山西平陸野葛根愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)條件篩選

張 靜，王剛獅，劉瑞霞，時(shí)寶凌，廉梅霞

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030009）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料選用新鮮采挖的山西運(yùn)城平陸縣野生葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi作為外植體。試劑為植物激素：2,4-D，6-BA，KT；蔗糖，瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 MS、B5基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)野葛根愈傷組織情況

選擇直徑約1 cm、外表皮無破損的根，切成10 cm 的長(zhǎng)段，進(jìn)行外植體消毒。先放入75% 的酒精溶液中30 s，用鑷子取出后，再倒入0.2% 的HgCl2水溶液中浸泡8 min，取出后用無菌水沖洗5～6 次。在超凈工作臺(tái)將滅菌后的根段切成0.5 cm 長(zhǎng)的小段，接種于B5培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基中，激素種類和濃度一致，均為2 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT。2 種培養(yǎng)基分別接種20 瓶，每瓶4 段外植體，置于培養(yǎng)箱中，條件為25℃、黑暗培養(yǎng)。每隔3 d 觀察培養(yǎng)情況，記錄生長(zhǎng)狀況，30 d 后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.2 不同外源植物激素的添加對(duì)野葛愈傷組織誘導(dǎo)情況

在MS 基本培養(yǎng)基中添加外源激素，分別為2,4-D、6-BA、KT、NAA，激素的配比和濃度見正交試驗(yàn)表1。試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 外源植物激素對(duì)野葛愈傷組織誘導(dǎo)影響正交試驗(yàn)Tab.1 The orthogonal effects of exogenous phytohormones on induction of wild callus

1.2.3 愈傷組織生長(zhǎng)曲線繪制及不同時(shí)期總黃酮含量測(cè)定

稱取上一步培養(yǎng)的愈傷組織1.0±0.1 g，要求質(zhì)地松軟，長(zhǎng)勢(shì)良好。接種于繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：MS+蔗糖3%+0.6% 瓊脂+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT。培養(yǎng)條件不變，黑暗、25℃。共接種90 瓶。培養(yǎng)周期為30 d，每隔2 d 取出6 瓶，用天平稱量愈傷組織的鮮質(zhì)量并記錄。之后低溫烘干，取0.2 g 粉末，放入具塞錐形瓶中，加入20 mL 70% 的酒精，超聲波處理30 min，溫度為70℃，冷卻、過濾，等濃度的酒精定容至20 mL容量瓶中，用分光光度法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.4 光照條件對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮合成的影響

將接種的愈傷組織90 瓶，平均分成3 組。每組采用不同的光照周期：分別為24 h光照、16 h光照+8 h黑暗、24 h黑暗。培養(yǎng)30 d 后，稱量愈傷組織鮮質(zhì)量，記錄。低溫烘干，提取、分光光度法測(cè)定不同光照時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響。

2 結(jié)果

2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)野葛根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

根據(jù)外植體出愈時(shí)間、愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織細(xì)胞狀態(tài)來評(píng)價(jià)愈傷組織誘效果。由表2可知：MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的效果最好，誘導(dǎo)率為95%。接種外植體后的第10 d，在根的橫斷面、去掉表皮的根表面，均長(zhǎng)出淡黃色、質(zhì)地松軟的愈傷組織圖1（1）。在培養(yǎng)25 d時(shí)，愈傷組織數(shù)量明顯增多，細(xì)胞疏松，分散性好，顏色鮮艷，質(zhì)地軟嫩。相比較B5培養(yǎng)基中的愈傷組織，出現(xiàn)時(shí)間較晚，在18 d 才初露少量的細(xì)胞，后期生長(zhǎng)速度緩慢，分散性差，顏色為黃褐色。

表2 基本培養(yǎng)基對(duì)野葛根愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 The effects of basic media on induction of callus

2.2 不同植物激素對(duì)野葛根愈傷組織誘導(dǎo)的影響

使用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)極差分析，見表3。

由表3極差R可知，2,4-D是影響野葛根愈傷組織誘導(dǎo)的最主要影響因素。最優(yōu)激素組合為：A3B2C2D2。即：2.0 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L KT+ 1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA。

表3 不同激素對(duì)野葛愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 The effects of different hormones on induction of callus

2.3 愈傷組織生長(zhǎng)曲線與不同時(shí)期總黃酮含量測(cè)定

在接種10 d 后，外植體的斷面開始形成黃白色的愈傷組織，在生長(zhǎng)17 d時(shí)體積增大一倍，鮮質(zhì)量為2.74 g，見圖1（2），在生長(zhǎng)26 d 時(shí)，愈傷組織幾乎擴(kuò)張至整瓶，鮮質(zhì)量高達(dá)為7.51 g，見圖1（3）；在培養(yǎng)28 d后，愈傷組織細(xì)胞停止生長(zhǎng)，甚至有些開始死亡，顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，鮮質(zhì)量在30 d時(shí)下降為6.67 g，見圖1（4）。生長(zhǎng)曲線見圖2。

由圖2 可知：0～10 d 為愈傷組織生長(zhǎng)的延滯期，10～22 d為愈傷組織指數(shù)生長(zhǎng)期，22～26 d 為穩(wěn)定期，26～30 d 為衰亡期。總黃酮的含量與細(xì)胞生長(zhǎng)量呈正相關(guān)。延滯期總黃酮含量最低，為1.35%；在指數(shù)生長(zhǎng)期，總黃酮含量迅速增高，在26 d時(shí)含量高達(dá)15.17%；到衰亡期總黃酮含量開始下降。

圖2 野葛根愈傷組織生長(zhǎng)曲線與總黃酮含量變化Fig.2 The growth curve and callus total flavonoids content

2.4 光照時(shí)間對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮合成的影響

由圖3可知：在光照24 h條件下，愈傷組織顏色為黃褐色圖1（5），鮮質(zhì)量為7.56 g，總黃酮含量為16.75%。24 h黑暗條件下，愈傷組織為黃白色圖1（6），鮮質(zhì)量6.3 g，總黃酮含量為14.83%。在16 h 光照+8 h 黑暗條件培養(yǎng)下，愈傷組織為淡黃色圖1（7），鮮質(zhì)量為7.60 g，總黃酮含量為15.30%。因此，最適合愈傷組織培養(yǎng)的條件為16 h光照+8 h黑暗。

圖1 愈傷組織變化Fig.1 The changes of callus

圖3 光照時(shí)間對(duì)野葛細(xì)胞生長(zhǎng)及總黃酮合成的影響Fig.3 The effects of light time on wild Ge cell growth and total flavonoid synthesis

3 討論

3.1 最適合野葛根愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS 基本培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基的作用是為植物細(xì)胞提供基本的營(yíng)養(yǎng)，常用的基本培養(yǎng)基有4 中MS、B5、N6 和White。其中MS 培養(yǎng)基在組織培養(yǎng)中被廣泛使用，因?yàn)槠渚哂休^高濃度的無機(jī)鹽。而B5培養(yǎng)基中銨鹽含量低，適用于雙子葉植物的組織培養(yǎng)以及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)[1]；N6 培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分簡(jiǎn)單，氮源含量低，適用于谷類植物的花藥培養(yǎng)；White 培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度低，一般用于生根培養(yǎng)[2]。

本試驗(yàn)選取MS 和B5 基本培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：在愈傷組織誘導(dǎo)階段，MS 培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo)率高，細(xì)胞分散性好，是理想的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

3.2 多種激素協(xié)同作用可以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率

一般情況下，在培養(yǎng)基中外植體脫分化形成愈傷組織，與所添加的外源植物激素的種類、濃度和配比有很大的關(guān)系。外源激素起著傳遞信號(hào)的作用，其作用效果與外植體中內(nèi)源激素的種類和濃度密切相關(guān)，外源激素通過內(nèi)源激素發(fā)揮作用[3]。因此，只有合理地使用各種外源激素，才能適應(yīng)外植體對(duì)激素的特定要求，充分發(fā)揮激素的調(diào)節(jié)作用，從而誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生[4]。

2,4-D對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效[5]，一般情況下，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的2,4-D 的濃度多為0.1～2.0 mg/L。在本試驗(yàn)中，單純使用2,4-D 時(shí)，愈傷組織可以快速形成，但細(xì)胞呈黏液化，因此，需要與其他的細(xì)胞分裂素一起使用，保證細(xì)胞呈現(xiàn)很好的顆粒狀與分散性。NAA 雖然不是愈傷組織誘導(dǎo)中重要的植物激素，但很多研究表明，NAA 對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)也有很重要的影響。林婭等[6]和龍?chǎng)┖鏪7]分別發(fā)現(xiàn)在月季和蘿卜愈傷組織的誘導(dǎo)中NAA的效果優(yōu)于2,4-D；田文忠[8]在含2.0 mg/L 2,4-D 的培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L KT 和1.0 mg/L NAA后，愈傷組織不再粘液化，并且顆粒增多。因此，本試驗(yàn)選擇將NAA 作為誘導(dǎo)愈傷組織的激素，與2,4-D、KT 一起使用，得到了分散性好的疏松、顆粒狀的愈傷組織。

3.3 在愈傷組織指數(shù)生長(zhǎng)末期總黃酮含量最高

愈傷組織的生長(zhǎng)過程是細(xì)胞分裂的過程，而細(xì)胞的分裂需要培養(yǎng)基為其提供養(yǎng)分，隨著細(xì)胞量的增多，培養(yǎng)基中的養(yǎng)分會(huì)逐漸消耗，錐形瓶的空間也會(huì)逐漸減小，而細(xì)胞的代謝產(chǎn)物隨著細(xì)胞生長(zhǎng)的積累也會(huì)逐漸增多，過多的次級(jí)代謝產(chǎn)物又會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，因此，為了確定最適的繼代培養(yǎng)周期，本試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定。

植物細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)程大致相同，生長(zhǎng)曲線呈“S”型。包括4 個(gè)時(shí)期：①延遲期。指剛接入培養(yǎng)基的細(xì)胞還未適應(yīng)新的環(huán)境，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的時(shí)期。②指數(shù)生長(zhǎng)期。指經(jīng)過延遲期的適應(yīng)，加之培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)充足，細(xì)胞迅速生長(zhǎng)的時(shí)期。③穩(wěn)定期。指隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩，細(xì)胞的死亡率等于生長(zhǎng)率的時(shí)期。④衰亡期。指培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，細(xì)胞死亡率大于生長(zhǎng)率的時(shí)期[9]。在本研究中通過愈傷組織生長(zhǎng)曲線，可以看出野葛愈傷組織的停滯期較長(zhǎng)，為10 d；整個(gè)生長(zhǎng)周期為28 d左右，總黃酮在26 d左右達(dá)到最大。這一結(jié)果與陳剛等[10]的研究結(jié)果相一致。在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞一般會(huì)在指數(shù)生長(zhǎng)期后期，由初生代謝進(jìn)入次生代謝[11]，因而在穩(wěn)定期末期可以獲得最高的次級(jí)代謝產(chǎn)物量。

3.4 光周期培養(yǎng)有利于野葛愈傷組織生長(zhǎng)與總黃酮的合成

光不僅是植物進(jìn)行光合作用的能量來源，也作為重要的環(huán)境信號(hào)調(diào)節(jié)植物的基因表達(dá)、影響酶活性以及植物的形態(tài)建成等[2]。光照對(duì)藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的影響主要體現(xiàn)在光質(zhì)、光強(qiáng)和光照時(shí)間上[12]。許多研究均表明，光照有利于植物細(xì)胞中黃酮物質(zhì)的合成。如陳學(xué)森[13]將銀杏愈傷組織在不同光照條件下培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)光照培養(yǎng)所得黃酮是暗培養(yǎng)的3 倍。許多研究[14]也證明光照可以加強(qiáng)黃酮生物合成過程中的關(guān)鍵酶（PAL）的活性。但是，光照時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起脅迫，導(dǎo)致產(chǎn)生酚類化合物，導(dǎo)致褐化的發(fā)生。因此，獲得高生物量和獲得高次級(jí)代謝產(chǎn)物的條件往往是矛盾的，尋找恰當(dāng)?shù)墓庵芷谑谦@得高產(chǎn)與高效成分的關(guān)鍵。本研究的光周期為16 h光照+8 h黑暗此時(shí)，生物量與總黃酮含量均較高。