響應(yīng)面法優(yōu)化小茴香籽提取工藝及抗氧化活性研究

陳 強，豆海港，崔孟姣，楊 改，郝艷麗

（周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 周口 466001）

香辛料（Spices） 是日常烹調(diào)中常用的天然調(diào)味品，不僅具有增進食欲、改善風(fēng)味作用，還兼具有殺菌、防腐和抗氧化功能[1]。目前，油脂或富含油脂食品中常用抗氧劑主要有BHA、BHT、PG 和TBHQ等人工合成抗氧劑[2]，但是他們存在一定的毒性問題[3]，部分國家已禁止使用。

小茴香是多年生草本植物，在我國各地均有栽培，歷史悠久，其果實、莖、葉均可入食用。小茴香籽具有特殊香氣[4]，是一種藥食兩用香辛料[5]。相關(guān)學(xué)者已對小茴香籽的揮發(fā)油成分等進行了較多的研究[6-7]。

目前，關(guān)于響應(yīng)曲面法優(yōu)化小茴香籽抗氧化物的提取工藝未見報道，以小茴香籽為原料，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取小茴香籽抗氧化物，測定其清除自由基能力，為小茴香籽綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

722 型分光光度計，山東博科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；中藥粉碎機，河南華康宏力醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；分樣篩，新鄉(xiāng)市盛禾機電設(shè)備有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義予華儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy；sigma，USA產(chǎn)品；其他試劑均為分析純；小茴香籽，購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗氧化物質(zhì)的提取

準確稱取不同粒度的小茴香籽粉末10.00 g，放入500 mL 三角瓶中，然后在加入乙醇（95%），60 ℃下進行回流提取10 h，過濾，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，分別按照公式（1） 計算提取率，公式（2） 計算DPPH 自由基清除率，以提取物得率和DPPH 自由基清除率之和為綜合指標，考查不同因素對綜合指標的影響。重復(fù)測定3 次。

（1） 抗氧化物得率計算公式。

式中：R——得率，%；

m1——小茴香籽濃縮后提取物的質(zhì)量，g；

m2——小茴香籽粉末的質(zhì)量，g。

（2） DPPH 自由基清除率測定。參考黃小鳳等人[8]的方法，取不同濃度2 mL 提取物及對照溶液加入0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液2 mL，搖勻，室溫下避光保存30 min，于波長517 nm 處測定吸光度。以DPPH 溶液和乙醇溶液為空白，按照公式（2） 計算DPPH 自由基清除率。重復(fù)測定3 次。

1.2.2 單因素試驗

以乙醇（95%） 為提取劑，分別考查粉碎粒徑、提取時間、料液比等因素對綜合指標的影響，確定最優(yōu)的水平。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

采用響應(yīng)面Box-behnken（BBD） 中心組合設(shè)計進行試驗，考查粉碎粒徑（X1）、提取時間（X2）、料液比（X3） 3 個因素對小茴香籽提取物得率（1.2.1（1）） 的影響。

試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

1.3 抗氧化能力測定

1.3.1 ABTS+·清除能力 （ABTS 法）

參考林大都等人[9]的方法。

1.3.2 清除羥自由基活性的測定

參考李敏等人[10]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2017、SAS 8.2 軟件進行，數(shù)值表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 粉碎粒徑對小茴香籽提取物的影響

設(shè)定提取時間1 h，料液比15∶1（g∶mL），依次考查0.60，0.45，0.30，0.20 mm 粉碎粒徑對小茴香籽提取物綜合指標（綜合指標見1.2.1 所述方法，綜合指標中DPPH 自由基清除率測定時選用小茴香籽提取物質(zhì)量濃度為6 mg/mL） 的影響。

粉碎粒徑對小茴香籽提取物提取綜合指標的影響見圖1。

圖1 粉碎粒徑對小茴香籽提取物提取綜合指標的影響

由圖1 可知，隨著粉碎粒徑的逐漸減少，小茴香籽提取物綜合指標是先升高后緩慢減小，當(dāng)粉碎粒徑為0.45 mm，小茴香籽的綜合指標達到最高。

2.1.2 提取時間對小茴香籽提取物的影響

設(shè)定粉碎粒徑為0.45 mm，料液比15∶1（g∶mL），考查提取時間1.0，1.5，2.0，2.5 h 對小茴香籽提取物綜合指標的影響。

提取時間對小茴香籽提取物綜合指標的影響見圖2。

圖2 提取時間對小茴香籽提取物綜合指標的影響

由圖2 可知，隨著提取時間的延長，小茴香籽提取物綜合指標先升高后緩慢降低，當(dāng)提取時間為1.5 h，小茴香籽提取物綜合指標達到最高。

2.1.3 料液比對小茴香籽提取物綜合指標的影響

設(shè)定粉碎粒徑為0.3 mm，提取時間1 h，按照料液比為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 （g∶mL）分別進行提取試驗，考查料液比對小茴香籽提取物綜合指標的影響。

料液比對小茴香籽提取物綜合指標的影響見圖3。

圖3 料液比對小茴香籽提取物綜合指標的影響

由圖3 可知，隨著料液比的增大，小茴香籽提取物綜合指標是先升高后減低，當(dāng)料液比為1∶15（g∶mL），小茴香籽提取物綜合指標達到最高。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

以小茴香籽提取物的得率為考核指標，對小茴香籽提取的工藝條件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)對小茴香籽提取物的得率進行統(tǒng)計分析。

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

由表3 可知，X1對小茴香籽提取物得率影響達到了極顯著水平（Pr=0.004 321＜0.01），X3對小茴香籽提取物綜合指標影響達到了顯著水平（p=0.027 23＜0.05），二次項（X1X1、X2X2、X3X3） 也達到了極顯著水平 （p 均小于 0.01）。模型的 p 值 （0.000 943）＜0.01，差異達到了極顯著，相關(guān)系數(shù)R2為98.05%，這些均表明回歸模型的擬合度較好。通過SAS 中（RSRGE） 優(yōu)化，可得出回歸方程為：

表3 方差分析

通過方程求解，可求出小茴香籽提取物得率最優(yōu)水平組合為粉碎粒徑0.45 mm，提取時間2 h，料液比 1∶15 （g∶mL）。

為進一步分析各種因素對小茴香籽提取物得率的影響，通過SAS8.2 響應(yīng)面可得到雙因素影響圖。

雙因素對小茴香籽抗氧化物得率的影響見圖4。

響應(yīng)面圖中，曲面越陡，表明兩因素對響應(yīng)值（得率） 影響也越大。圖4（a） 表示粉碎粒徑（X1）和提取時間（X2） 對響應(yīng)值的影響，趨勢呈先增大后減?。粓D4（b） 表示粉碎粒徑（X1） 和料液比（X3） 對響應(yīng)值的影響，趨勢是先增大后減??；圖4（c） 為提取時間（X2） 和料液比（X3） 對響應(yīng)值的影響，呈先增大后減小的趨勢。趨勢圖分析得知，該模型有最大值，在得率最大條件下，驗證試驗得率為4.24%，得率與模型預(yù)測相近，說明此模型切實可行。

圖4 雙因素對小茴香籽抗氧化物得率的影響

2.3 抗氧化能力測定

2.3.1 ABTS+·清除作用

ABTS[2,2'-Azino-bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sul phoniate)]經(jīng)氧化可形成穩(wěn)定的ABTS+·，被測物質(zhì)加入ABTS+·溶液后，能與ABTS+·溶液發(fā)生反應(yīng)，從而使反應(yīng)體系褪色[11]。

小茴香籽提取物對ABTS+·清除能力見圖5。

圖5 小茴香籽提取物對ABTS+·清除能力

由圖5 可知，不同質(zhì)量濃度的小茴香籽提取物均對ABTS+·有清除作用，清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。隨著小茴香籽提取物與BHT 質(zhì)量濃度逐漸增加，ABTS+·的清除率也呈逐漸遞增趨勢，但小茴香籽提取物對ABTS+·的清除率低于同質(zhì)量濃度的BHT。

2.3.2 ·OH 清除作用

為了更進一步小茴香籽提取物抗氧化活性，采用1.3.2 的方法測定小茴香籽提取物對·OH 清除能力試驗。

小茴香籽提取物對·OH 清除能力見圖6。

圖6 小茴香籽提取物對·OH 清除能力

由圖6 可知，不同質(zhì)量濃度的小茴香籽提取物均對·OH 有清除作用，清除率與質(zhì)量濃度也呈正相關(guān)關(guān)系。隨著質(zhì)量濃度增加，兩者對·OH 的清除率也逐漸升高，小茴香籽提取物對·OH 清除能力也低于同質(zhì)量濃度的BHT。

3 結(jié)論

（1） 小茴香籽提取物提取單因素工藝的試驗表明，小茴香籽提取物的最佳工藝條件為粉碎粒徑0.45 mm，提取時間1.5 h，料液比15∶1（g∶mL），此時小茴香籽提取物綜合指標達到最大值。

（2） 小茴香籽抗氧化物響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果表明，粉碎粒徑（X）1對小茴香籽提取物得率影響達到了極顯著水平 （p=0.004 321＜0.01），料液比 （X）3對小茴香籽提取物得率影響達到了顯著水平（p=0.027 23＜0.05），二次項 （X1X1、X2X2、X3X）3也達到了極顯著水平 （p 均小于 0.01）。模型的 p（0.000 943） ＜0.01，差異極顯著，相關(guān)系數(shù)R2為98.05%，回歸模型的擬合度較好。通過SAS 中（RSRGE） 優(yōu)化，小茴香籽提取物得率最優(yōu)水平組合為粉碎粒徑0.45 mm，提取時間2 h，料液比15∶1（g∶mL）。

（3） 小茴香籽提取物體外抗氧化試驗表明，在質(zhì)量濃度2～10 mg/mL 條件下，小茴香籽提取物對ABTS+·清除率及·OH 清除率呈隨提取物的質(zhì)量濃度增加而增大的變化趨勢。