靶向GPC3的第4代嵌合體抗原受體慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝滴定

近年來，隨著分子生物學(xué)、腫瘤免疫學(xué)的進(jìn)展，免疫細(xì)胞治療技術(shù)得到快速發(fā)展，其中嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾免疫細(xì)胞治療技術(shù)成為腫瘤治療領(lǐng)域前沿技術(shù)之一

，CAR由識別和結(jié)合特定抗原的單鏈抗體可變片段(single-chain variable fragments，scFv)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和提供增殖和激活信號的結(jié)構(gòu)域(CD28、OX40、41BB和CD3ζ)組成

。CAR修飾的免疫細(xì)胞治療技術(shù)是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其免疫細(xì)胞膜表面表達(dá)相應(yīng)腫瘤抗原的抗體，賦予其抗原特異性，可以MHC非限制性的方式殺傷腫瘤細(xì)胞，因而一定程度上能克服腫瘤的免疫逃逸

。本實驗室前期通過改變CAR的結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)了對CAR的部分功能的改善(暫未發(fā)表)，本研究擬通過加入IL-15/IL-15Rα序列進(jìn)一步改構(gòu)CAR分子。IL-15包含一種三聚體受體，由IL-15特異性結(jié)合的IL-15Rα、與IL-2共享的IL-15Rβ及γ鏈(γC)組成。其中，α受體(IL-15Rα)是一種對IL-15親和力極高的跨膜蛋白，主要由T細(xì)胞、NK細(xì)胞、不變的自然殺傷T(invariant natural killer T，iNKT)細(xì)胞、B細(xì)胞、DC、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)，IL-15需先與IL-15Rα結(jié)合后形成IL-15/IL-15Rα復(fù)合物

后可以與效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的IL-15Rβ和γ異二聚體結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的存活和成熟，以促進(jìn)其殺傷腫瘤細(xì)胞的效力

。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15在多種淋巴細(xì)胞，如記憶細(xì)胞毒性CD8 T細(xì)胞

、NK細(xì)胞

、iNKT細(xì)胞

的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和生理學(xué)中發(fā)揮著重要作用。IL-15不僅使得CAR基因修飾的免疫細(xì)胞在抗原及外源細(xì)胞因子刺激下具有記憶表型

，并且還會使免疫抑制性相關(guān)受體，如PD-1、LAG-3表達(dá)減少，減弱了回輸過程中受腫瘤細(xì)胞表面PD-L1介導(dǎo)的抑制作用

。Nair等

在實驗中進(jìn)一步證明了在CAR配置中包含IL-15/IL-15Rα的必要性。

我們在靶向GPC3的第2代CAR(GC33-CD28/OX40/41BB-CD3ζ)慢病毒載體基礎(chǔ)上構(gòu)建了含IL-15/IL-15Rα編碼基因的第4代CAR的慢病毒表達(dá)載體，并探討其生物學(xué)功能優(yōu)勢。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)屬于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族，該分子通過內(nèi)部的糖基磷脂酰肌醇錨(glycosylphos-phatidylinositol anchor，GPI)與細(xì)胞膜的表面連接，而分子的羧基末端則被硫酸乙酰肝素側(cè)鏈修飾

。研究

表明，GPC3在70%以上的肝癌組織中表達(dá)，在正常成人組織及肝炎、肝硬化、脂肪肝等病理情況下并不表達(dá)，是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)潛在的治療靶點

，目前靶向GPC3的第2代及第3代CAR-T已經(jīng)開展了Ⅰ期及Ⅱ期臨床試驗，其中，Ⅰ期臨床試驗已經(jīng)證明了CAR-T的安全性，且HCC的中位無進(jìn)展生存期與腫瘤中GPC3的表達(dá)呈正相關(guān)，提示了CAR-T細(xì)胞的有效性

。但由于HCC免疫微環(huán)境的特異性，在隨機(jī)Ⅱ期試驗中，患者未獲得明顯臨床益處

。本研究擬構(gòu)建并優(yōu)化第4代CAR分子，為CAR技術(shù)精準(zhǔn)靶向治療肝癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

EP是子宮內(nèi)膜基底層局部增生的良性病變[6]。目前尚不清楚病因和發(fā)病機(jī)制?？赡芘c炎癥、內(nèi)分泌功能紊亂，特別是雌激素水平過高有關(guān)[7]。Kosei等[8]在研究過程中發(fā)現(xiàn)孕激素缺乏和局部免疫失衡與嚴(yán)重功能不良的NK細(xì)胞對抗病毒和真菌感染導(dǎo)致了過度的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和獨立息肉的發(fā)育。Serhat等[9]認(rèn)為肥胖是子宮內(nèi)膜息肉形成的獨立危險因素。Korucuoglu等[10]首次在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中研究了HPV對EP發(fā)育的可能影響，證明HPV可能在某些EP的發(fā)育中起作用。

狐臭柴生長周期通常在每年的4～11月份，早春和深秋冬無法正常提供鮮葉制作神仙豆腐。此外，生長旺盛期的鮮葉由于未合理開發(fā)利用，造成資源的浪費(fèi)。因此，綜述了近幾十年來國內(nèi)外有關(guān)狐臭柴的研究報道，以期為充分利用及開發(fā)生長旺盛期的狐臭柴資源提供參考。

1.3.3 慢病毒滴度鑒定：轉(zhuǎn)染前1 d，將2×10

個/cm

的293T細(xì)胞種于12孔板中，隨后將3個轉(zhuǎn)染組收集得到的慢病毒原液用細(xì)胞培養(yǎng)基分別進(jìn)行不同比例稀釋后以制備病毒滴度測定工作液，并感染293T細(xì)胞。感染前，收集3個未感染培養(yǎng)孔的293T細(xì)胞并計數(shù)，求每個孔的平均細(xì)胞數(shù)，作為病毒感染的起始細(xì)胞數(shù)。感染48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CAR表達(dá)率，使用Lowjo軟件進(jìn)行分析，根據(jù)CAR

細(xì)胞比例及感染前起始293T細(xì)胞數(shù)目估計病毒滴度，選取CAR

293T細(xì)胞比例為10%～15%組的稀釋倍數(shù)進(jìn)行病毒滴度計算。計算公式為：病毒滴度(TU/ml)=感染前起始293T細(xì)胞數(shù)×CAR

293T細(xì)胞比例×稀釋倍數(shù)。

1.1.2 試劑：DNA凝膠回收試劑盒(北京天根有限公司，貨號DP209)、質(zhì)粒提取試劑盒(美國ThermoFisher公司，貨號K0481)，Xba Ⅰ、Sal Ⅰ內(nèi)切酶(日本TaKaRa公司，貨號1080A及1093A)、DNA連接試劑盒(日本TaKaRa，貨號6022)，Lipofectamine 3000試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號2332077)，DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶及胎牛血清(美國Gibco公司)，anti-Strep-tag Ⅱ抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司，貨號A01732)。

另根據(jù)史料記載⑦核俊哲：《福建海上絲綢之路泉州港與出土貨幣》，載于張忠山主編《中國絲綢之路貨幣》，蘭州：蘭州大學(xué)出版社，1999年。，在宋朝，還曾因大量的錢幣外流而引起國內(nèi)的錢荒，以至宋哲宗不得不下令禁止錢幣外流，但法禁雖嚴(yán)，商人貪利，錢幣外流之弊卒不可禁，直到北宋快亡之際，錢荒局面仍未改變。這些錢幣的外流是古代中國影響力之廣的見證，是古代中國當(dāng)時經(jīng)濟(jì)實力、貿(mào)易實力強(qiáng)盛的真實寫照。

1.2.2 目的片段與載體的線性化：分別將上述合成的第4代GC33-CAR的基因片段與慢病毒表達(dá)載體pCDH以Xba Ⅰ、Sal Ⅰ為限制性酶切位點進(jìn)行雙酶切。酶切完成后取出樣品加入0.75%瓊脂糖凝膠電泳上樣孔中，70 V電泳鑒定并回收，最后采用DNA連接試劑盒將上述3個第4代CAR分子與線性化的pCDH連接，即得到3個第4代pCDH-GC33-CAR慢病毒表達(dá)載體。

1.2.4 陽性克隆的篩選與鑒定：觀察對照組的固體LB平板，確認(rèn)未孵育出克隆后，挑取各組單克隆進(jìn)行搖菌，經(jīng)10 h擴(kuò)增培養(yǎng)后，pCDH-GC33-41BB-T2A-IL15連接組以F-15-2/R-15-2為引物，另外兩組則均以F-5-1/R-15-2為引物進(jìn)行菌落PCR，DNA凝膠電泳確認(rèn)陽性后，分別取對應(yīng)菌液送至上海捷瑞生物有限公司測序。

1.2.3 重組慢病毒載體轉(zhuǎn)化：于-80 ℃冰箱中取出 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，之后分別將上述3組及空白對照組連接產(chǎn)物取出加入100 μl感受態(tài)細(xì)胞DH5α菌中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，冰浴3 min，隨后加入100 μl未添加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床內(nèi)200 r/min，孵育2 h后取出，加入200 μl Amp

-LB液體培養(yǎng)基，混勻后鋪于Amp

-LB固體培養(yǎng)基上，倒置過夜。

（三）豐富互動形式。在應(yīng)用互動教學(xué)模式促進(jìn)高中生物課堂教學(xué)的優(yōu)化時，師生互動是較為常見的一種互動模式，教師通過由淺入深的問題作為引線，以此促成師生間的互動。但單純的師生互動對于高中生物課堂教學(xué)的優(yōu)化效果并不十分明顯，要培養(yǎng)學(xué)生在生物課堂中自主探究的能力，還需在師生互動的基礎(chǔ)上，豐富互動形式，通過生生互動促進(jìn)高中生物課堂教學(xué)的優(yōu)化。

1.2.1 第4代anti-GPC3-CAR構(gòu)建：已經(jīng)構(gòu)建的第2代CAR基因片段結(jié)構(gòu)如圖1A所示，基于2A的多肽策略，分別在3個攜帶不同共刺激因子(CD28/OX40/41BB)的第2代CAR慢病毒表達(dá)載體基礎(chǔ)上連接人源化IL-15/IL-15Rα序列(見圖1B)：(1)首先以2代CAR慢病毒載體為模板，F(xiàn)-5-1/R-5-1為引物，PCR擴(kuò)增分別得出GC33-CD28-CD3ζ、GC33-OX40-CD3ζ及GC33-41BB-CD3ζ的基因片段，即Q1、Q2、Q3；(2)以15-2A-3為模板，F(xiàn)-15-2/R-15-2為引物，PCR擴(kuò)增得出人源化IL-15/IL-15Rα序列片段Q4；(3)Q1、Q2、Q3分別與Q4經(jīng)DNA凝膠電泳回收后作為模板，以F-5-1/R-15-2為引物進(jìn)行搭橋PCR，經(jīng)DNA凝膠電泳確認(rèn)連接成功，PCR所用引物如表1所示。

1.3.1 293T細(xì)胞培養(yǎng)：在37 ℃水浴鍋中復(fù)蘇293T細(xì)胞，于10 cm培養(yǎng)皿中采用高糖DMEM+10%FBS培養(yǎng)基，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO

的孵箱中培養(yǎng)。

1.3.2 慢病毒包裝：選擇處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞以一定數(shù)量接種于T25培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞生長至 70%匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前4 h換液。將實驗分為4組，分別為pCDH-GC33-CD28-T2A-IL15、pCDH-GC33-OX40-T2A-IL15、pCDH-GC33-41BB-T2A-IL15及未轉(zhuǎn)染組。根據(jù)質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒DNA，-20 ℃保存。參考Lipofectamine

3000說明書如下方法配置試劑：(1)轉(zhuǎn)染組操作：每組分別準(zhǔn)備兩個EP管，在每組的EP1管中加入375 μl Opti-MEM及21.5 μl的Lipofectamine

3000并混勻，每組的EP2管中加入375 μl Opti-MEM，2.5 μg的表達(dá)質(zhì)粒，1.875 μg psPAX2，0.625 μg PMD2.G，25 μl P3000

并混勻，將每組稀釋后的質(zhì)粒溶液EP2加入到稀釋后的含Lipofectamine

3000的EP1中并混勻，孵育 15 min后形成DNA-Lipofectamine

3000復(fù)合物；(2)將混合液逐滴加入到待轉(zhuǎn)染的T25瓶中，轉(zhuǎn)染6 h后換液，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集培養(yǎng)上清，800

離心10 min，用0.45 μm的濾器將其過濾后-80 ℃保存。

1.1.3 質(zhì)粒及細(xì)胞：第2代pCDH-GC33-CAR慢病毒表達(dá)載體、質(zhì)粒pCDH、PMD2.G、psPAX2及293T細(xì)胞由本實驗室保存。通過SnapGene軟件在第2代CAR基因序列兩端設(shè)計引物F-5-1/R-5-1，人源化含IL-15序列的質(zhì)粒(15-2A-3)及其相關(guān)引物均由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.1.1 儀器：生物安全柜(蘇凈安泰)、低溫超速離心機(jī)(Beckman)、恒溫?fù)u床(培英THZ-C)、CO

恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、流式細(xì)胞儀(BD公司)、電泳儀、PCR儀及凝膠成像儀(Biorad)、數(shù)字型干式加熱器(BioCote)、全電動倒置熒光顯微鏡(Nikon)等。

2 結(jié)果

分別以靶向GPC3的第2代CAR慢病毒表達(dá)載體為模板，擴(kuò)增獲得Q1～Q3序列，進(jìn)行 0.75%瓊脂糖核酸凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段大小分別在1 359 bp、1 344 bp及1 344 bp左右有目的條帶，與預(yù)期一致(見圖2A)。人源化IL-15/IL-15Rα基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增得到DNA產(chǎn)物在1 389 bp左右有目的條帶，與預(yù)期一致(見圖2B)，運(yùn)用搭橋PCR技術(shù)分別將Q1、Q2、Q3與Q4拼接，核酸電泳結(jié)果提示分別在2 896 bp、2 881 bp及2 881 bp左右有目的條帶，與預(yù)期一致(見圖3A～3B)。上述連接產(chǎn)物雙酶切后分別插入經(jīng)XbaⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶剪切的慢病毒表達(dá)載體PCDH中(見圖3C)，經(jīng)轉(zhuǎn)化、搖菌、菌落PCR(見圖4)及測序驗證(見圖5)，將構(gòu)建的第4代CAR表達(dá)載體與設(shè)計的CAR基因序列比對，結(jié)果完全一致，提示成功構(gòu)建了3個第4代CAR慢病毒表達(dá)載體(見圖6)。

市場經(jīng)濟(jì)是逐利經(jīng)濟(jì)，市場經(jīng)濟(jì)主體的首選必然是利益。市場經(jīng)濟(jì)是中國迅猛發(fā)展的內(nèi)在動力，必須承認(rèn)并激發(fā)人們的追求經(jīng)濟(jì)利益和其他正當(dāng)社會利益的合理性。民辦高校的工作收入明顯地低于公辦院校。更多地追求經(jīng)濟(jì)利益導(dǎo)致民辦高校教職員工的離職率較高。民辦高校黨建要求黨員更多地為了國家的整體利益、院校的整體長遠(yuǎn)利益做出必要的犧牲。兩者之間必然形成矛盾。尋求一種既努力提高黨員自覺的黨的意識、黨員意識、大局意識、奉獻(xiàn)意識、先鋒意識，也合理保障民辦高校黨員業(yè)務(wù)能力發(fā)展、工作收入提高的辦法現(xiàn)實至關(guān)重要。

3組重組質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后顯微鏡下可見細(xì)胞生長良好，流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率(見圖7)，收集病毒進(jìn)行滴度測定，經(jīng)計算，慢病毒滴度為(1.84～3.41)×10

TU/ml(見圖8)。

3 討論

基于CAR基因修飾的免疫細(xì)胞療法目前已成為腫瘤免疫治療中最具有吸引力的療法，具有以下優(yōu)勢：(1)抗原特異性：能夠直接靶向腫瘤細(xì)胞表面；(2)自體來源：與靶向藥物相比，不良反應(yīng)少； (3)效率高：該基因修飾的免疫細(xì)胞不僅具有CAR依賴性的腫瘤殺傷能力，同時CAR共刺激分子的組合可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的自身抗腫瘤活性，為一些常規(guī)治療失敗的患者帶來了希望。目前第2代乃至第3代CAR-T療法已在多系統(tǒng)腫瘤，包括急性淋巴細(xì)胞白血病

、神經(jīng)母細(xì)胞瘤

及HCC

治療中廣泛研究，其中第2代CAR-T細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)腫瘤中療效顯著

，然而CAR-T細(xì)胞在治療實體性腫瘤包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤及HCC方面，療效不明顯，研究認(rèn)為這與實體性腫瘤的微環(huán)境難以攻破、CAR-T細(xì)胞難以正常發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞相關(guān)

：(1)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的腫瘤細(xì)胞存在于全身的循環(huán)血液中，腫瘤抗原CD19/20在患者體內(nèi)幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中均表達(dá)，CAR-T細(xì)胞一經(jīng)回輸即可看到治療效果。而在實體腫瘤中，CAR-T細(xì)胞首先需到達(dá)腫瘤細(xì)胞表面，由于CAR-T細(xì)胞滲透性弱，能夠到達(dá)腫瘤部位且能發(fā)揮作用的細(xì)胞極少；(2)肝癌細(xì)胞表面缺乏T細(xì)胞募集所必需的關(guān)鍵趨化因子，如趨化因子受體CXCR2、CCL21

或IL-15

等，使得T細(xì)胞難以到達(dá)并進(jìn)入腫瘤發(fā)揮殺傷作用；(3)由缺氧、酸中毒、營養(yǎng)缺乏、多種免疫抑制性受體，如PD-1高表達(dá)的免疫抑制微環(huán)境影響了CAR-T的生存及浸潤能力，從而降低了CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用

。

第4代CAR在第2代CAR的基礎(chǔ)上，整合免疫調(diào)節(jié)因子包括IL-12

、IL-15

等以改善腫瘤微環(huán)境。通過閱讀文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)，IL-15在多種淋巴細(xì)胞的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和生理學(xué)中發(fā)揮著重要作用。且DC細(xì)胞表面表達(dá)IL-15Ra受體，可以提呈IL-15信號促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞，包括T細(xì)胞及iNKT細(xì)胞成熟與活化

。Xu等

發(fā)現(xiàn)，IL-15不僅可以保護(hù)腫瘤微環(huán)境受缺氧刺激的iNKT細(xì)胞，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，而且可以促使iNKT細(xì)胞向腫瘤部位遷移。Cieri等

則證實IL-15的加入可以使CAR修飾的免疫細(xì)胞克服腫瘤微環(huán)境的限制，明顯提高效應(yīng)功能。本研究通過分子克隆技術(shù)將IL-15/IL-15Rα融合蛋白構(gòu)建到CAR載體，在靶向GPC3的第2代CAR慢病毒載體基礎(chǔ)上構(gòu)建了第4代CAR的慢病毒載體。通過慢病毒包裝生產(chǎn)出含有4代CAR載體的慢病毒，通過病毒滴定顯示目前包裝系統(tǒng)和產(chǎn)毒滴度穩(wěn)定。由于不同共刺激分子的組合對同種底盤細(xì)胞的影響不同，相同的共刺激分子對不同的底盤細(xì)胞影響也不同。我們將進(jìn)一步對CAR元件進(jìn)行組合的優(yōu)化，后續(xù)將其轉(zhuǎn)染不同的底盤細(xì)胞，包括T細(xì)胞、iNKT細(xì)胞等，為后續(xù)生物學(xué)實驗奠定基礎(chǔ)。

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