL2-4-2 濃度為109CFU/mL 的處理組抑制率為48.00%，顯著抑制孢子萌發(fā)（P<0.05）。本文的研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻報道一致，楊曉蕾等[21]將枯草芽孢桿菌JR-C 處理梨黑斑病菌孢子懸浮液時發(fā)現(xiàn)，拮抗菌JR-C 代謝產(chǎn)物可顯著抑制孢子萌發(fā)，且隨著濃度的增加抑制效果越好。綜上所述，濃度為109CFU/mL 的植物乳桿菌LNL2-4-2 對互隔交鏈孢霉菌絲體生長和孢子萌發(fā)的抑制效果顯著，選用濃度109CFU/mL 的菌株LNL2-4-2 探究抑菌機理。

圖5 不同濃度植物乳桿菌LNL2-4-2 對互隔交鏈孢霉孢子萌發(fā)的影響Fig.5 Effect of different concentrations of Lactobacillus plantarum LNL2-4-2 on the germination of A.alternata spores

2.6 乳酸菌對互隔交鏈孢霉抑菌機理研究

2.6.1 對互隔交鏈孢霉細胞膜完整性的影響細胞膜的完整性是維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定代謝的重要基礎(chǔ)，當其被破壞時，會導致細胞內(nèi)電解質(zhì)外流，因此，通常選用檢測電導率來檢測細胞膜完整性[22]。圖6表示菌株植物乳桿菌LNL2-4-2 處理對互隔交鏈孢霉電導率的影響。由圖可知，隨著作用時間的延長，未處理的互隔交鏈孢霉組、乳酸菌組以及乳酸菌處理的互隔交鏈孢霉相對電導率逐漸下降，然而乳酸菌處理互隔交鏈孢霉組的下降速率顯著高于未處理的互隔交鏈孢霉組和乳酸菌組（P<0.05），表明菌株LNL2-4-2 處理互隔交鏈孢霉后，其胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏值顯著高于未處理的互隔交鏈孢霉和乳酸菌組。有研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol/L 硝普鈉處理粉紅單端孢（Trichothecium roseum）1.5 h 后，胞內(nèi)電導率下降速率顯著高于對照組[23]，該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

圖6 植物乳桿菌LNL2-4-2 對互隔交鏈孢霉電導率的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus plantarum LNL2-4-2 on the integrity of A.alternata cell membrane

2.6.2 對互隔交鏈孢霉胞外泄漏物的影響 丙二醛（MDA）是衡量脂質(zhì)過氧化程度的主要標志物，MDA 含量顯著增加，表明病原體脂質(zhì)過氧化程度嚴重，進而導致其細胞膜的重度氧化損傷[24]，這加劇了對膜完整性的損害，并導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和糖類析出，從而使胞外蛋白含量和可溶性糖含量增加。植物乳桿菌LNL2-4-2 處理對互隔交鏈孢霉的丙二醛、胞外蛋白、可溶性糖含量的影響如圖7所示。

由圖7a 可知，未處理的互隔交鏈孢霉組丙二醛含量基本保持不變，乳酸菌組以及乳酸菌處理的互隔交鏈孢霉組在0～4 h 隨時間的延長丙二醛含量增加，4～8 h 隨時間的延長丙二醛含量呈下降趨勢，然而乳酸菌處理的互隔交鏈孢霉組丙二醛含量始終顯著高于未處理的互隔交鏈孢霉組（P<0.05），表明植物乳桿菌LNL2-4-2 處理刺激了互隔交鏈孢霉細胞膜脂質(zhì)過氧化。這一結(jié)果與Li 等[25]用對香豆酸乙酯（EpCA）作用于互隔交鏈孢霉的研究結(jié)果相一致。與對照組相比，分別用100，800 μg/mL EpCA 處理互隔交鏈孢霉，MDA 含量分別增加了1.06 倍和1.59 倍。

圖7 植物乳桿菌LNL2-4-2 對A.alternata 丙二醛（a）、胞外蛋白（b）、可溶性糖（c）含量的影響Fig.7 Effects of Lactobacillus plantarum LNL2-4-2 on the contents of A.alternata malondialdehyde （a），extracellular protein （b） and soluble sugar （c）

圖7b 中，未處理的互隔交鏈孢霉組、乳酸菌組以及乳酸菌處理的互隔交鏈孢霉組的胞外蛋白含量均隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷上升，而植物乳桿菌LNL2-4-2 處理后的蛋白含量顯著高于另外2 組（P<0.05）。Rocha 等[26]使用2.5 mmol/L 水楊酸（SA）處理擴展青霉30 min 后導致可溶性蛋白質(zhì)泄漏達3.2 μg/g，而對照組為1.8 μg/g，該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

糖類是細胞在生長過程中必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，圖7c 中，未處理的互隔交鏈孢霉組與乳酸菌組可溶性糖含量均隨時間的延長而逐漸上升，乳酸菌處理的互隔交鏈孢霉組在0～6 h 的可溶性糖含量逐漸升高，而6～8 h 開始呈下降趨勢，處理組可溶性糖含量均顯著高于其它2 組的含量（P<0.05）。Li 等[27]用800 mg/L 對羥基苯甲酸甲酯（MpCA）處理互隔交鏈孢霉，可溶性糖含量在培養(yǎng)5 h 后比對照組高8.9 倍。該結(jié)果與本研究結(jié)果類似。由此可知，植物乳桿菌LNL2-4-2 處理互隔交鏈孢霉后對其細胞膜完整性有一定的破壞作用。

2.7 乳酸菌對互隔交鏈孢霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響

圖8為植物乳桿菌LNL2-4-2 處理互隔交鏈孢霉孢子后掃描電鏡觀察結(jié)果。從圖中可以看出，對照組孢子形態(tài)為倒梨形，結(jié)構(gòu)完整，表面較光滑。經(jīng)植物乳桿菌LNL2-4-2 處理后，有大量乳酸菌附著在孢子表面，使其表面出現(xiàn)褶皺，邊緣模糊，頂端破裂，有內(nèi)容物泄漏，結(jié)構(gòu)完整性被破壞。表明菌株LNL2-4-2 對互隔交鏈孢霉孢子細胞膜有一定的損傷作用，從而破壞其細胞膜的完整性，使其胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，該結(jié)果與2.6 節(jié)的測定結(jié)果相一致。

圖8 植物乳桿菌LNL2-4-2 對A.alternata孢子超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of Lactobacillus plantarum LNL2-4-2 on the ultrastructure of A.alternata spores

2.8 乳酸菌對接種互隔交鏈孢霉的蘋果果實病變的影響

如圖9所示，病變直徑隨貯存時間延長而增加，不同濃度的植物乳桿菌LNL2-4-2 會抑制接種互隔交鏈孢霉的蘋果果實病變直徑的增長。在第2 天，與對照相比，除了109CFU/mL 處理組顯著促進病變直徑的增加，濃度為101CFU/mL 和107CFU/mL 處理組與對照無明顯差異，103CFU/mL 和105CFU/mL 處理組對互隔交鏈孢霉抑制作用顯著。在第4 天和第6 天，各濃度處理組均可顯著抑制蘋果果實的損傷直徑，其中103CFU/mL 的植物乳桿菌LNL2-4-2 抑制效果最好，105，107，109CFU/mL 處理組抑制作用無顯著性差異（P>0.05）。在第2，4，6 天中103CFU/mL 的植物乳桿菌LNL2-4-2 對蘋果損傷直徑的抑制率分別為26.97%，27.48%，47.24%。李燦嬰等[28]研究了不同濃度的植物乳桿菌XCT1-10 對接種灰葡萄孢菌的蘋果損傷直徑的影響，結(jié)果表明，較低濃度106CFU/mL 的植物乳桿菌XCT1-10 可顯著降低蘋果果實損傷直徑，高濃度的植物乳桿菌XCT1-10 會增加蘋果果實損傷直徑，可推測高濃度的植物乳桿菌LNL2-4-2 會增加互隔交鏈孢霉的侵染程度，原因可能是植物乳桿菌LNL2-4-2 可能會分泌某些促進互隔交鏈孢霉生長的代謝物質(zhì)。上述研究與本研究結(jié)果類似，說明植物乳桿菌LNL2-4-2 可作為水果保鮮的生物防治劑。

圖9 不同濃度植物乳桿菌LNL2-4-2 對接種互隔交鏈孢霉的蘋果損傷直徑的影響Fig.9 Effects of different concentrations of Lactobacillus plantarum LNL2-4-2 on the damage diameter of apples inoculated with Alternaria alternata

3 結(jié)論

本文從發(fā)酵蔬菜分離的乳酸菌中篩選出對互隔交鏈孢霉有顯著抑制作用的植物乳桿菌LNL2-4-2，抑制率為80.86%。此外，菌株LNL2-4-2 可抑制互隔交鏈孢霉離體菌絲生長和孢子萌發(fā)，且隨著濃度升高，抑制作用增強。濃度為109CFU/mL的乳酸菌處理互隔交鏈孢霉孢子后，使其細胞膜完整性降低，孢外丙二醛、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量增加。超微結(jié)構(gòu)圖像顯示菌株LAL2-4-2破壞了霉菌孢子的細胞膜，導致孢子表面皺縮，頂端破裂使其內(nèi)容物泄漏。植物乳桿菌LNL2-4-2對互隔交鏈孢霉的作用位點是其孢子的細胞膜，通過膜損傷來發(fā)揮拮抗作用。植物乳桿菌LNL2-4-2 在體外對感染互隔交鏈孢霉的蘋果具有保鮮防腐作用，因此植物乳桿菌LNL2-4-2 可作為抑制互隔交鏈孢霉的出發(fā)菌株，為研發(fā)控制果蔬采后腐敗變質(zhì)的生物制劑提供理論基礎(chǔ)。