miR-376a-3p通過靶向調(diào)控GRP78抑制胃癌細胞生長與轉(zhuǎn)移的機制研究

胃癌是臨床常見的一類消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國每年新發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病人數(shù)的40%以上，且全球發(fā)病率仍在逐年升高，發(fā)病人群呈現(xiàn)逐年年輕化態(tài)勢，嚴重危害著人類的生命健康

。胃癌早期缺乏特異性癥狀與體征，難以及時被發(fā)現(xiàn)，一般臨床上確診時已進展至中晚期，極大地降低了預后生存狀況

。胃癌的發(fā)生進展屬于一個連續(xù)、多因素所致的過程，涉及到多種癌基因與抑癌基因的表達激活或失活的變化，深入了解這些分子學調(diào)控機理，有助于推動胃癌診斷治療及預后評估手段的發(fā)展

。

近10年來，miRNA在基因調(diào)控中的作用成了研究熱點之一，被公認為許多細胞生理生化過程的重要調(diào)節(jié)器，如細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成。Chen等

通過實驗證實，miR-495-3p可通過調(diào)節(jié)GRP78/mTOR抑制胃癌細胞自噬；Zhang等

采用胃癌基因微陣列分析篩選出miR-376a在胃癌組織中的異常低表達，并通過對82例臨床胃癌組織與82例正常胃黏膜組織進行qRT-PCR檢測，驗證了miR-376a在胃癌組織中呈表達下調(diào)趨勢，同時指出miR-376a低表達是胃癌患者低生存率的獨立預后標志。但對于miR-376a是如何在胃癌進展中發(fā)揮調(diào)控作用的，目前并未得到闡述。

有關MRD檢測時間點及時間間隔，目前尚不統(tǒng)一，但普遍認為在AL誘導緩解及鞏固治療后的時間段內(nèi)檢測對判斷預后意義更大，時間間隔建議是每3個月檢測1次[7-8]。有關檢測MRD的時間間隔，或許根據(jù)不同時間段MRD的具體值及變化趨勢來制定，可能對指導患者的后續(xù)治療更有幫助。

GRP78是細胞內(nèi)的一種分子伴侶，有助于蛋白質(zhì)組裝、折疊和轉(zhuǎn)移，目前已證實GRP78誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和展開蛋白反應在調(diào)節(jié)各類癌癥細胞增殖、轉(zhuǎn)移等方面均發(fā)揮著關鍵作用，包括胃癌

。Iwamune等

研究證實miR-376a可以負向調(diào)控大鼠卵巢中GRP78的表達，而在胃癌中是否存在這種調(diào)控關系仍不清楚。本研究通過對胃癌臨床組織及細胞系進行實驗研究，以期能驗證miR-376a是否通過靶向調(diào)節(jié)GRP78參與了胃癌的發(fā)展，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1.1 臨床資料：收集南通市腫瘤醫(yī)院2017年6月至2020年12月36例手術切除胃癌組織標本及癌旁正常組織(距癌組織2 cm)標本，男21例，女15例，年齡(52.53±6.72)歲(37～68歲)。納入標準

：所有患者術前均未進行放化療治療，且術后經(jīng)病理檢查確診為胃癌，患者的臨床資料完整，且均進行了1年以上的隨訪。本研究已獲得南通市腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(批號：通腫倫審2019-042)，所有收取組織的患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染：(1)將miR-376a前體(precusor)與miR-376a抑制劑(inhibitor)分別采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染至MKN-45細胞系中正常培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h，測定miR-376a-3p的表達量，以未轉(zhuǎn)染的細胞作為空白對照。(2)分別將Pre-miR-376a、pcDNA-3.1-NC及pcDNA-3.1-GRP78轉(zhuǎn)染至MKN45細胞系，以未進行轉(zhuǎn)染的MKN45細胞系作為空白對照，于體積分數(shù)為5%的CO

、37 ℃培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

現(xiàn)狀水質(zhì)不達標的水功能區(qū)，污染物入河量大于計算納污能力的，以水功能區(qū)納污能力作為限制排污總量；污染物入河量小于計算納污能力的，以污染物現(xiàn)狀入河量作為限制排污總量。

熒光定量PCR儀(伯樂，美國)、凝膠成像分析儀(北京六一生物科技有限公司)、酶標儀(賽默飛，美國)、流式細胞儀(貝克曼，美國)、倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)、熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.1.2 細胞系：普通胃黏膜細胞系(GES-1)、胃癌細胞系MKN-45、AGS、HGC27均購自中國科學院上海細胞庫，另一個胃癌細胞系GC9811購自上海通派生物。所有細胞系均采用含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清與青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)。

1.2.1 qRT-PCR：采用Trizol試劑提取組織/細胞的總RNA，取1 μg 總RNA作為模板，根據(jù)miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反應體系，將逆轉(zhuǎn)錄反應程序設置為42 ℃ 15 min ，85 ℃ 5 s, 4 ℃ ∞，使用PCR儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； 隨后以cDNA作為模板，使用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒于熒光定量PCR儀進行實時熒光擴增，擴增完成分析Ct值，采用2

法計算miR-376a-3p的相對表達量。miR-376a-3p逆轉(zhuǎn)錄使用引物： 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACGTGGA-3′與通用引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；miR-376a-3p qRT-PCR引物：正向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，反向：5′-ATCATAGAGGAAAATCCACG-3′；以U6 snRNA 作為內(nèi)參，正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒菏紫炔捎肗CBI網(wǎng)站Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析miR-376a-3p與GRP78的靶向結(jié)合序列，根據(jù)靶向結(jié)合位點設計MUT序列。分別擴增GRP78 WT與MUT的序列，分別將其載入pMIR-RB-REPORT空載體及具有miR-376a-3p的pMIR-RB-REPORT載體中，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性，以海腎熒光素酶作為內(nèi)參計算相對熒光素酶活性。

1.2.6 EdU實驗：將對數(shù)生長期細胞以1×10

個/孔接種于96孔板中，置于體積分數(shù)為5%的CO

、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，每孔加入100 μl 50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入100 μl Apollo染色反應液，室溫下避光孵育30 min，后采用Hoechst33342反應液孵育30 min，清洗后采用熒光顯微鏡觀察染色情況，軟件計算EdU陽性細胞比例。

(2)Macroeconomics,the study of the economy as a whole,attempts to answer these and many related questions.

1.1.3 儀器和試劑：miR-376a前體(precusor)與miR-376a抑制劑(inhibitor)均購自美國Ambion公司，pcDNA3.1-NC與pcDNA3.1-GRP78由廣州銳博生物技術有限公司設計和合成；DMEM培養(yǎng)基(#A4192102)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(#11668019)、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#4366597)與miRNA熒光定量PCR試劑盒(Q32880)均購自美國賽默飛科技；CCK-8(#CA1210)、Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(#CA1020)購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物(#11402ES60)；BCA蛋白定量試劑盒(#P0010S)購自上海碧云天生物；HRP標記的山羊抗兔IgG(#ZA-0448)購自北京中杉金橋公司；Transwell小室(#3412)購自美國Corning公司。

1.2.5 CCK-8實驗：將對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，1×10

個/孔，置于體積分數(shù)為5%的CO

、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于 0、24、48、72 h取出加入CCK8試劑，10 μl/孔，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，酶標儀測定450 nm處吸光度值。

1.2.3 Western blotting：采用RIPA緩沖液裂解組織/細胞的蛋白質(zhì)，BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白量，取蛋白樣本依次進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、ECL顯影，使用凝膠成像分析儀進行拍照，Image J軟件進行定量分析。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測實驗：將對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞并調(diào)整為1×10

個/ml，胰蛋白酶消化后，PBS洗滌3次，加入Annexin V-FITC、PI結(jié)合緩沖液，混勻，孵育30 min后，采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

工作面來壓時6個重點支架循環(huán)末阻力超過p、p、p1和p2的超限比例見表3。按2種統(tǒng)計口徑，一種是超限值占來壓持續(xù)過程統(tǒng)計循環(huán)數(shù)n比例稱作A1，另一種是超限值占循環(huán)總循環(huán)數(shù)N比例，稱作A2。

結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-376a-3p表達量顯著低于癌旁正常組織(

<0.05，見圖1A)。術后對36例患者的預后情況進行隨訪，隨訪時間(26.47±11.32)個月，根據(jù)miR-376a-3p表達量的中位數(shù)分為miR-376a-3p低表達組與miR-376a-3p高表達組，進行生存分析：其中miR-376a-3p低表達組中位生存時間為22個月，而miR-376a-3p高表達組中位生存時間為36個月，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(

=4.692，

=0.0303)(見圖1B)。與GES1相比，4個胃癌細胞系(MKN-45、AGS、GC9811、HCC27)中miR-376a-3p表達均顯著降低(

<0.05)(見圖1C)。以上結(jié)果均提示，miR-376a-3p在胃癌組織及細胞內(nèi)均呈低表達，且可能與胃癌的發(fā)展相關。

1.2.9 Transwell實驗：將細胞密度調(diào)整為1×10

個/ml，在Transwell板上腔接種200 μl細胞懸液，在下腔加入600 μl含質(zhì)量濃度為200 g/L的胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，將Transwell膜取出固定于4%甲醛15 min，結(jié)晶紫染色10 min，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌3次，于顯微鏡下觀察，隨機取5個區(qū)域計算遷移細胞數(shù)。

陸茂本就不用這么拐彎抹角，他走過來，說：“別呦呦，你看你，頭上都冒汗了，來，我來耕幾行。”說著，那手就向犁把伸去。

2 結(jié)果

1.2.8 劃痕愈合實驗：將細胞接種在6孔板中培養(yǎng)24 h后，使用 200 μl移液槍頭在細胞上劃出劃痕線，于體積分數(shù)為5%的CO

、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，在 0、24、48、72 h使用倒置顯微鏡觀察傷口愈合。

為探究miR-376a-3p與GRP78在胃癌中是否存在靶向調(diào)控關系，通過Blast分析得到miR-376a-3p與GRP78 mRNA的3′UTR區(qū)域存在結(jié)合位點，隨后雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，MUT-GRP78細胞中轉(zhuǎn)染miR-376a-3p后熒光素酶活性未發(fā)生變化，而WT-GRP78細胞在轉(zhuǎn)染miR-376a-3p后熒光素酶活性顯著降低(

<0.05)(見圖2A)；同時Western blotting實驗結(jié)果顯示，miR-376a-3p前體能抑制GRP78蛋白質(zhì)的表達(

<0.05)，而miR-376a-3p抑制劑能促進GRP78蛋白質(zhì)的表達(

<0.05)(見圖2B)；胃癌組織中GRP78蛋白質(zhì)表達量顯著高于癌旁正常組織(

<0.05)，且胃癌組織中miR-376a-3p與GRP78蛋白質(zhì)表達量呈負相關(

<0.05)(見圖2C)。以上結(jié)果提示，miR-376a-3p靶向抑制GRP78蛋白質(zhì)表達，可能對胃癌的發(fā)展起著重要調(diào)控作用。

進一步采用MKN45細胞驗證miR-376a-3p靶向GRP78對細胞增殖、凋亡的影響。CCK-8實驗和EdU實驗檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a后，MKN45細胞增殖活力顯著降低(

<0.05)，而在共轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a+pcDNA3.1-GRP78后能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(

<0.05)(見圖3A～3B)；轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a后，MKN45細胞凋亡顯著增加(

<0.05)，共轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a+pcDNA3.1-GRP78后也能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(

<0.05)(見圖3C)。由以上結(jié)果可知，miR-376a-3p通過靶向GRP78抑制MKN45細胞增殖、促進凋亡。

最后驗證miR-376a-3p靶向GRP78對細胞遷移、EMT的影響。劃痕愈合實驗與Transwell實驗表明，轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a后，MKN45細胞遷移能力顯著降低(

<0.05)，而在共轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a+pcDNA3.1-GRP78后能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(

<0.05)(見圖4A～4B)；Western blotting測定EMT標志蛋白表達情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a降低了MKN45細胞EMT(

<0.05)，而在共轉(zhuǎn)染Pre-miR-376a+pcDNA3.1-GRP78后能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(

<0.05)(見圖4C)；以上結(jié)果可知，miR-376a-3p通過靶向GRP78抑制MKN45細胞遷移、EMT。

在農(nóng)產(chǎn)品翻譯過程中，經(jīng)常出現(xiàn)譯文與本意相悖的現(xiàn)象，出現(xiàn)這一問題的主要原因是缺少專業(yè)翻譯研究人員和翻譯人員不了解專門的英文翻譯方法。因此，要想有效提高地方農(nóng)產(chǎn)品英文翻譯的水平，除了要充分利用既有的標準化翻譯成果，保留英語語言架構(gòu)特點與習慣，直譯與意譯相結(jié)合以及加強政府的規(guī)范外，更要求企業(yè)應該善于引用國外英文翻譯法，根據(jù)實際情況進行選擇與翻譯，幫助外國友人理解與接受特色農(nóng)產(chǎn)品中的文化內(nèi)涵。

3 討論

近年來，個體化的靶向藥物治療在癌癥治療中越來越受到關注，研究胃癌分子調(diào)控機制，有助于為胃癌的靶向治療提供新的靶點

。既往研究表明，miR-376a在結(jié)直腸癌、淋巴瘤、骨肉瘤及膠質(zhì)瘤中均存在異常低表達，并且在腫瘤細胞增殖、凋亡與侵襲中起到調(diào)控作用

。近期研究

發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中也呈miR-376a-3p表達降低的現(xiàn)象，但其調(diào)控機制仍不清楚。本研究在文獻閱讀的基礎上進行了實驗探究，以期將這一調(diào)控機制明確闡述。

本研究中首先對比了36例臨床胃癌組織、對應的癌旁正常組織以及細胞系中miR-376a-3p的表達情況，發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織與正常胃黏膜細胞系GES-1，胃癌組織與細胞系(MKN-45、AGS、GC9811、HGC27)中miR-376a-3p表達水平顯著降低。且經(jīng)過對患者的術后生存情況進行隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-376a-3p低表達患者總生存時間更短，提示miR-376a-3p表達與胃癌的發(fā)展密切相關。

設P點可以接收到m個信標節(jié)點的信號,將m個信標節(jié)點以3個不共線的為一組分組,假設一共有k組。通過第1部分的數(shù)學模型可以計算出k個P點的坐標值,分別是(xP1,yP1),…,(xPk,yPk)。這k個坐標值即LOGGWO算法的部分初始值,通過算法尋優(yōu)得到未知節(jié)點P的優(yōu)化坐標。設改進灰狼優(yōu)化算法的種群大小為N。若k≥N,則選用根據(jù)適應度值從小到大選取前N個作為初始值;若k

接下來的實驗發(fā)現(xiàn)，miR-376a-3p確實能與GRP78 mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合，從而靶向抑制GRP78蛋白質(zhì)的表達，而且在胃癌組織中GRP78蛋白質(zhì)也呈高表達，與miR-376a-3p呈負相關。Qin等

使用血清學蛋白評估指出，抗GRP78抗體是胃癌潛在的生物標志物，與本研究GRP78在胃癌組織中呈異常高表達狀態(tài)的結(jié)果一致。為進一步驗證miR-376a-3p靶向GRP78對胃癌細胞的影響，采用miR-376a-3p表達程度最低的MKN45細胞系進行細胞增殖、凋亡、遷移等生理活動的觀察，結(jié)果顯示，上調(diào)miR-376a-3p表達能抑制MKN45細胞增殖、遷移及EMT，促進細胞凋亡，而同時上調(diào)miR-376a-3p與GRP78的表達則能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。GRP78是熱休克蛋白家族成員，是機體在應激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，能夠使得錯誤折疊的蛋白質(zhì)恢復正常的構(gòu)象，同時易與癌基因產(chǎn)物形成復合體，轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)特定位置，促進腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移，并通過維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子平衡，抑制細胞凋亡

。Yang等

對160例胃癌患者進行回顧性隊列研究，指出GRP78過度表達可促進胃癌細胞增殖，GRP78可能是評估胃癌惡性程度和化療耐藥性的新型生物標志物，可能有助于胃癌患者的化療規(guī)劃和預后預測。Ogawa等

通過對328例胃癌患者手術切除的腫瘤標本進行BiP/GRP78免疫組化染色，并分析染色陽性的危險因素，發(fā)現(xiàn)BiP/GRP78與胃癌侵襲性和進展顯著相關。以上研究結(jié)果均說明了miR-376a-3p靶向的GRP78蛋白參與了多種腫瘤的發(fā)生與進展，與本研究調(diào)控機制類似。

綜上所述，miR-376a-3p通過靶向抑制GRP78蛋白表達，抑制胃癌細胞生長與轉(zhuǎn)移，未來將通過動物實驗進一步證實體內(nèi)環(huán)境miR-376a-3p/GRP78對胃癌的調(diào)控作用。

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