殺線蟲活性放線菌的篩選及鑒定

朱國興，焦 鈺，吳雅杰，樊炳君，葉秀娟，曹艷茹, 2, 3*

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.昆明學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南 昆明 650214；3.云南省高校蛭類資源開發(fā)與利用工程研究中心，云南 昆明650214)

線蟲病是一種分布較廣的土傳病害，其具有種類多、傳播途徑廣、繁殖能力強(qiáng)、危害程度大、寄主范圍廣和休眠體存活時(shí)間長等特點(diǎn)[1-3]．目前，已知的線蟲種類有100多種，可侵染的植物高達(dá) 5 000 種，大多數(shù)蔬菜、作物都能成為根結(jié)線蟲的寄主．根結(jié)線蟲主要通過風(fēng)、灌溉水、種子、農(nóng)用器械操作不當(dāng)以及單一作物種植等方式傳播[4-5]，給農(nóng)業(yè)、園林園藝等產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，全世界每年因線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá) 1 570 億美元[6]．線蟲已被多數(shù)國家列為植物檢疫對象．

目前，對線蟲病的防治手段主要有農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治和生物防治[7]．傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治通過輪作、間作、選用無蟲地塊育苗等方式防治根結(jié)線蟲，但該方式見效慢、時(shí)間長、防治效率低，很難控制線蟲病的發(fā)生和危害．物理防治主要通過高溫悶棚、水淹處理等方式進(jìn)行防治，方法雖然簡便易行，但無法殺死土壤更深層的線蟲和蟲卵．化學(xué)手段是目前最主要的線蟲防治方法，化學(xué)殺蟲劑能夠短時(shí)間內(nèi)快速殺死線蟲，但殺蟲劑的普遍使用帶來了農(nóng)殘高、易造成人畜中毒、農(nóng)業(yè)面源污染、線蟲易產(chǎn)生抗藥性等一系列問題[8]．而生物防治有著不易產(chǎn)生抗性及生態(tài)安全等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，生防微生物作為生物防治的方式之一，近年來已逐漸成為研究熱點(diǎn)．目前，常用的微生物源殺蟲劑主要有兩大類，一類是以淡紫擬青霉為代表的真菌殺線蟲劑，其不僅可以殺死幼蟲，而且還可以殺死成蟲[11]；另一類是以阿維菌素為代表的微生物代謝產(chǎn)物制劑．目前殺線蟲商品微生物制劑品種數(shù)量較少，挖掘?qū)€蟲具有生物活性的優(yōu)良微生物菌株，可為高效生物殺線蟲菌劑的開發(fā)提供研究資源．然而，常規(guī)環(huán)境下的微生物菌種已被國內(nèi)外的科研工作者反復(fù)篩選和利用，因此從特殊環(huán)境或者微生物研究較少的生境中尋找新的活性菌株是快速獲得目標(biāo)微生物的有效途徑[12-13]．

放線菌(Actinomycete)在自然界中分布廣泛，其可以產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物．世界上已發(fā)現(xiàn)的抗生素大約有2/3是由放線菌產(chǎn)生的[14-17]，殺線蟲農(nóng)用抗生素—阿維菌素就是由鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生．為了挖掘更多活性放線菌資源，人們把目光轉(zhuǎn)向了特殊環(huán)境或者微生物研究較少的生境，例如：陳聰聰?shù)萚18]用稀釋涂布平板法對采自青島近海海域的樣品進(jìn)行放線菌分離，經(jīng)篩選得到HT-8(Streptomycestermitum)線蟲校正死亡率為88.30%；阿爾新等[19]從新疆高鹽環(huán)境—阿勒泰福?？h鹽場和羅布泊中分離獲得了14株具有殺線蟲活性的放線菌；曾慶飛等[20]從海南東寨港紅樹林等生境分離得到的放線菌DA07118殺線蟲活性高達(dá)100%．

云南轎子山地處昆明北部東川區(qū)與祿勸縣交界處，海拔 4 344.1 m，被譽(yù)為滇中第一高峰，地形復(fù)雜，是探究生物多樣性分布格局及其影響因素的理想之地[21]．轎子山自然保護(hù)區(qū)還具有滇中地區(qū)最為完整和豐富的植被以及生境垂直帶譜，是一個(gè)巨大的天然物種基因庫，目前已有對該地動物和植物的相關(guān)調(diào)查報(bào)道，但對于組成轎子山生態(tài)系統(tǒng)重要一員的微生物研究卻為空白．轎子山土壤類型較豐富，有紅壤、黃棕壤、棕壤、暗棕壤、棕色針葉林土以及亞高山草甸土等類型[22]，加之大面積連片存在的多種原生植被類型，成了放線菌資源篩選的理想生境．白云鄂博稀土礦為本實(shí)驗(yàn)樣品的另一個(gè)來源．白云鄂博位于內(nèi)蒙古高原南部，海拔為 2 000～3 000 m，該礦區(qū)為一座大型的鐵、鈮、稀土等多種金屬共生礦，其稀土元素資源量占世界上已知稀土元素資源總量的2/3以上[23]．白云鄂博稀土礦長達(dá)60余年的露天開采，致使周圍環(huán)境累積了大量重金屬和放射性元素，形成了典型的極端環(huán)境[24-26]．樊永軍等[27]從白云鄂博稀土礦分離出14株耐高輻射元素放線菌；曹艷茹等[28-29]從該礦區(qū)分離得到新種Actinorectisporametalli和Kibdelosporangiummetalli．這表明白云鄂博稀土礦存在特殊的菌種資源，但目前尚未見到對白云鄂博稀土礦放線菌殺線蟲活性菌株的研究報(bào)道．

本研究利用稀釋涂布平板法對轎子山自然保護(hù)區(qū)和白云鄂博稀土礦的放線菌進(jìn)行分離，并篩選分離放線菌的殺線蟲活性，以期為殺線蟲菌劑的研發(fā)提供菌種資源．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤采集

將從轎子山自然保護(hù)區(qū)和白云鄂博稀土礦采集得到的90份樣品置于無菌袋中，4 ℃保存以待分離．

1.1.2 供試線蟲

秀麗隱桿線蟲由于具有繁殖簡單、生命周期短、基因組小、透明易觀察、體積小易操作等優(yōu)點(diǎn)，作為生物模型被廣泛用于農(nóng)業(yè)生防、細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和衰老研究等領(lǐng)域．此外，秀麗隱桿線蟲操作簡單、廉價(jià)、生命周期短的優(yōu)點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)的順利開展提供了保障．

在進(jìn)行殺線蟲活性篩選時(shí)，先對線蟲進(jìn)行活化．用竹簽挑取帶有線蟲的塊狀培養(yǎng)基，接種在涂布有250 μL大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)1 d后顯微觀察．對處于排卵期的線蟲進(jìn)行同步化處理并繼續(xù)培養(yǎng)至2齡幼蟲進(jìn)行洗脫備用．

1.1.3 放線菌分離培養(yǎng)基

根據(jù)放線菌的營養(yǎng)特點(diǎn)，選用改良HV培養(yǎng)基[30]、改良Bennet培養(yǎng)基[30]、小米液體培養(yǎng)基[30]、BP培養(yǎng)基[30]、淀粉酪蛋白培養(yǎng)基[31]、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[31]、可溶性淀粉-酵母提取物培養(yǎng)基[32]、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[33]、高氏1號培養(yǎng)基[33]、無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基[34]共10種培養(yǎng)基進(jìn)行放線菌的分離．

1.1.4 放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基

采用改良酵母膏-麥芽汁液體培養(yǎng)基進(jìn)行放線菌發(fā)酵液制備.培養(yǎng)基配方如下：酵母膏4 g、麥芽膏5 g、葡萄糖4 g、胰蛋白胨2 g、植物蛋白胨 1 g、微量鹽1 mL、復(fù)合維生素微量，pH7.3， 121 ℃ 滅菌30 min．

1.2 方法

1.2.1 放線菌分離

每份樣品稱取2 g，自然風(fēng)干7 d，100 ℃干熱處理1 h．加入裝有18 mL無菌水的三角瓶中，于28 ℃、200 r/min搖床震蕩30 min得到土壤懸液，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋至104倍．吸取0.2 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)30 d，挑取、純化菌株后，接種于改良酵母膏-麥芽汁斜面培養(yǎng)基和甘油管于4 ℃、-80 ℃保藏．

1.2.2 放線菌鑒定

觀察菌落特征.根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色、邊緣整齊度以及色素等進(jìn)行初步去重復(fù)后，采用酶法提取菌株總DNA[35]后，以細(xì)菌通用引物(上游引物PA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行16S rRNA基因的特異擴(kuò)增[36]，產(chǎn)物檢測合格后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序．測序結(jié)果利用EZ BioCloud網(wǎng)站[37]進(jìn)行比對后確定放線菌分類地位．

1.2.3 放線菌發(fā)酵濾液的制備

挑取已經(jīng)鑒定的放線菌單菌落接種至裝有100 mL改良酵母膏-麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)7 d． 5 000 r/min離心5 min去除菌體，取上清液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.4 殺線蟲活性放線菌篩選

向24孔透明板中分別加入300 μL發(fā)酵濾液和10 μL線蟲洗脫液(含線蟲約60條)混合均勻，放入20 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)．每株菌3次重復(fù)，以改良酵母膏-麥芽汁液體培養(yǎng)基和清水為對照．12，24，36，48 h后鏡檢，記錄各處理組的線蟲死亡情況．線蟲保持S形且活躍運(yùn)動即為存活；僵直不動，用牙簽或挑針戳動仍然僵直不運(yùn)動，再使用清水復(fù)活后仍不動則判為死亡．線蟲致死率為：致死率=[(處理前活線蟲數(shù)量-處理后活線蟲數(shù)量)/處理前活線蟲數(shù)量]×100%[38]．對初篩有殺線蟲活性的放線菌再次發(fā)酵，并按上述方法進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證．

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離結(jié)果

從轎子山土樣和白云鄂博稀土礦樣品中分離得到586株菌，經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定去重復(fù)后，共獲得257株放線菌，隸屬24科，37屬，見表1．

本次分離獲得最多的放線菌是鏈霉菌屬(36株)，占分離菌株的14.0%；假諾卡氏菌屬(30株)次之，占11.7%；野野村菌屬(27株)第3，占10.5%；而諾卡氏菌屬(23株)、韓國生工菌屬(20株)、小單孢菌屬(18株)、擬無枝酸菌屬(16株)分別占8.9%，7.8%，7.0%，6.2%．

本研究共獲得稀有放線菌[39-40]221株，占分離菌株總數(shù)的85.99%，這表明轎子山土樣和白云鄂博稀土礦蘊(yùn)藏著豐富的放線菌資源，可為殺線蟲生防菌株的篩選提供豐富的菌種材料．

2.2 放線菌對秀麗隱桿線蟲J2的活性篩選結(jié)果

利用24孔板篩選分離放線菌發(fā)酵液的殺模式生物秀麗隱桿線蟲活性，發(fā)現(xiàn)在供試的257株放線菌中，有33.46%的菌株即86株放線菌發(fā)酵液有殺線蟲活性，其中有23株菌殺線蟲致死率達(dá)50%以上，見表2．

表1 分離菌株的屬分布

表2 殺線蟲致死率在50%以上的放線菌信息

假諾卡氏菌屬是本研究分離最多的稀有放線菌類群(30株)，占分離菌株的11.7%．由于該屬菌株多數(shù)能產(chǎn)生抗生素[41]、免疫調(diào)控因子[42]以及降解芳香烴類[43]、鹵代化合物[44]、環(huán)醚污染物等[45]，因而在生物技術(shù)、制藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域備受關(guān)注．本研究分離到的30株假諾卡氏菌中，KC 97，KC 113，KC 16，KC 214(表2)對秀麗隱桿線蟲的致死率達(dá)50%以上，且4株菌都為首次報(bào)道對秀麗隱桿線蟲有致死活性，其中KC 97(Pseudonocardiaseranimata)對秀麗隱桿線蟲的致死率則高達(dá)90%，具有較大的線蟲生防菌劑開發(fā)潛力．

此外，本研究分離獲得的小單孢菌屬菌株也較多，有18株，占分離菌株的7.0%．小單孢菌屬菌株產(chǎn)生的活性次級代謝產(chǎn)物多達(dá)700多種，如刺孢霉素和慶大霉素[46]以及能抑制沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、恥垢分枝桿菌、膿腫分枝桿菌的次級代謝產(chǎn)物[47]．在本研究分離到的18株小單孢菌中，篩選到KC 107和KC 36對秀麗隱桿線蟲的致死率達(dá)80%以上，KC 161和KC 52對秀麗隱桿線蟲的致死率為50%以上(表2)，均為首次報(bào)到其對線蟲有致死活性．

其他類群的稀有放線菌，如KC 119(Amycolatopsisalba)能夠產(chǎn)生新的抑菌活性和細(xì)胞毒活性的吡啶鹽衍生物[49]、KC 250(Kibdelosporangiumaridum)能產(chǎn)生殺死腸道病毒的活性多肽化合物、KC 28(Nocardioidesluteus)能將脫乙酰巴卡汀III轉(zhuǎn)化成漿果赤霉素III等，本研究首次發(fā)現(xiàn)了以上菌株具有較好的殺線蟲活性(表2)，且是殺線蟲生防菌劑開發(fā)的潛力菌株．

經(jīng)16S rRNA基因測序和序列比對[50]，分析了對秀麗隱桿線蟲(J2)致死率在70%以上的5株活性放線菌的系統(tǒng)進(jìn)化地位(圖1)．由圖1可以看出，KC 97，KC 113分別與Pseudonocardiaseranimata和Pseudonocardiarhizophila聚在一支，且都被高達(dá)99%的自舉值所支持；KC 36和KC 107分別與Micromonosporapeucetia和Micromonosporaechinofusca聚在一支，且分別被100%和99%的自舉值所支持；殺線蟲致死率為75%的KC 240與Saccharothrixespanaensis聚為一支，自舉值為96%．以上高自舉值表明了5株菌系統(tǒng)進(jìn)化分析的穩(wěn)定性和可靠性．

圖1 對秀麗隱桿線蟲致死率高于70%的放線菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

根結(jié)線蟲是農(nóng)業(yè)特尤其是蔬菜的主要病害之一，每年給農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失．由于農(nóng)業(yè)防治和物理防治效果不理想，而化學(xué)防治危害性大，易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、抗藥性等一系列的負(fù)面效應(yīng)，因此生物防治已成為目前重視程度較高、研究較多的一種防治措施，且該防治方法符合生態(tài)農(nóng)業(yè)、環(huán)境友好的現(xiàn)代理念．目前，根結(jié)線蟲的生物防治研究雖然已取得了一定成果，但很多研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品較少．此外，見效慢、易受環(huán)境影響等問題使得生物防治的開發(fā)利用還有待進(jìn)一步研究．

本研究從稀土元素含量高、輻射較強(qiáng)的白云鄂博稀土礦和生物資源較豐富的轎子山兩地采樣，共分離獲得257株放線菌，其中有86株放線菌發(fā)酵液有殺線蟲活性，殺線蟲致死率達(dá)50%以上的菌株有23株．假諾卡氏菌屬的KC 97(Pseudonocardiaseranimata)和KC 113(Pseudonocardiarhizophila)對秀麗隱桿線蟲(J2)的致死率分別高達(dá)90.0%和87.0%．Pseudonocardia(假諾卡氏)屬菌株能產(chǎn)生很多有用的代謝產(chǎn)物，如殺菌素、新的制霉菌素的衍生物、萜烯類化合物、鐵載體、杰魯霉素等[51-52]，本研究首次發(fā)現(xiàn)了該屬菌株具有較好的殺線蟲活性．KC 107(Micromonosporaechinofusca)和KC 36(Micromonosporapeucetia)對秀麗隱桿線蟲(J2)的致死率分別為87.0%和82.4%，其中KC 36發(fā)酵液處理線蟲12 h的致死率達(dá)到了82.4%，表明該菌具有高效殺線蟲的潛力．KC 240(Saccharothrixespanaensis)發(fā)酵液的線蟲致死率為75.0%.Kalinovskaya等[48]早先報(bào)道了Saccharothrixespanensis能產(chǎn)生新的安古環(huán)素和抗菌活性的二酮哌嗪類化合物，而本研究首次報(bào)道了該菌株具有殺線蟲活性．

3.2 結(jié)論

保障國家農(nóng)產(chǎn)品安全是一個(gè)永恒課題，需要大家不斷為之努力．本研究共分離獲得257株放線菌，隸屬37屬、24科，其中有5株放線菌菌株KC 97(Pseudonocardiaseranimata),KC 113(Pseudonocardiarhizophila),KC 107(Micromonosporaechinofusca),KC 36(Micromonosporapeucetia)和KC 240(Saccharothrixespanensis) 具有較高的殺線蟲活性，為線蟲病害的生物防治菌劑開發(fā)提供了豐富的微生物菌種資源．但這5株放線菌的殺線蟲活性物質(zhì)、殺蟲機(jī)制以及生防菌劑的研發(fā)等仍需進(jìn)一步探索，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的線蟲病害防控提供理論基礎(chǔ)和研究資源．