分光光度計(jì)法測(cè)定不同分離源青枯雷爾氏菌菌液濃度

謝禎璐，楊夢(mèng)婕，顧康蝶，趙雨欣，周成希，賴先軍，顏 朗

(西昌學(xué)院攀西特色作物研究與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 西昌 615013)

0 引言

由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，簡(jiǎn)稱青枯菌)引起的植物細(xì)菌性青枯病是世界范圍內(nèi)傳播廣泛、危害嚴(yán)重、防治困難的土傳細(xì)菌病害之一。該菌可侵染54個(gè)科、450余種植物，嚴(yán)重制約了煙草、馬鈴薯、番茄和花生等多種經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)[1-2]。植物青枯病害的發(fā)生主要是由于病菌經(jīng)植株根部侵入木質(zhì)部后產(chǎn)生大量胞外多糖堵塞維管束，并在纖維素酶和果膠酶的共同作用下破壞植物導(dǎo)管，造成植株萎蔫并在短期內(nèi)迅速枯死[3]。由于目前尚未建立青枯雷爾氏菌濃度鑒定的準(zhǔn)確方法，這使得青枯病發(fā)病程度的快速檢測(cè)出現(xiàn)一定困難。因此，建立一種快速而準(zhǔn)確的青枯雷爾氏菌濃度測(cè)定方法將為青枯雷爾氏菌定量檢測(cè)提供幫助。

目前，已有多種細(xì)菌濃度測(cè)定的方法，如平板計(jì)數(shù)法、選擇性分離鑒定法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、顯微鏡計(jì)數(shù)法和紫外分光光度計(jì)法等[4-5]。其中，平板計(jì)數(shù)法主要測(cè)定菌液中的活菌數(shù)量，操作較復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)[6]。選擇性分離鑒定法可檢測(cè)出活菌數(shù)量，可反映病菌致病力的信息，但耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度較低[7]。基于PCR的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，RT-qPCR成為了一種簡(jiǎn)單、快速、高通量的細(xì)菌定量檢測(cè)方法，但是該方法所使用的儀器和試劑耗材都相對(duì)昂貴[8]。顯微鏡計(jì)數(shù)法中最常見的是血球板計(jì)數(shù)法，即用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下直接計(jì)數(shù)細(xì)菌總量[9]。紫外分光光度計(jì)法是運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌懸浮液的吸光度值，然后與相關(guān)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，根據(jù)建立的回歸方程確定細(xì)菌數(shù)量[10]。有研究根據(jù)朗伯-比爾定律表明，細(xì)菌懸浮液的吸光度與菌液濃度之間呈正相關(guān)[11-12]。因此，通過(guò)測(cè)定菌液的吸光度，并結(jié)合顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可根據(jù)吸光度值計(jì)算出菌液濃度[10,13]。

本研究結(jié)合顯微鏡計(jì)數(shù)法和分光光度計(jì)法，根據(jù)青枯雷爾氏菌菌液濃度與吸光度之間的線性關(guān)系，構(gòu)建青枯雷爾氏菌菌懸液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)分析不同分離源青枯雷爾氏菌以及不同稀釋液用于菌液濃度測(cè)定的差異，實(shí)現(xiàn)快速且準(zhǔn)確測(cè)定青枯雷爾氏菌菌液濃度的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種

青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)BMZ147860菌株，分離自江西省撫州市南豐縣煙草煙桿(RsA菌株)；B112711菌株，分離自福建福州番茄植株(RsB菌株)。

1.1.2 化學(xué)試劑

生理鹽水(0.9%NaCl)；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)：胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、NaCl 5 g/L、磷酸氫二鉀2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、瓊脂15 g/L。

1.1.3 主要儀器

Nanophotometer N60超微量分光光度計(jì)(德國(guó)Implen公司)；CX40M正置顯微鏡(寧波舜宇公司)；BS-1G恒溫振蕩器(常州市國(guó)旺公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

從平板挑取青枯雷爾氏菌單菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h用于檢測(cè)。

1.2.2 菌懸液濃度梯度稀釋

將不同分離源的菌懸液采用2種稀釋液處理，一是用TSB液體培養(yǎng)基直接稀釋菌懸液，二是將TSB液體培養(yǎng)基置換為生理鹽水進(jìn)行稀釋。為將菌液濃度控制在分光光度計(jì)檢測(cè)范圍內(nèi)，首先將原液初步稀釋為待檢測(cè)菌液，然后按照稀釋倍數(shù)1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶4、1∶6將待檢測(cè)RsA菌液用TSB液體培養(yǎng)基進(jìn)行濃度梯度稀釋；采取同樣方法按照稀釋倍數(shù)1∶1、1∶1.5、1∶1.75、1∶2.25、1∶3、1∶4、1∶6將待檢測(cè)RsB菌液稀釋濃度梯度。同理，將培養(yǎng)基置換為生理鹽水后按1∶1、1∶1.25、1∶1.75、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶4稀釋RsA菌液，按1∶1、1∶1.125、1∶1.25、1∶1.375、1∶1.5、1∶2、1∶2.5稀釋RsB菌液。

1.2.3 血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)

用移液槍吸取20 μL菌懸液滴于血球計(jì)數(shù)板上，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下觀察。計(jì)算計(jì)數(shù)室左上、左下、右上、右下、中央5個(gè)中號(hào)方塊的細(xì)菌數(shù)并取其平均數(shù)。利用公式M=N×25×10×1 000計(jì)算菌液濃度，其中N代表細(xì)菌個(gè)數(shù)平均數(shù)，M代表每毫升菌液濃度(cfu/mL)。

1.2.4 吸光度值的測(cè)定

取上述濃度梯度的菌液，按照溶質(zhì)類型分別對(duì)應(yīng)的生理鹽水或TSB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零，用超微量分光光度計(jì)Nanophotometer N60測(cè)定在600 nm波長(zhǎng)處菌液吸光度值，重復(fù)3次。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將吸光度值作為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，用基于R語(yǔ)言的BasicTrendline函數(shù)建立青枯雷爾氏菌菌液濃度與吸光度值之間線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 青枯雷爾氏菌菌懸液濃度與吸光度值測(cè)定

為消除TSB液體培養(yǎng)基本身的成分對(duì)吸光度的干擾，本研究分別使用TSB液體培養(yǎng)基和生理鹽水稀釋RsA和RsB青枯雷爾氏菌菌懸液，以未接菌種的對(duì)應(yīng)稀釋液為對(duì)照，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對(duì)不同濃度梯度的菌液進(jìn)行顯微鏡下計(jì)數(shù)。結(jié)果表明：2個(gè)菌株在2種稀釋液稀釋后吸光度值均在0.1～1.0范圍內(nèi)(表1)。RsA菌株經(jīng)TSB液體培養(yǎng)基6倍稀釋后的吸光度值為0.169 0，RsB菌株為0.196 0(表1)。將稀釋液更換為生理鹽水后，RsA菌株經(jīng)2.5倍稀釋后的吸光度值為0.168 0，RsB菌株為0.166 0。該結(jié)果表明：在原檢測(cè)液吸光度值相近的情況下，采用生理鹽水稀釋后的菌液吸光度比用TSB液體培養(yǎng)基稀釋更低，即在分光光度計(jì)有效檢測(cè)范圍內(nèi)，使用生理鹽水作為稀釋液時(shí)的可稀釋倍數(shù)范圍更窄。

表1 不同稀釋液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值

2.2 青枯菌菌懸液濃度與吸光度的線性關(guān)系分析

為確定青枯菌菌液濃度和吸光度間的相關(guān)線性關(guān)系，將不同分離源的2個(gè)菌株用TSB液體培養(yǎng)基和生理鹽水分別稀釋成7個(gè)濃度梯度，并以菌液吸光度為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)擬合線性曲線并建立相關(guān)線性回歸方程(圖1、表2)。結(jié)果表明，2個(gè)菌株菌液濃度和吸光度間均呈現(xiàn)線性關(guān)系。

圖1 青枯菌菌懸液濃度與吸光度相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 分光光度計(jì)法測(cè)定青枯菌菌懸液的方法特征

由表2可知，使用TSB液體培養(yǎng)基和生理鹽水作為稀釋液稀釋RsA和RsB均得到可靠的線性關(guān)系，線性方程相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.99以上。同一菌種在2種稀釋液稀釋條件下擬合曲線的斜率比較接近，RsA在不同稀釋液中吸光度平均值差異為(0.071±0.077)，RsB為(0.027±0.031)。通過(guò)R語(yǔ)言simba函數(shù)包diffslope()對(duì)回歸方程斜率比較分析表明其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：括號(hào)內(nèi)表示稀釋液。

分離自不同物種的RsA和RsB菌株間擬合曲線斜率差異顯著(圖2)。在TSB稀釋液條件下，RsB菌液吸光度值高于RsA菌液吸光度值，擬合曲線斜率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。同樣，在生理鹽水稀釋條件下，RsB菌液吸光度值高于RsA菌液吸光度值，擬合曲線斜率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。該結(jié)果表明：不同分離源的青枯菌在相同菌液濃度下的吸光度不同，在本研究中，番茄分離源的青枯菌吸光度值大于煙草分離源的青枯菌。

3 討論

不論是田間病害檢測(cè)還是實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)致病微生物進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，對(duì)特定環(huán)境下目標(biāo)微生物濃度的精確測(cè)定是開展微生物研究和分子診斷的必要條件。本研究基于溶液對(duì)光的吸收和物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系的原理[11-12]，使用分光光度計(jì)對(duì)不同分離源和不同稀釋液條件下的菌株吸光度進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)利用顯微鏡下的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，并基于二者間的線性關(guān)系建立線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)0.998 99以上。

本研究之所以選擇胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基和生理鹽水作為稀釋液并進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，是因?yàn)榍叭搜芯恐性陨睇}水替換微生物培養(yǎng)基以避免培養(yǎng)基本身的顏色對(duì)吸光度值的干擾[14]。然而，替換培養(yǎng)基步驟較為煩瑣，不利于微生物濃度的快速測(cè)定。在本研究針對(duì)青枯菌菌液濃度的測(cè)定中，使用原培養(yǎng)基稀釋和生理鹽水稀釋建立的擬合曲線斜率較接近，且斜率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外，雖然使用生理鹽水為稀釋液時(shí)回歸方程相關(guān)系數(shù)r2也能達(dá)到0.999以上，但是其稀釋范圍較窄，當(dāng)稀釋倍數(shù)大于3時(shí)吸光度值<0.1，處于檢測(cè)值下限邊緣，也增加了稀釋過(guò)程的操作難度。因此，為了簡(jiǎn)化操作步驟，本研究推薦在測(cè)定青枯菌菌懸液時(shí)直接使用原培養(yǎng)基作為稀釋液。