細(xì)胞外囊泡在肝癌及胰腺癌診斷中的研究進(jìn)展

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是細(xì)胞主動(dòng)分泌的一類具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的、納米到微米級(jí)大小的膜囊泡總稱，其種類多樣，具有不同的理化性質(zhì)和生化特征。幾乎所有的細(xì)胞會(huì)分泌EVs，然而EVs一度被認(rèn)為只是細(xì)胞向外運(yùn)輸排泄物質(zhì)的一種途徑，在很長的一段時(shí)間內(nèi)，EVs并未引起人們的重視。近年來隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)EVs可以作為遺傳信息的傳遞者，攜帶和傳遞信號(hào)分子運(yùn)輸?shù)较噜徏斑h(yuǎn)處的細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)

。肝癌和胰腺癌是常見的惡性腫瘤，由于缺乏早期典型的臨床表現(xiàn)，很多患者錯(cuò)過了根治手術(shù)的時(shí)機(jī)

。EVs攜帶來源腫瘤細(xì)胞內(nèi)特定的核酸、蛋白等分子物質(zhì)，具有很強(qiáng)的腫瘤特異性，在肝癌和胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演十分重要的角色，在早期診斷和治療中具有巨大臨床應(yīng)用前景

。本文就EVs的種類和功能，分離、提純和鑒定技術(shù)，以及在肝癌和胰腺癌中的診斷及預(yù)后中的研究進(jìn)展作一概述。

1 EVs的概述及分類

EVs是一類包含由細(xì)胞釋放的各種生物分子的脂質(zhì)雙層封閉結(jié)構(gòu)，內(nèi)含豐富的核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，參與細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息交流，是細(xì)胞間通訊的主要形式。根據(jù)其來源、大小、生物特性和產(chǎn)生方式的不同，主要分為三類，分別為外泌體(exosomes)、微囊泡(micorovesicles，MVs)和凋亡小體(apoptotic bodies)，其中起關(guān)鍵性作用的是外泌體

。

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)與細(xì)胞膜融合形成的直徑為40～100 nm的納米囊泡，以外分泌的形式釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，在電鏡下觀察呈杯狀或碟狀結(jié)構(gòu)。其形成經(jīng)歷內(nèi)吞-MVBs形成-外泌體分泌3個(gè)階段

。CD63、CD81、CD9是其標(biāo)志物，CD63在幾乎所有的外泌體中表達(dá)，CD81、CD9在部分外泌體中表達(dá)。MVs是由細(xì)胞膜向外出芽方式形成的直徑為50～1 000 nm的異質(zhì)性囊泡，其形成與細(xì)胞雙層的磷脂不對(duì)稱分布有關(guān)，膜聯(lián)蛋白(Annexin)A1是其特殊的標(biāo)志物，在癌細(xì)胞中，MVs的產(chǎn)生明顯增多

。凋亡小體是細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞骨架破裂時(shí)，質(zhì)膜向外起泡，釋放包膜的細(xì)胞碎片。這個(gè)過程包括凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚，經(jīng)核碎片包裹進(jìn)不同的膜囊泡中，囊泡脫落形成凋亡小體

(見表1、圖1)。

3)春季低空切變和地面倒槽是引發(fā)暴雨最重要的影響系統(tǒng)。夏季各月的主要影響系統(tǒng)存在較大的差別,6月份最常見的天氣系統(tǒng)配置是高空槽東移,中低層有切變或急流配合,地面有倒槽或低壓存在,另外6月時(shí)東北冷渦與地面倒槽或低壓的配合也是典型的系統(tǒng)配置,此時(shí)低空急流的強(qiáng)度在一定程度上影響著降水量的大小。7月的暴雨過程主要受到副高和臺(tái)風(fēng)的影響。8月份臺(tái)風(fēng)引起的暴雨天氣過程頻數(shù)明顯增多。秋季的暴雨主要是秋臺(tái)風(fēng)導(dǎo)致。

下種按要求的穴距順向擺放在溝中央，使有芽的一頭朝同一方向。用莖段做種的，最好在3月1日開始用雙膜先育苗，待有芽后播種，這樣既可看清發(fā)芽位置又能適期播種。播種后覆土成壟，為了方便以后施肥澆水在壟頂開一條淺溝。

2 EVs組成、生物學(xué)功能與癌癥的關(guān)系

EVs富含多種生物活性物質(zhì)，主要由蛋白質(zhì)、核苷酸(DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等)和脂質(zhì)(膽固醇、磷脂、磷脂酰乙醇胺等)組成。EVs表面有脂質(zhì)雙分子層包裹，使其能保護(hù)內(nèi)容物免受體液中存在降解酶的影響

。

3 EVs的分離純化技術(shù)與鑒定

隨著市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，評(píng)估行業(yè)已經(jīng)成為一個(gè)十分重要的中介服務(wù)行業(yè)。為規(guī)范評(píng)估從業(yè)行為，遵循權(quán)利與義務(wù)對(duì)等的原則，本條明確規(guī)定了評(píng)估專業(yè)人員的法定義務(wù)，從而督促評(píng)估專業(yè)人員誠實(shí)守信、勤勉盡責(zé)，依法獨(dú)立、客觀、公正從事業(yè)務(wù)。

4 EVs的鑒定

超速離心法是目前最常用的EVs分離純化方法，將體液中的EVs通過上述技術(shù)分離純化后，分離得到的囊泡需要進(jìn)行鑒定，通過電子顯微鏡檢測，可以觀察到其大小及形態(tài)特征，從而判定分離獲得的囊泡是EVs。其中，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)

可以觀察到EVs三維表面圖像，常呈蝶形或茶托狀形態(tài)。透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)

是使用最廣泛的納米顯微成像技術(shù)，與掃描電鏡相比，透射電鏡具有更高的分辨率，最高可達(dá)到1 nm，能更清楚地觀察到囊泡。冷凍顯微鏡(cryo-electron microscopy)

可以直接檢測分析冰凍囊泡樣本，與掃描及透射電鏡相比，無需對(duì)囊泡樣本進(jìn)行固定、染色等前處理，在冰凍條件下對(duì)囊泡進(jìn)行分析，避免了水或溶劑結(jié)晶對(duì)樣本結(jié)果的破壞及囊泡樣本干燥引起的結(jié)構(gòu)變化。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)

具有納米級(jí)的橫向和垂直分辨率，可以在水溶液中直接進(jìn)行測量，產(chǎn)生三維圖像。經(jīng)電鏡檢測，證實(shí)離心后的囊泡顆粒為EVs，再進(jìn)行納米顆粒追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)

，測定囊泡樣本中顆粒的粒徑分布及濃度。如需檢測EVs中蛋白質(zhì)及其功能，可利用外泌體的蛋白標(biāo)志物行免疫印跡法(Western blotting，WB)

、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

、質(zhì)譜分析

等。如需檢測EVs中的RNA、miRNA、circRNA等核酸及其功能，可行高通量測序技術(shù)

、滴滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)

、qRT-PCR

、傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)

以及小顆粒流式細(xì)胞儀術(shù)(small particle flow cytometry)

等鑒定技術(shù)，其中，qRT-PCR技術(shù)多應(yīng)用于臨床(見表3)。

5 EVs在肝癌中的診斷價(jià)值

肝癌患者EVs內(nèi)外泌體中l(wèi)ncRNA也大量富集，并與miRNA一同調(diào)節(jié)肝癌發(fā)生和發(fā)展，在HCC的診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)中具有重要意義。有研究收集60例HCC患者的血清，并與42例慢性丙型肝炎患者和18名健康受試者進(jìn)行對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)HCC患者血清EVs中的lncRNA-RP11-513I15.6、miR-1262和mRNA-RAB11A三種RNA在HCC患者高表達(dá)，可區(qū)分HCC患者與慢性丙型肝炎患者和健康受試者，其中l(wèi)ncRNA-RP11-513I15.6、miR-1262可以靶向mRNA-RAB11A作用于HCC細(xì)胞

。杭州市第一人民醫(yī)院徐紅教授共招募301例受試者，包括HCC組(60例)、肝硬化組(85例)、慢性乙型肝炎組(96例)和健康受試者(60名)。收集了其中55例HCC患者、60例慢性乙型肝炎患者和60名健康受試者的血清作為獨(dú)立隊(duì)列，運(yùn)用外泌體分離試劑盒分離血清外泌體和總RNA。采用TaqMan PCR檢測lncRNA的相對(duì)水平，結(jié)果顯示，HCC組的lncRNA-ENSG00000258332.1和lncRNA-LINC00635水平顯著高于其他組。肝癌中較高的ENSG00000258332.1水平與門靜脈腫瘤栓塞、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和總生存期均有關(guān)，提示血清EVs lncRNA-ENSG00000258332.1、lncRNA-LINC00635和AFP聯(lián)合檢測對(duì)HCC的診斷和預(yù)后具有重要價(jià)值，可作為其診斷標(biāo)志物

。Lee等

一項(xiàng)研究納入了79例HCC患者，使用ExoQuick外泌體提取試劑盒沉淀溶液從血清樣本中提取外泌體。為了驗(yàn)證從血清中分離外泌體，進(jìn)行了外泌體標(biāo)記的免疫印跡和納米顆粒的表征。循環(huán)外泌體miR-21和lncRNA-ATB均與TNM分期及T分期、門靜脈血栓形成等其他預(yù)后因素有關(guān)。采用Cox回歸檢驗(yàn)的多因素分析發(fā)現(xiàn)，較高的miR-21和較高的lncRNA-ATB均是死亡率和疾病進(jìn)展的獨(dú)立預(yù)測因子，同時(shí)具有較大的腫瘤。當(dāng)外泌體miR-21和lncRNA-ATB循環(huán)水平較高時(shí)，患者的總生存期和無進(jìn)展生存期顯著降低。因此，可以認(rèn)為循環(huán)血液中外泌體miR-21和lncRNA-ATB是HCC新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

隨著RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，鑒定出數(shù)以萬計(jì)的EVs內(nèi)外泌體含有circRNAs，這是一類非編碼RNA，它們可以與miRNA和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。EVs中的circRNAs參與癌癥的多種生物學(xué)功能，發(fā)揮重要的調(diào)控作用，在HCC疾病的發(fā)生和發(fā)展中同樣具有重要意義。Huang等

研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-100338在轉(zhuǎn)移HCC細(xì)胞及其分泌的外泌體中均高表達(dá)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，外泌體circRNA-100338的過表達(dá)或下調(diào)可顯著增強(qiáng)或降低HCC細(xì)胞的侵襲能力。隨后，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，外泌體circRNA-100338影響HUVECs的增殖、血管生成、通透性和血管管腔形成能力，并影響腫瘤轉(zhuǎn)移。接受根治性肝切除術(shù)的HCC患者血清中外泌體中circRNA-100338的持續(xù)高表達(dá)可能是肺轉(zhuǎn)移和生存不良的危險(xiǎn)指標(biāo)。Wang等

發(fā)現(xiàn)，EVs circPTGR1亞型可以通過miR-449a-MET途徑促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)來自非轉(zhuǎn)移性HepG2、低轉(zhuǎn)移性和高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的外囊泡circRNA并行生物信息學(xué)、共表達(dá)分析和熒光素酶分析等功能檢測，發(fā)現(xiàn)circPTGR1在HCC患者的EVs中上調(diào)，并影響預(yù)后。circPTGR1與MET競爭靶向miR-449a，敲低circPTGR1表達(dá)可抑制與HCC細(xì)胞的遷移和侵襲。較高的轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞可以通過攜帶circPTGR1的EVs賦予低轉(zhuǎn)移性或無轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞這種潛能，從而增加這些細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Zhang等

發(fā)現(xiàn)，脂肪分泌的circRNA可調(diào)節(jié)HCC的去泛素化，從而促進(jìn)細(xì)胞生長。觀察到EVs中circRNA去泛素化(circ-DB)在具有較高體脂比的肝癌患者中被上調(diào)。EVs-circ-DB通過抑制miR-34a和激活與去泛素化相關(guān)的USP7來促進(jìn)HCC生長并減少DNA損傷。因此，脂肪EVs對(duì)HCC細(xì)胞的作用可以通過敲除circ-DB來逆轉(zhuǎn)。通過抑制miR-34a和激活USP7/Cyclin A2信號(hào)通路，脂肪細(xì)胞分泌的EVs circRNA具有促進(jìn)HCC腫瘤生長作用，并減少HCC細(xì)胞中DNA的損傷。circRNA_100284可被包含在由誘導(dǎo)細(xì)胞釋放的EVs中，通過與miR-217相互作用來調(diào)節(jié)并影響正常HCC增殖，促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化

。EVs表面整合素種類決定轉(zhuǎn)移靶器官的特異性。

原發(fā)性肝癌在我國常見惡性腫瘤中排第4位，在全世界排第5位，在腫瘤致死病因中我國排第2位，全世界排第2位

。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌中主要的類型，占85%～90%，其主要的治療手段是肝切除術(shù)。因缺乏早期典型的臨床表現(xiàn)，很多HCC患者在確診時(shí)已喪失根治性切除機(jī)會(huì)。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)作為HCC的血清標(biāo)志物是臨床診斷HCC的重要方法，但其靈敏度相對(duì)較低，部分早期HCC患者無法通過AFP進(jìn)行診斷

。介入栓塞、靶向治療以及化療等只能有限延長晚期HCC患者的生存期。早期診斷(腫瘤大小≤2 cm)的患者，經(jīng)有效治療后5年生存率超過70%，對(duì)于HCC患者，挖掘潛在的生物標(biāo)志物一直是HCC診療領(lǐng)域的一個(gè)重要議題。目前亟需可靠的血清生物標(biāo)志物來檢測早期HCC，以改善HCC患者的預(yù)后。近年來，液體活組織檢查已成為一種有前景的癌癥生物學(xué)技術(shù)，使用液體活檢腫瘤來源的循環(huán)基因分子可以通過最小創(chuàng)傷來達(dá)到活檢診斷的目的，EVs是液體活檢中最重要的組成部分之一，外泌體在EVs中占主導(dǎo)地位

。

此外，肝癌EVs外泌體中的膜蛋白也可聯(lián)合miRNA調(diào)控肝癌的發(fā)生和發(fā)展，Gai等

發(fā)現(xiàn)，高爾基體膜蛋白1(Golgi membrane protein 1，GOLM1/GP73)是HCC的血清標(biāo)志物。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通過刺激GOLM1的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。mTOR是miR-145負(fù)調(diào)控因子，miR-145通過靶向GOLM1基因的編碼序列抑制GOLM1的表達(dá)。GOLM1與miR-145在人肝癌組織中呈負(fù)相關(guān)。富含GOLM1的EVs激活受體細(xì)胞的糖原合酶激酶-3β/基質(zhì)金屬蛋白酶(glycogen synthase kinase-3β/matrix metalloproteinase,GSK-3β/MMPs)信號(hào)軸，加速細(xì)胞增殖和遷移。相反，miR-145抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。所以，mTOR/miR-145/GOLM1信號(hào)通路應(yīng)該是HCC治療的靶向信號(hào)通路。Li等

研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酰氧化酶樣蛋白4(lysyl oxidase like protein 4，LOXL4)在肝癌組織中普遍上調(diào)，與肝癌分化、血管浸潤和腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，LOXL4的過表達(dá)促進(jìn)了體外HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，提示預(yù)后不良。肝細(xì)胞來源的外泌體在肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)LOXL4，并通過過氧化氫介導(dǎo)的機(jī)制激活依賴于胺氧化酶活性的FAK/Src通路，通過旁分泌機(jī)制將LOXL4轉(zhuǎn)移到HUVECs，促進(jìn)肝腫瘤血管生成。另一研究顯示，HCC細(xì)胞可釋放包含SMAD家族成員-3(SMAD3)蛋白和mRNA的EVs，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到分離的HCC細(xì)胞，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和肺轉(zhuǎn)移瘤的形成。此外，研究還發(fā)現(xiàn),HCC患者外周血EVs中存在豐富的SMAD3，其水平與疾病分期及原發(fā)腫瘤的SMAD3表達(dá)有關(guān)

，為HCC診斷以及轉(zhuǎn)移檢測血清標(biāo)志物的研究提供了證據(jù)(見表4)。綜上所述，EVs有可能成為診斷早期HCC及評(píng)價(jià)預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，外泌體在其中發(fā)揮重要作用。

HCC患者EVs內(nèi)外泌體中的miRNA水平與HCC的診斷和預(yù)后有關(guān)。Cho等

對(duì)28名健康人、60例慢性肝病患者和90例HCC患者的血清樣本進(jìn)行qRT-PCR分析驗(yàn)證癌細(xì)胞源性EVs中miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-10b-5p和miR-215-5p過表達(dá)，與HCC患者的無病生存期有顯著關(guān)系，是評(píng)估HCC預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。Zhou等

發(fā)現(xiàn)，EVs中miR-21的富集與HCC患者的癌癥相關(guān)纖維細(xì)胞活化程度和血管生成能力增高有關(guān)。HCC細(xì)胞具有將正常肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)換為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的強(qiáng)大能力。數(shù)據(jù)顯示，HCC細(xì)胞分泌直接靶向PTEN的外泌體miR-21，從而導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞中PDK1/AKT信號(hào)通路被激活?；罨陌┌Y相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌血管生成細(xì)胞因子(包括VEGF、MMP2、MMP9、bFGF和TGF-β)進(jìn)一步促進(jìn)了癌癥的發(fā)展。Huang等

收集了廣州南方醫(yī)院40例HCC患者血清，其中20例伴有肺轉(zhuǎn)移，超速離心得到外泌體，通過高通量測序、PCR等研究方式，發(fā)現(xiàn)miR-18a、miR-27a、miR-20b、miR-221在HCC肺轉(zhuǎn)移中高表達(dá)，可作為評(píng)估HCC預(yù)后的臨床工具。一項(xiàng)肝癌和肝硬化患者血清中外泌體miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122、miR-148a和miR-1246的血清外泌體水平在肝癌組明顯高于肝硬化組和正常對(duì)照組，但與慢性肝炎組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與AFP聯(lián)合可以提高診斷準(zhǔn)確性，可以用于早期HCC和肝硬化的鑒別

。另一項(xiàng)研究表明，經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療的HCC患者，外泌體血清中miR-122含量比治療前降低，提示miR-122的升高與HCC有關(guān)

。Matsuura等

將來自人HCC細(xì)胞系的EVs在缺氧或常氧條件下培養(yǎng)24 h，使用ExoQuick-TC分離，并與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)共同培養(yǎng)以評(píng)估血管生成活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧下的EVs顯著增強(qiáng)了HUVECs的成管能力。細(xì)胞和EVs中miR-155在缺氧條件下均顯著上調(diào)。敲低HCC細(xì)胞中miR-155抑制了內(nèi)皮細(xì)胞在低氧條件下EVs對(duì)成管能力的促進(jìn)作用，而HCC血漿中EVs miR-155的高表達(dá)與早期復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，這些均提示HCC EVs外miR-155可能影響HCC細(xì)胞的血管生成活性，并與肝癌的復(fù)發(fā)有關(guān)。Nakano等

在大鼠HCC實(shí)驗(yàn)中通過微陣列分析顯示，miR-92b是HCC EVs中高度表達(dá)的微核糖核酸之一。miR-92b的過表達(dá)通過EVs miR-92b的活性釋放增強(qiáng)了HCC細(xì)胞系的遷移能力。肝癌衍生的EVs miR-92b轉(zhuǎn)移到NK細(xì)胞中，導(dǎo)致CD69和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性下調(diào)。此外，在HCC患者行肝移植前血清EVs中miR-92b高表達(dá)，在肝移植術(shù)后HCC復(fù)發(fā)患者中，miR-92b的表達(dá)水平維持在較高水平。這些均提示EVs中的miR-92b可以預(yù)測移植后HCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)假設(shè)函數(shù)ψ(t)，滿足平方可積的條件，同時(shí)ψ(t)∈L2(R)，對(duì)ψ(t)進(jìn)行傅里葉變換獲取傅里葉變換結(jié)果φ(ω)，若φ(ω)滿足如下所示的允許性條件：

考慮到EVs在疾病病理生理過程中的關(guān)鍵信使作用，新的EVs分離方法和分析平臺(tái)正在積極開發(fā)，以解決EVs在疾病進(jìn)展中的作用?；贓Vs的密度、親和力和大小，已經(jīng)開發(fā)了各種分離EVs的技術(shù)。差速超速離心法(differential ultracentrifugation，DU)是最經(jīng)典的、也是人們常用的EVs分離方法，被視為EVs提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該方法最常見的實(shí)施方式是差速離心，先低速離心去除細(xì)胞及碎片，再通過超速離心使EVs形成沉淀，得到純度更高的EVs。DU的缺點(diǎn)是需要配備高速離心機(jī)，操作復(fù)雜、耗時(shí)2～18 h，反復(fù)的高速離心會(huì)壓迫EVs甚至致其損壞破裂，造成EVs損失和質(zhì)量降低。該方法難以處理大批量樣本或應(yīng)用到臨床檢測中

。聚合沉淀法(polymer precipitation，PP)主要以商業(yè)化ExoQuick沉淀試劑盒和Total Exosome分離試劑盒為代表

，優(yōu)點(diǎn)是得到的EVs量多，操作簡單，所需要的標(biāo)本量小，不需要超速離心機(jī)，可以應(yīng)用于臨床，缺點(diǎn)是EVs純度不及DU

。尺寸排阻色譜法(size-exclusion chromatography，SEC)

獲得的微粒比DU少，但純度較高。其他方法還有切向流超濾法(tangential flow ultrafiltration，TFU)

、免疫親和捕獲法(immunoaffinity capture，ICP)

、微流控(microfluidics)芯片分離法

等，總結(jié)如表2所示。

6 EVs在胰腺癌中的診斷價(jià)值

胰腺癌是一種高度致命的癌癥，在我國腫瘤的致死率排名第4位，由于缺乏典型的臨床癥狀和解剖位置，癌胚抗原CEA、血清CA19-9缺乏特異性

，診斷十分困難，確診已經(jīng)是晚期，化療及放療治療腫瘤易出現(xiàn)耐藥，早期出現(xiàn)播散，這些均是導(dǎo)致高死亡率的因素

。因此，發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物對(duì)早期胰腺癌的檢測及預(yù)后具有重要意義。有研究提示，EVs在胰腺癌中富集，容易在患者的體液中檢測到，它們中的蛋白質(zhì)和RNA在正常人、炎癥性疾病、良性胰腺腫瘤和惡性胰腺癌中存在差異，可用于疾病的診斷。胰腺癌患者EVs中外泌體占主導(dǎo)地位，外泌體miRNA水平與其臨床病理特征及預(yù)后有聯(lián)系

。

胰腺癌患者血清EVs中外泌體miR-17-5p水平高于非胰腺癌患者和健康參與者。高表達(dá)的miR-17-5p提示胰腺癌患者出現(xiàn)晚期腫瘤轉(zhuǎn)移

。Goto等

發(fā)現(xiàn)了EVs外泌體中miR-191、miR-21、miR-451a在胰腺癌患者和胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)患者中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。這三種EVs miRNA的水平可作為胰腺癌和IPMN患者的早期診斷和進(jìn)展標(biāo)志物，效果優(yōu)于循環(huán)miRNA。Kawamura等

的研究中，來自胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)門靜脈血中miR-4525、miR-451a和miR-21顯著上調(diào)，可能是胰腺癌患者復(fù)發(fā)和生存期較差生物標(biāo)志物。Pu等

收集了36例胰腺癌患者和65名健康對(duì)照者血漿中EVs，通過陽離子脂質(zhì)體納米顆粒生物芯片分析外泌體中miR-21的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者中的ex-miR-21表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，ex-miR-21能夠區(qū)分早期胰腺癌患者和健康對(duì)照者，可以作為早期診斷胰腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物。Nakamura等

通過內(nèi)鏡逆行胰管造影術(shù)收集了27例胰腺癌患者和8例慢性胰腺炎患者的胰液，通過超速離心法提取外泌體，定量比較了兩組患者中EVs miR-21和miR-155的相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與胰腺炎患者相比，胰腺癌患者EVs miR-21和miR-155的相對(duì)水平顯著更高。

胰腺癌患者EVs外泌體中蛋白表達(dá)水平也與胰腺癌有聯(lián)系，Armacki等

通過小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶D1(protein kinase D1，PRKD1)抑制PDAC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，且表達(dá)失調(diào)。他們分析了來自人類胰腺組織芯片的數(shù)據(jù)，與非腫瘤胰腺組織相比，人PDAC的PRKD1水平降低。PRKD1的缺失導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞系中皮層蛋白的磷酸化減少，質(zhì)膜上f-肌動(dòng)蛋白增加和EVs釋放增加，這些釋放的EVs促進(jìn)了小鼠移植瘤和胰腺腫瘤向肺的轉(zhuǎn)移。Shin等

研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞膜EVs分泌物中存在堿性磷酸酶胎盤樣2(alkaline phosphatase placental like 2，ALPPL2)蛋白，這種與生殖細(xì)胞相關(guān)的堿性磷酸酶家族蛋白可通過GPI錨定蛋白存在于細(xì)胞膜上，經(jīng)常見于生殖細(xì)胞癌癥患者和懷孕女性的血清中。許多GPI錨定蛋白作為外泌體和MVs的一部分，以膜結(jié)合的形式從細(xì)胞中釋放出來，胰腺癌患者比健康者釋放增多，提示ALPPL2可作為胰腺癌的診斷標(biāo)志物

。Kimura等

發(fā)現(xiàn)，其在PDAC EVs外泌體中細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4(cytoskeleton associated protein 4，CKAP4)升高，可能是PDAC早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。CKAP4是一種新發(fā)現(xiàn)的Dickkopf1(DKK1)受體。PDAC細(xì)胞來源的EVs可通過DKK1依賴性內(nèi)吞途徑調(diào)節(jié)CKAP4分泌。PDAC患者血清中EVs CKAP4水平顯著高于健康對(duì)照組，術(shù)后患者血清中也基本檢測不到。ZIP4是一種在多種癌癥中存在差異表達(dá)的蛋白，并與包括胰腺癌在內(nèi)的癌癥進(jìn)展密切相關(guān)。通過來自胰腺癌患者、良性胰腺疾病患者、膽道疾病患者和健康受試者的臨床血液樣本蛋白組學(xué)分析，胰腺癌患者中的EVs外泌體ZIP4表達(dá)最高，能顯著促進(jìn)胰腺癌的生長，提示EVs中的ZIP4可作為一種新的胰腺癌診斷生物標(biāo)志物

。一項(xiàng)前瞻性研究提示，Glypican 1蛋白(Glypican 1 protein，GPC1)在未行手術(shù)治療的PDAC患者血清中EVs中表達(dá)陽性，與無癌癥史對(duì)照患者進(jìn)行比較，胰腺癌組GPC1陽性率明顯高于對(duì)照組

。Jiang等

發(fā)現(xiàn)，在放療后的胰腺癌患者殘留的腫瘤EVs通過傳遞miR-194-5p，誘導(dǎo)細(xì)胞G

/S期阻滯，并促進(jìn)DNA損傷反應(yīng)，釋放大量的PGE2，促進(jìn)殘留的腫瘤細(xì)胞增殖，并協(xié)調(diào)再種群級(jí)聯(lián)，調(diào)控E2F3的表達(dá)，減輕放療對(duì)癌細(xì)胞HMGA2的侵害作用。在放療后復(fù)發(fā)的患者中，癌細(xì)胞EVs中的miR-194-5p、PGE2和HMGA2與正常組織相比，明顯升高。以上研究發(fā)現(xiàn)，EVs外泌體有望成為胰腺癌早期診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物(見表5)。

改革開放以來，中國高等教育發(fā)展取得了巨大成就，已經(jīng)建成世界規(guī)模最大的高等教育體系，并擁有一批高水平的大學(xué)，奠定了高教強(qiáng)國“中國模式”的客觀基礎(chǔ)，但是，高教強(qiáng)國“中國模式”要得到世界范圍的認(rèn)同并對(duì)世界高等教育發(fā)展產(chǎn)生重要影響，還面臨許多現(xiàn)實(shí)的困境。

7 總結(jié)和展望

以上研究表明，EVs中的外泌體作為肝癌和胰腺癌早期診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物有關(guān)鍵性的作用，并具有以下優(yōu)勢：(1)EVs粒徑較小，通透性強(qiáng)，容易到達(dá)肝癌和胰腺癌患者體液中，濃度較高，易于檢出，取樣創(chuàng)傷性小，可對(duì)腫瘤患者實(shí)施全程實(shí)時(shí)監(jiān)控；(2)EVs能夠直接反映腫瘤來源組織細(xì)胞的代謝狀態(tài)和生物學(xué)特性，能夠攜帶腫瘤來源組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)，特異性極強(qiáng)；(3)EVs的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可保護(hù)其中攜帶的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子免受降解。血漿EVs中miRNA在不同的儲(chǔ)存條件下具有較好的穩(wěn)定性，4 ℃下保存96 h或-80 ℃長時(shí)間保存的情況下，其RNA豐度未發(fā)生明顯變化

，穩(wěn)定性強(qiáng)，適合作為分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床；(4)許多肝癌和胰腺癌患者體液蛋白質(zhì)和核酸已經(jīng)被證實(shí)為前瞻性的診斷生物標(biāo)志物，通過EVs富集可提高檢測效能；(5)EVs是大分子信息物質(zhì)的載體，在機(jī)體細(xì)胞信息交流、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的生理作用；(6)EVs還含有豐富的內(nèi)容物，包含豐富的核酸分子、無創(chuàng)性及檢測迅速等優(yōu)勢，使EVs有望成為應(yīng)用前景廣闊的新型循環(huán)生物標(biāo)志物，用于臨床疾病的輔助診斷。

隨著EVs檢測技術(shù)的不斷完善，EVs內(nèi)容物及功能的研究越發(fā)成熟，疾病相關(guān)EVs生物標(biāo)志物被大量發(fā)現(xiàn)，但至今尚無EVs分子標(biāo)志物進(jìn)入廣泛臨床應(yīng)用階段。EVs標(biāo)志物的臨床應(yīng)用仍有很多問題需要解決：(1)盡管近年來EVs純化方法快速發(fā)展，但針對(duì)臨床標(biāo)本，目前只局限于應(yīng)用外泌體提取試劑盒和qRT-PCR方法提取和鑒定外泌體，仍無快速、簡便、穩(wěn)定、高回收率、可操作性強(qiáng)的EVs純化方法，這嚴(yán)重制約了EVs的臨床應(yīng)用；(2)目前尚未制定統(tǒng)一的EVs標(biāo)本保存、純化及后續(xù)鑒定方法、詳細(xì)的操作規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制方法；(3)由于幾乎體內(nèi)所有細(xì)胞均可以分泌EVs，篩選組織特異性的EVs標(biāo)志物或分離鑒定病變組織特異性來源的EVs具有重要意義，但此方面標(biāo)志物研究仍較為欠缺。(4)EVs分子的細(xì)胞內(nèi)分選機(jī)制仍未完全闡明。EVs標(biāo)志物研究方興未艾，大量問題仍有待探索。相信隨著EVs基礎(chǔ)研究和純化檢測技術(shù)的發(fā)展，EVs將會(huì)更廣泛應(yīng)用于臨床診療，在不久的將來，EVs將會(huì)替代傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，將疾病診斷水平提升到一個(gè)新境界。

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