NFE2L2對食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前食管癌的致死率已位居全球第六位

。除此之外，食管癌患者總體5年生存率僅為15%～25%

。食管癌高致死率、低生存率的特點與患者早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及治療療效欠佳密切相關(guān)。因此，為了降低患者死亡率，改善預(yù)后，尋找抑制食管癌轉(zhuǎn)移的治療靶點十分重要。

選取120例乳腺疾病患者作為研究對象,乳腺病灶共計154個。所有患者均接受超聲彈性成像檢查?；颊呔鶠榕?年齡23-64歲,平均年齡(40.31±3.55)歲;超聲彈性成像檢查下可看到實性腫塊,經(jīng)手術(shù)切除病理檢查之后得到證實。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid2-like2，NFE2L2)是細(xì)胞中一種抗氧化轉(zhuǎn)錄因子

，其編碼的蛋白Nrf2在宮頸癌、肺癌、卵巢癌等惡性腫瘤的進(jìn)展中均發(fā)揮重要作用

。Zhang等

發(fā)現(xiàn)，Nrf2在人食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中高表達(dá)，并與患者生存率低相關(guān)，提示NFE2L2可能參與ESCC的發(fā)生發(fā)展，但NFE2L2對ESCC生物學(xué)行為影響的報道較少。本研究基于此背景，通過下調(diào)及上調(diào)人ESCC細(xì)胞株ECA109中NFE2L2的表達(dá)，觀察該基因在ESCC侵襲、遷移、增殖、凋亡中的作用，為食管癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

乳腺增生性病變與早期乳腺癌在常規(guī)超聲診斷過程中存在重疊現(xiàn)象進(jìn)而容易發(fā)生診斷誤差，需要予以重要補(bǔ)充，降低診斷重疊部位的誤診和漏診率[7-8]。

1.1.1 細(xì)胞株：人ESCC細(xì)胞株ECA109購自武漢普諾森生命科技有限公司。

1.1.2 主要儀器及耗材：細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國Thermo公司)；β-actin兔抗人多克隆抗體(美國BOSTER公司，貨號：BA2305)；NFE2L2兔抗人單克隆抗體(英國Abcam公司，貨號：ab62352)；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR047A)；CKK-8試劑盒(日本同仁公司，貨號：CK04)；Matrigel膠(美國BD公司，貨號：356234)；慢病毒試劑盒(上海吉凱基因公司)。

侵襲實驗結(jié)果顯示，ECA109經(jīng)NFE2L2 siRNA1、siRNA2干預(yù)48 h后，干預(yù)組侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組減少(見表3、圖2)；ECA109經(jīng)NFE2L2質(zhì)粒過表達(dá)48 h后，NFE2L2過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)較空白對照組增加(見表4、圖3)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)。

1.2.4 qRT-PCR法：Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，BLAST驗證后，委托上海生工生物公司合成備用(NFE2L2：F-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA,R-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT;β-actin:F-ATGATGATATCGCCGCGCTC,R-TCGATGGGGTACTTCAGGG)。使用Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇提取RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA。然后將cDNA進(jìn)行qRT-PCR檢測基因表達(dá)。

腎臟集合管癌是起源于腎臟髓質(zhì)集合管遠(yuǎn)端的惡性上皮腫瘤，極為少見，約占所有類型腎細(xì)胞癌的1%～2%，F(xiàn)LEMING等[2]于1986年首次提出其為獨立的腎細(xì)胞癌病理亞型，其惡性程度高，進(jìn)展快，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已有腎外轉(zhuǎn)移，約80%的患者最終轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、肺、肝、腦及骨。2008年8月至2017年8月我院收治的所有腎細(xì)胞癌患者中僅出現(xiàn)12例CDC患者。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建NFE2L2過表達(dá)質(zhì)粒(F：TCCGCTCGAGATGATGGACTTGGAGCTGCC；R：ATGGGGTACCGAGTTTTTCTTAACATCTGGC)及NFE2L2小干擾RNA(siRNA1：5′-CCAACCAGUUGACAGUGAACUCAUU-3′；siRNA2：5′-CAAACUGACAGAAGUUGACAAUUAU-3′)待用。將細(xì)胞接種在6孔板，生長至85%時轉(zhuǎn)染，不做處理組為空白對照組，轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列組為陰性對照組。

（2）開題報告是學(xué)生畢業(yè)設(shè)計前期工作重點。學(xué)生在獲取任務(wù)書后，通過文獻(xiàn)檢索了解選題在相應(yīng)學(xué)科領(lǐng)域中的發(fā)展進(jìn)程和研究方向和最新成果，并閱讀教師在任務(wù)書中規(guī)定的中外文獻(xiàn)參考資料。學(xué)生在閱讀文獻(xiàn)和社會調(diào)研的基礎(chǔ)上寫出開題報告。

1.2.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力及遷移能力：(1)侵襲實驗：上室接種5×10

個細(xì)胞(無血清)，下室加入含10%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育24 h，取上室甲醛固定，穿膜細(xì)胞Giemsa染色，顯微鏡下選取5個隨機(jī)視野進(jìn)行觀察拍照，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計。(2)遷移實驗：將Matrigel膠置于4 ℃冰箱過夜，用RPMI-1640稀釋至1 mg/ml，取100 μl平鋪在上室，37 ℃孵育6 h凝固成膠。后續(xù)步驟同侵襲實驗。

注：與空白對照組相比，△

<0.05，▽

<0.001；與空轉(zhuǎn)組相比，▲

<0.05，▼

<0.001。

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，ECA109經(jīng)NFE2L2 siRNA1、siRNA2干預(yù)48 h后，細(xì)胞早期凋亡率較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.01，見表5、圖5)；ECA109經(jīng)NFE2L2 質(zhì)粒過表達(dá)后，細(xì)胞早期凋亡率與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

>0.05，見表6)。

受試者清晨空腹取直立位,檢測身高、體重、體重指數(shù)(BMI)=體重/身高2(kg/m2)、腰圍,并抽空腹靜脈血4-5ml,備測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)在某醫(yī)院檢驗科用日本日立7060全自動生化分析儀測定。

2 結(jié)果

qRT-PCR及Western blotting結(jié)果顯示，ECA109經(jīng)NFE2L2 siRNA1、siRNA2干預(yù)后，NFE2L2在基因水平和蛋白水平均較對照組降低(見圖1A、表1)；ECA109經(jīng)NFE2L2過表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)后，NFE2L2在基因水平和蛋白水平均較對照組升高(見圖1B、表2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)基使用90%RPMI-1640+10%FBS+1%雙抗，細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO

、37 ℃培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞呈對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實驗，以下實驗均重復(fù)3次。

1.2.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力：96孔板每孔接種2×10

個細(xì)胞，培養(yǎng)至充分貼壁，每孔加入CCK-8染色液100 μl，37 ℃避光孵育4 h，酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀檢測其吸光度值(

)，計算細(xì)胞增殖率。

1.2.3 Western blotting法：細(xì)胞裂解液(含磷酸酶、蛋白酶抑制劑)裂解后，12 000 r/min,4 ℃,離心15 min后取上清液，BCA定量檢測蛋白濃度，凝膠電泳分離，恒流冰浴轉(zhuǎn)膜，4 ℃一抗孵育過夜(NFE2L2及β-actin抗體均稀釋至1∶500)，二抗(山羊抗兔)室溫孵育2 h，暗室在PVDF膜上滴ECL液，發(fā)光后壓片曝光，掃描圖片進(jìn)行分析。

遷移實驗結(jié)果顯示，ECA109經(jīng)NFE2L2 siRNA1、siRNA2干預(yù)48 h后，干預(yù)組遷移細(xì)胞數(shù)較對照組減少(見表3、圖2)；ECA109經(jīng)NFE2L2質(zhì)粒過表達(dá)48 h后，NFE2L2過表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)較對照組增加(見表4、圖3)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)。

細(xì)胞周期結(jié)果顯示，ECA109經(jīng)NFE2L2 siRNA1、siRNA2干預(yù)48 h后，干預(yù)組G

/G

期細(xì)胞百分比較對照組增加，干預(yù)組S期細(xì)胞百分比較對照組減少(見表5、圖4)；ECA109經(jīng)NFE2L2質(zhì)粒過表達(dá)后，G

/G

期細(xì)胞百分比較對照組減少，S期細(xì)胞百分比較對照組增加(見表6)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

<0.05)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：將細(xì)胞與1 ml結(jié)合緩沖液充分混勻至濃度為1×10

個/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加入5 ml流式管，每個流式管加入10 μl碘化丙啶，避光靜置15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

3 討論

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，是世界上發(fā)病率較高且致死率極高的癌癥之一

。據(jù)統(tǒng)計，世界上每年約有50萬人死于食管癌，占全球癌癥死亡總數(shù)的5.3%，值得注意的是，亞洲食管癌患者占全球所有食管癌病例的78%，而這其中49%的病例來自我國，除此之外，我國食管癌患者的死亡率也居世界前列，且具有顯著的地域差異

，提示食管癌與基因遺傳易感性及環(huán)境因素有關(guān)。現(xiàn)階段，盡管科研工作者在治療食管癌方面付出了巨大的努力，但食管癌患者總體5年生存率仍然很低(15%～25%)，食管癌患者預(yù)后與食管癌的早期診斷及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

。而食管癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚不完全清楚，有待進(jìn)一步闡明為其靶向治療提供方向和思路。

NFE2L2是一種具有保護(hù)性的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，是氧化應(yīng)激反應(yīng)的前線效應(yīng)器，它能夠反式激活至少1 000個保護(hù)基因表達(dá)減少細(xì)胞的急性損傷，正常細(xì)胞環(huán)境下，其編碼的蛋白Nrf2受上游適配器蛋白KEAP1的負(fù)調(diào)節(jié)，兩者形成復(fù)合物共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而Nrf2/KEAP1軸則被認(rèn)為是細(xì)胞防御和生命通路的中樞節(jié)點

。轉(zhuǎn)錄因子NFE2L2主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在食管、甲狀腺和其他組織中廣泛表達(dá)

，其編碼的蛋白Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在宮頸癌中起重要作用

，在宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移方面起促進(jìn)作用，且抑制宮頸癌細(xì)胞的凋亡

，同時增加腫瘤化療的抵抗性

，提示NFE2L2可能是判斷宮頸癌患者預(yù)后的重要標(biāo)志

。此外，NFE2L2/KEAP1復(fù)合體的基因突變可促使肺鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)出現(xiàn)氧化還原亞型，影響肺鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后

?；仡橬FE2L2與食管癌方面的有關(guān)報道，一方面，有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的過度表達(dá)可增加ESCC的抗輻射能力，與ESCC患者生存率低密切相關(guān)

；且miR-142-5p可靶向負(fù)調(diào)控食管癌細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，抑制食管癌遷移

。另一方面，有研究

顯示，Nrf2基因敲除小鼠對硝基亞氧喹啉誘導(dǎo)舌癌和食管癌的敏感性明顯高于野生型小鼠。因此，NFE2L2對食管癌增殖、侵襲和遷移的影響有待進(jìn)一步闡明。

食管癌在組織學(xué)上可分為ESCC和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，ECA)。ESCC是食管癌的主要亞型，約占全世界食管癌病例的90%

。因此，本文選用人ESCC細(xì)胞株ECA109進(jìn)行研究，通過下調(diào)及上調(diào)ECA109細(xì)胞中NFE2L2基因，探討該基因?qū)SCC生物學(xué)行為的影響。

牙齒是人體的重要組成部分，其解剖形態(tài)在不同民族和地區(qū)間存在一定的差異[1]。維吾爾族在遺傳、生活習(xí)俗、生活環(huán)境等與漢族明顯不同，其牙體解剖形態(tài)上也具有不同特點。目前,國內(nèi)外有很多學(xué)者對不同民族、不同地區(qū)的恒牙解剖形態(tài)進(jìn)行了相關(guān)研究[2-4]。而對維吾爾族牙齒解剖結(jié)構(gòu)的研究較少，且研究樣本量也較小[5-6]。牙齒測量是研究牙齒形態(tài)的最基本方法,本研究對新疆地區(qū)維吾爾族第一前磨牙的解剖形態(tài)進(jìn)行測量，以期為新疆地區(qū)口腔臨床、教學(xué)和科研提供解剖學(xué)資料和理論依據(jù)。

ESCC的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其患者預(yù)后差、生存率低的主要原因

。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)ECA109細(xì)胞中NFE2L2基因后，干預(yù)組細(xì)胞侵襲能力較空白對照組及陰性對照組明顯降低，而上調(diào)ECA109細(xì)胞中NFE2L2基因后，干預(yù)組細(xì)胞侵襲能力較空白對照組及空轉(zhuǎn)組明顯增加。除此之外，本研究中Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比，ECA109 siRNA組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少，而質(zhì)粒過表達(dá)組則結(jié)果相反。因此，我們推測NFE2L2基因參與ESCC細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)促進(jìn)ESCC的侵襲和遷移。這與Xiao等

的研究結(jié)果一致。針對NFE2L2促進(jìn)ESCC侵襲和遷移的機(jī)制，現(xiàn)階段學(xué)者發(fā)現(xiàn)與代謝

、Notch信號通路

、PI3K/AKT信號通路

相關(guān)，但尚未找到有效治療ESCC的方法，有待進(jìn)一步研究其具體機(jī)制。

☆秋風(fēng)陣陣，枝頭上的樹葉紛紛飄落。有的如蝴蝶，扇動著美麗的翅膀；有的如蜜蜂，轉(zhuǎn)著“8”字飛舞；有的如降落傘，緩緩地打著旋兒……一片片樹葉，無論是怎樣飛舞，都會緩緩落下，在地上鋪成一條金色的道路。

在腫瘤的化療過程中，癌細(xì)胞進(jìn)化并獲得“耐藥性”，這大大限制了腫瘤治療的有效性，影響患者的生存和生活質(zhì)量。因此，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖存活、凋亡以及耐藥性也是腫瘤研究的重要方向

。有研究

顯示，前列腺癌中p62通過抑制Keap1介導(dǎo)的蛋白酶體的降解而降低Nrf2的水平和活性，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，同時增加其凋亡速率。除此之外，F(xiàn)an等

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Nrf2過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和致瘤轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)ECA109細(xì)胞中NFE2L2基因后，干預(yù)組G

/G

期細(xì)胞數(shù)顯著增加，S期細(xì)胞數(shù)顯著減少，對細(xì)胞的分裂及DNA的復(fù)制抑制作用顯著；而上調(diào)NFE2L2的表達(dá)后，G

/G

期細(xì)胞數(shù)顯著減少，S期細(xì)胞數(shù)顯著增加，對細(xì)胞的分裂及DNA的復(fù)制促進(jìn)作用顯著。除此之外，ECA109細(xì)胞株經(jīng)過NFE2L2 siRNA干預(yù)后，siRNA干預(yù)組細(xì)胞早期凋亡率較對照組細(xì)胞明顯增加，但經(jīng)NFE2L2質(zhì)粒過表達(dá)后，細(xì)胞早期凋亡率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示NFE2L2具有抑制食管癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，NFE2L2基因與人ESCC細(xì)胞的EMT密切相關(guān)，并與該腫瘤的耐藥性相關(guān)，但具體機(jī)制尚不完全明確，需進(jìn)一步研究。本課題組下一步將對NFE2L2基因參與人ESCC細(xì)胞的EMT信號通路及分子機(jī)制進(jìn)一步深入研究，力求為食管癌的治療提供依據(jù)。

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