人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療胰腺損傷的研究進(jìn)展

韓 麗，陳思平，周世波，周黎晨，趙治戎，吉 華，戴睿武

1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610031；2.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科，成都 610083

胰腺損傷是現(xiàn)代交通事故、災(zāi)害條件下因創(chuàng)傷所致的一類(lèi)傷情事件，由于其并發(fā)癥多、病死率高，成為現(xiàn)代急救醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。但目前，有關(guān)胰腺毀損組織的修復(fù)機(jī)制以及后續(xù)內(nèi)分泌細(xì)胞損傷有效抑制措施的研究仍較為缺乏[1]。胰腺作為腹膜間位器官，位于腹腔內(nèi)多種臟器的深面，由于其特殊的解剖位置，損傷后不易發(fā)現(xiàn)，常延誤最佳治療時(shí)機(jī)，加之其富含大量胰源性消化酶，可以引起創(chuàng)傷后再次損傷效應(yīng)[2-3]。其次，胰腺損傷發(fā)生后胰酶過(guò)度激活，胰腺組織修復(fù)緩慢甚至停滯，極易出現(xiàn)胰腺及胰周組織壞死等嚴(yán)重的局部和全身并發(fā)癥，常危及生命[4-5]。如何突破這一治療瓶頸，已成為臨床亟需解決的問(wèn)題。

胰腺損傷后，損傷組織再生修復(fù)過(guò)程涉及細(xì)胞間相互作用、組織轉(zhuǎn)化、再分化、信號(hào)通路參與、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、基因表達(dá)等多個(gè)階段，是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[6-7]。近年來(lái)，再生醫(yī)學(xué)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。干細(xì)胞治療是一種有效的組織再生策略，對(duì)損傷組織的再生和修復(fù)有積極的治療作用。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有多向分化潛力、定向遷移、組織修復(fù)及抑制炎癥損傷和再生特性的干細(xì)胞。其次，MSCs還具有較低的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力，可以從骨髓、脂肪、臍帶等組織中獲取[8-9]。目前，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者將MSCs應(yīng)用于治療不同組織疾病取得了良好的結(jié)果[10-12]。而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)作為MSCs中的一種，擁有獲取方便、免疫原性低、細(xì)胞原始、免疫調(diào)節(jié)等明顯優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[13-14]。且HUC-MSCs內(nèi)含有多種成分,可以通過(guò)不同的方式調(diào)節(jié)損傷后的炎癥反應(yīng)、血管生成和細(xì)胞保護(hù)，參與生物學(xué)發(fā)育、表觀(guān)遺傳調(diào)控、免疫調(diào)控、腫瘤發(fā)生進(jìn)展等生理和病理過(guò)程。本文就HUC-MSCs的生物學(xué)特性、功能優(yōu)勢(shì),對(duì)胰腺損傷動(dòng)物模型的應(yīng)用及發(fā)揮治療作用可能涉及的潛在機(jī)制方面進(jìn)行探討，為探索胰腺損傷臨床治療新策略作出有益嘗試。

1 HUC-MSCs的生物學(xué)特性及功能優(yōu)勢(shì)

HUC-MSCs可從臍帶的華通氏膠(Wharton’s jelly,WJ)[15]、靜脈內(nèi)皮、血管周?chē)鷧^(qū)域分離出來(lái)[16]。其具有分化成肌肉、成骨、軟骨、脂肪、胰島、血管內(nèi)皮、心肌等細(xì)胞的能力。相比其他組織來(lái)源的MSCs，HUC-MSCs有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)可以表現(xiàn)出MSCs表面特異性抗原CD29、CD73、CD90，并且具有易于獲得和倫理問(wèn)題較小的優(yōu)勢(shì)[17]；(2)收集無(wú)侵入性，可以預(yù)防感染的風(fēng)險(xiǎn)；(3)相比其他組織來(lái)源的MSCs表現(xiàn)出更高的增殖潛力；(4)由于主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex I,MHC I)類(lèi)表達(dá)較低，MHC Ⅱ類(lèi)分子缺失，在早期的胚胎學(xué)階段顯示出更高的分化能力和更快的自我更新；(5)可以冷凍儲(chǔ)存、解凍、恢復(fù)和擴(kuò)展，以供隨時(shí)治療使用[18]。這些優(yōu)勢(shì)使HUC-MSCs具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 HUC-MSCs在胰腺損傷治療中可能發(fā)揮的潛在的機(jī)制探討

2.1細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是一個(gè)以線(xiàn)粒體滲漏、功能障礙和凋亡信號(hào)通路激活為特征的過(guò)程。在創(chuàng)傷過(guò)程中，多個(gè)細(xì)胞死亡途徑被啟動(dòng)，觸發(fā)瘢痕的形成和組織重塑。防止細(xì)胞凋亡和增加細(xì)胞存活對(duì)于組織修復(fù)和維持器官穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。大量研究證實(shí)，胰腺凋亡和壞死廣泛存在于胰腺腺泡細(xì)胞中，與胰腺損傷發(fā)展過(guò)程中的器官損傷密切相關(guān)。HUC-MSCs可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)損傷組織修復(fù)再生，從而改善胰腺損傷組織功能[19]。Zhou等[20]通過(guò)觀(guān)察HUC-MSCs對(duì)卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)增殖和凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，HUC-MSCs可以體外靶向卵巢癌細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤增殖抗原(Ki-67)的表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，并通過(guò)調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因關(guān)聯(lián)X 蛋白(Bax)的表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。Nie等[21]在2型糖尿病大鼠模型和高糖脂肪刺激的人腎小球系膜細(xì)胞(hGMC)模型中驗(yàn)證了HUC-MSCs可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子(NF-E2)和相關(guān)因子(Nrf2)及其上游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路來(lái)減輕2型糖尿病腎氧化損傷和細(xì)胞凋亡，展現(xiàn)出了HUC-MSCs作為治療糖尿病腎病藥物靶點(diǎn)的潛力。Zhang等[22]證實(shí)HUC-MSCs可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)信號(hào)傳導(dǎo)和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡兩種方式來(lái)減輕急性心肌炎大鼠模型中的心肌損傷和功能障礙，從而減弱炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和不良的心臟重塑。在胰腺損傷發(fā)生的早期(6h內(nèi))，胰腺凋亡細(xì)胞逐漸增加，隨著時(shí)間的推遲，凋亡小體逐漸形成并不斷清除，代償性地抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制,對(duì)機(jī)體損傷起到了保護(hù)調(diào)節(jié)作用。因此，通過(guò)上述研究以及對(duì)胰腺損傷后細(xì)胞凋亡的情況分析，筆者推斷HUC-MSCs可以通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路及相關(guān)因子的激活，如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)通路、核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路等參與胰腺損傷發(fā)生后胰腺細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

2.2血管生成 以往的研究表明，HUC-MSCs通過(guò)修復(fù)內(nèi)皮功能障礙在發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，從而影響新生血管[23]。而血管生成是一個(gè)多步驟的過(guò)程，涉及多個(gè)因子的參與，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)等。在所有這些信號(hào)中，VEGF-A信號(hào)傳導(dǎo)被證明是激活胚胎血管生成和出生后血管生成的主要途徑[24-25]。HUC-MSCs可以分泌多種促血管生成生長(zhǎng)因子，如VEGF-A等，從而發(fā)揮增強(qiáng)血管生成和改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用。研究表明，HUC-MSCs治療不僅對(duì)炎癥介質(zhì)和胰腺組織病理學(xué)有明顯效果，而且對(duì)胰腺血管生成表現(xiàn)出更多的作用[26-27]。HUC-MSCs產(chǎn)生的VEGF直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞的連接，并在維持內(nèi)皮單分子層的完整性方面發(fā)揮了重要作用，從而導(dǎo)致了毛細(xì)血管泄漏和白細(xì)胞轉(zhuǎn)移的減少。其次VEGF可以維持血管的完整性，提高內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡能力。Yang等[28]在誘導(dǎo)重癥急性胰腺炎(SAP)后12h，通過(guò)大鼠尾靜脈遞送用或不用Ang-Ⅱ預(yù)處理的HUC-MSCs，闡明了用HUC-MSCs通過(guò)增強(qiáng)血管生成和改善VEGFR2依賴(lài)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞功能障礙，改善了基于間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的治療結(jié)果。Wang等[29]比較了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和HUC-MSCs之間的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者均能刺激血管生成，但血管生成相關(guān)因子在HUC-MSCs中被上調(diào)。此外，他們還在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證兩者均能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管形成，但HUC-MSCs更為明顯。而且ERK和PI3K-Akt通路的激活可能是HUC-MSCs促進(jìn)血管生成的機(jī)制。胰腺損傷后，部分胰腺組織壞死且不活躍,如果胰管厚破裂，大量胰液會(huì)溢出。胰液中的消化酶也能消化胰腺組織，導(dǎo)致更多胰腺組織和周?chē)M織的壞死。加強(qiáng)血管形成、改善胰腺微循環(huán)有助于延緩創(chuàng)傷后壞死，促進(jìn)胰腺組織的再生和修復(fù)。通過(guò)上述研究可知HUC-MSCs通過(guò)調(diào)控血管生成相關(guān)分子如FGF-1、VEGF-A和VEGFR-2的表達(dá)，促進(jìn)體外和體內(nèi)血管生成，抑制炎癥，減少胰腺損傷促進(jìn)損傷后胰腺血管生成。因此，筆者推測(cè)HUC-MSCs在促進(jìn)血管生成中的作用可以為后續(xù)探索胰腺損傷組織的再生和修復(fù)提供新的方向。

2.3免疫調(diào)節(jié) 胰腺損傷后，巨噬細(xì)胞激活，而巨噬細(xì)胞的激活與胰腺損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)。巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等促炎性細(xì)胞因子的釋放，且促炎細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激參與了后期并發(fā)癥的發(fā)生[30]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，HUC-MSCs含有多種免疫相關(guān)分子，包括溶酶體相關(guān)膜蛋白、MHC Ⅰ和MHC Ⅱ，可刺激T細(xì)胞極化為抗炎調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和巨噬細(xì)胞極化，抑制炎性CD4+T、CD8+T和自然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖[31-32]。Jung等[33]2011年首次報(bào)道將骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠SAP的模型降低胰腺組織中炎癥因子的表達(dá)，如TNF-α、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等。后續(xù)也有相關(guān)研究證明：間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)抑制血清和胰腺組織中促炎細(xì)胞因子的水平，增加抗炎因子的表達(dá)，并調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子之間的平衡，具有抗炎特性。Ma等[34]研究了HUC-MSCs對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明了HUC-MSCs抑制T淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)RORγt mRNA和蛋白表達(dá)，降低T輔助細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞比例，上調(diào)人類(lèi)重組蛋白(Foxp3)mRNA和蛋白表達(dá)，提高脾臟Treg細(xì)胞比例。此外，它們下調(diào)關(guān)節(jié)中的RORγt和Foxp3表達(dá)，抑制IL-17并促進(jìn)血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)。胰腺損傷后，NF-κB被激活產(chǎn)生多種類(lèi)型的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-18。這些釋放的細(xì)胞因子有助于產(chǎn)生初始信號(hào)，從而導(dǎo)致胰腺中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，加重炎癥反應(yīng)。HUC-MSCs可以通過(guò)參與相關(guān)促炎因子和抑炎因子的調(diào)控，從而減輕胰腺損傷后的炎癥反應(yīng)，有機(jī)會(huì)成為胰腺損傷后組織再生和修復(fù)的新選擇。

2.4細(xì)胞增殖與遷移 在一定的病理?xiàng)l件下，損傷和壞死組織可通過(guò)鄰近剩余健康細(xì)胞的增殖和遷移形成瘢痕組織[35-37]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、RNA和DNA。這些活性成分可以在細(xì)胞間穩(wěn)定運(yùn)輸，參與細(xì)胞間的信息交換，并激活各種細(xì)胞類(lèi)型的遷移和增殖[36,38-40]。有研究證明HUC-MSCs對(duì)原代人乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞膜修飾納米囊泡(MDA-MB-231)和人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB)系呈現(xiàn)抑制作用，其潛在的機(jī)制可能與HUC-MSCs影響細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制PI3K和AKT蛋白激酶的活性有關(guān)[36,41]。Liu等[42]證明HUC-MSCs可以通過(guò)Wnt/β-catenin與PI3K/Akt信號(hào)通路之間的串?dāng)_作用，從而抑制HCCC-9810人膽管癌細(xì)胞系的惡性表型。胰腺損傷后，胰腺實(shí)質(zhì)發(fā)生節(jié)段性或彌漫性炎癥，可導(dǎo)致胰腺壞死、纖維化、腺泡細(xì)胞和胰島細(xì)胞萎縮和消失，導(dǎo)致胰腺結(jié)構(gòu)損傷和胰腺內(nèi)分泌和外分泌功能障礙。HUC-MSCs可以發(fā)揮刺激細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞活化從而發(fā)揮對(duì)損傷組織再生和修復(fù)的作用，可為治療胰腺損傷后的組織再生和修復(fù)提供有益的嘗試。

2.5旁分泌作用 HUC-MSCs通過(guò)旁分泌產(chǎn)生的外泌體可以再生細(xì)胞和組織，并顯示出間充質(zhì)干細(xì)胞作為治療載體的潛力[43-44]。干細(xì)胞分泌的外泌體不僅含有特定的多能轉(zhuǎn)錄因子，而且含有豐富的非編碼RNA，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)受體細(xì)胞的修復(fù)和再生[45-46]。其次，外泌體作為細(xì)胞間通訊的介質(zhì)，通過(guò)調(diào)控凋亡基因，從而抑制受損細(xì)胞或組織的凋亡，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。但目前關(guān)于外泌體的研究，僅僅觸及了參與外泌體介導(dǎo)的組織重塑和修復(fù)的復(fù)雜信號(hào)的表面，其具體的分子機(jī)制仍是未知數(shù)。其次，關(guān)于使用外泌體存在一些潛在問(wèn)題，如安全性、劑量反應(yīng)和不良反應(yīng)[47-48]。因此，外泌體的研究仍處于起步階段，未來(lái)臨床應(yīng)用前需要進(jìn)一步的廣泛研究。

3 HUC-MSCs在胰腺損傷動(dòng)物模型的治療應(yīng)用(本課題組研究)

3.1基于損傷范圍控制的大鼠胰腺損傷模型建立 模型建立采用中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自行研制的多功能動(dòng)物撞擊儀(圖1)，該裝置已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)：ZL 2016 1 0347341.9)。該生物撞擊儀能夠較好地模擬創(chuàng)傷發(fā)生條件，控制其損傷范圍及嚴(yán)重程度，且具有便于攜帶、操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。在400kPa的致傷壓強(qiáng)下分別建立占胰腺總面積范圍30%、60%的胰腺大范圍擠壓傷大鼠模型，在致傷機(jī)制上，相較于其他的小動(dòng)物撞擊儀，表現(xiàn)出的主要優(yōu)勢(shì)為胰腺血管損傷小、組織損傷重，從而使該創(chuàng)傷模型具有損傷范圍可控、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，能較好地模擬人體胰腺損傷后病理與生理變化[49-50]。

圖1 撞擊儀整體實(shí)物

3.2HUC-MSCs在大鼠胰腺損傷模型中的應(yīng)用 史明等[51]選取已建模成功的SD大鼠，經(jīng)尾靜脈注射由活細(xì)胞染料標(biāo)記的HUC-MSCs，分別于建模后6h，1、2、3、5、7d后(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只)，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血處死留取血液標(biāo)本，檢測(cè)血清淀粉酶、血清脂肪酶、炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)；留取胰腺組織檢測(cè)凋亡指標(biāo)(Bcl-2、Bax)；進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)胰島素促進(jìn)因子-1(PDX-1)蛋白、巢蛋白、5-溴脫氧尿苷(BrdU)表達(dá)位置及表達(dá)量。留取肺組織，檢測(cè)炎癥指標(biāo)(HMGB1、TNF-α和IL-1β)。結(jié)果表明：HUC-MSCs降低胰腺損傷后大鼠的血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、TNF-α的含量，除此之外，HUC-MSCs還可以有效減輕胰腺組織水腫、腺泡細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。

4 問(wèn)題與展望

胰腺損傷因其并發(fā)癥多、病死率高，成為目前研究的焦點(diǎn)。但是關(guān)于胰腺損傷后促進(jìn)組織修復(fù)及效應(yīng)機(jī)制的研究仍較缺乏。前期筆者通過(guò)自主研制的多功能撞擊儀建立了基于損傷范圍控制的大鼠胰腺損傷模型，證實(shí)HUC-MSCs具有減輕胰腺組織損傷、促進(jìn)胰腺外分泌功能恢復(fù)的作用。但HUC-MSCs存在滯留率低、細(xì)胞存活率低、無(wú)靶向發(fā)揮作用等問(wèn)題，依然無(wú)法廣泛應(yīng)用于臨床。此外，HUC-MSCs移植治療胰腺損傷的具體分子機(jī)制尚未可知。因此，后續(xù)將針對(duì)HUC-MSCs存在的缺陷以及具體的分子機(jī)制開(kāi)展深入研究，為胰腺損傷的治療新方法提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)聲明：韓麗：論文撰寫(xiě)、文獻(xiàn)檢索整理；陳思平、周世波、史明、周黎晨、趙治戎、吉華：文獻(xiàn)檢索整理；戴睿武：論文指導(dǎo)、經(jīng)費(fèi)支持