胸腺瘤PDC 模型的建立及化療藥物篩選

敖永強 高 健 王 帥 丁建勇 蔣家好

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032）

胸腺上皮腫瘤約占成人前縱隔腫瘤的50%［1］，大多數(shù)可通過手術(shù)聯(lián)合輔助放療治愈，但仍有約30%的患者患為晚期或復(fù)發(fā)性腫瘤，需要進行化療［2］。60%的患者采用順鉑為主的治療方案，而基于非鉑的方案包括奧曲肽-潑尼松和卡培他濱-吉西他濱等［3］。目前還有免疫治療如抗PD-L1 抗體以及免疫治療結(jié)合放療［4］，但治療相關(guān)的自身免疫不良事件較多，臨床獲益仍有待評估［5］。目前胸腺瘤或胸腺癌的一線化療方案是順鉑-蒽環(huán)類藥物或順鉑-依托泊苷組合［3］。臨床證據(jù)顯示胸腺瘤對化療不敏感，盡管對多種化療藥物有反應(yīng)，但是很少有完全緩解的患者［2］，且不良反應(yīng)較多。不論是誘導(dǎo)還是聯(lián)合化療，對胸腺瘤治療的獲益尚不確定［6-7］，臨床上化療方案的多樣性和胸腺瘤的異質(zhì)性也給醫(yī)師指導(dǎo)個體化用藥帶來挑戰(zhàn)。為減少化療不良反應(yīng)，同時提高反應(yīng)率，需要更多的研究來提高胸腺瘤患者化療的臨床獲益。近年來人源腫瘤異種移植物（patient-derived tumor xenograft，PDX）及人源腫瘤細胞（patient-derived tumor cell，PDC）在轉(zhuǎn)化腫瘤研究和腫瘤化療藥物篩選中具有重要地位［8-10］。

PDX 模型很好地概括了腫瘤的異質(zhì)性，并且保留了腫瘤的分子、遺傳以及組織學(xué)特性［11］，而PDC模型也可反映患者的腫瘤特征和臨床反應(yīng)［12］，相比傳統(tǒng)的腫瘤細胞系可以更好地模擬人體腫瘤，對開展腫瘤學(xué)研究具有重要意義?；赑DX 和PDC 模型，我們不僅可以通過體外藥物反應(yīng)預(yù)測體內(nèi)藥物活性，還能作為發(fā)現(xiàn)血清學(xué)腫瘤標志物的平臺［13］，對指導(dǎo)臨床用藥，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標記物具有重要作用。盡管PDX 模型在人類癌癥建模方面具有很高的保真度，但高昂的時間和經(jīng)濟成本阻礙了其成為大規(guī)模篩選治療藥物的理想平臺［14］。且PDX 模型的建立需要免疫缺陷的小鼠，不僅成功率較低，小鼠和人的免疫微環(huán)境也有較大差別。相比之下，PDC 模型建立的成功率更高，也更易于開展研究，可以極大地增加化療藥物篩選的數(shù)量、劑量，從而生成可靠的反應(yīng)參數(shù)。目前基于PDX 和PDC 模型的化療藥物篩選研究已經(jīng)被運用于卵巢癌、胰腺癌、肝癌、腎癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中，并有一定的臨床獲益［15-27］。然而，尚無關(guān)于胸腺瘤PDX 或PDC 模型的報導(dǎo)。胸腺瘤發(fā)病率較低，且病理組織和實驗?zāi)Ｐ腿狈Γ虼嘶A(chǔ)研究較少，其分子和遺傳特點以及化療藥物敏感性等尚不明確［27］。胸腺瘤惡性程度較低，腫瘤細胞生長緩慢，原代細胞培養(yǎng)較為困難，因此建立PDX 或PDC 模型有很大難度。

本研究首次成功建立了8 例胸腺瘤的PDC 模型，并對7 種臨床上常見的化療藥物方案進行腫瘤細胞殺傷試驗，篩選出對胸腺瘤細胞殺傷力較強的化療藥物方案，以指導(dǎo)臨床實踐。

資料和方法

一般病例資料選取2019 年7—12 月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科進行手術(shù)切除或胸腔鏡活檢的胸腺瘤患者，于手術(shù)時留取部分新鮮腫瘤組織用于制作PDC 模型。在成功建立PDC 模型的8 例胸腺瘤患者中，有7 例進行了全胸腺切除術(shù)，1 例進行了胸腔鏡活檢術(shù)。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會審核批準（批準號：B2021-781R），所有患者均簽署了知情同意書。

PDC 模型的建立手術(shù)組織樣本收集后置于4 ℃的PBS 中（添加10 mmol/L HEPES 和100 U/mL P/S 雙抗），及時進行以下操作：第一步，將組織用PBS 至少清洗5 次，并盡可能去除樣本中壞死區(qū)域和脂肪組織；第二步，將組織剪切成小塊后用組織消化液37 ℃消化1 h，在消化過程中每15 min 用槍頭吸吹；第三步，消化結(jié)束后用40 μm 的濾網(wǎng)過濾收集細胞懸液；第四步，在4 ℃下300×g離心10 min收集細胞，細胞沉淀用PTC 培養(yǎng)基重懸；第五步，將細胞以1×105/cm2的密度鋪于低吸附板中，置于細胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）進行培養(yǎng)，每隔2～3 天換液。

結(jié) 果

臨床病理資料分析本次研究共納入19 例胸腺腫瘤患者，成功建立PDC 模型的有8 例（表1），年齡37～67 歲，平 均 年 齡57 歲，男 女 各4 人。按 照WHO 的分型標準［28］，包括1 例A 型胸腺瘤，3 例AB型胸腺瘤，3 例B2 型胸腺瘤和1 例胸腺癌。根據(jù)Masaoka 等［29］的 分期標準，有3 例為Ⅱ期，3 例為Ⅲ期，2 例為Ⅳa 期。2 例患者合并重癥肌無力（myasthenia gravis，MG），分別為眼肌型（ocular）和全身型（systemic），其余6 例患者無自身免疫性疾病。5 例患者行劍突下切口電視輔助胸腔鏡（video assisted thoracic surgery，VATS）手術(shù)，完整切除腫塊，2 例為胸骨正中劈開切口。1 例不具備手術(shù)條件，術(shù)前CT 引導(dǎo)穿刺也未能明確病理，于是行胸腔鏡縱隔腫塊活檢術(shù)并取得腫瘤組織。術(shù)后2 例患者行輔助放療，方案分別為Dt 5000 cGy/20 次（10 周）以及Dt 5000 cGy/12 次（4 周），化療期間無明顯不適主訴；未能手術(shù)治療的病例則依據(jù)藥敏測試結(jié)果進行化療，方案為吉西他濱聯(lián)合順鉑C1D1-C3D8 累計8 周，化療期間患者前后出現(xiàn)皮疹、骨髓抑制等不良反應(yīng)，逐漸緩解。全身型MG 患者術(shù)后口服溴比斯的明行維持治療，眼肌型MG 患者術(shù)后肌無力癥狀明顯緩解；其他患者術(shù)后均恢復(fù)良好，對癥支持治療，未行其他輔助治療，所有患者均常規(guī)隨訪。

表1 PDC 模型的病例資料Tab 1 Case data of PDC models

PDC 模型建立和藥敏測試

建立胸腺瘤PDC 模型 手術(shù)獲取的胸腺瘤組織塊在冰盒中運輸，于離體24 h 內(nèi)解離，分離其中的活細胞進行體外培養(yǎng)。經(jīng)過5～9 天擴增，形成典型的腫瘤細胞克?。▓D1），直徑30～300 μm，細胞狀態(tài)良好，可以用于體外藥敏實驗。對8 例培養(yǎng)成功的胸腺瘤病例，鑒定細胞的活力及生長狀態(tài)，排除了細菌、真菌、支原體等的污染。

圖1 8 例胸腺瘤PDC 模型Fig 1 8 cases of thymoma PDC models

PDC 模型藥敏測試 根據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）和中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會（CSCO）診療指南［30］中胸腺瘤的藥物治療方案，對8 例建立成功的PDC 模型進行藥敏測試。把腫瘤細胞殺傷效率分為5 個等級，對藥物殺傷效果和效率都做了詳細定義（表2）。其中，腫瘤細胞數(shù)殺傷＞70%的藥物組合為強殺傷，在藥物作用下，多數(shù)腫瘤細胞團瓦解凋亡或者體積明顯變小，但仍然可見少量耐藥腫瘤細胞團的留存。腫瘤細胞數(shù)殺傷＜10%，甚至造成持續(xù)增殖的藥物組合定義為耐藥或強烈耐藥。測試的藥物組合類型一共有7種，都是以順鉑為基礎(chǔ)的標準治療方案，每種治療方案分別應(yīng)用于8 例胸腺瘤PDC 模型進行藥敏測試。由于操作原因，Vinorelbine+Cisplatin 方案和Epirubicin+Cisplatin 方案中進行藥敏測試的胸腺瘤PDC 模型數(shù)量分別為7 例及6 例（表3）。同時對每個模型設(shè)置了3 個不加藥物的對照組，培養(yǎng)7 天后檢測培養(yǎng)基中腫瘤細胞的數(shù)量和活力。

表2 胸腺瘤細胞殺傷結(jié)果Tab 2 Killing ability of thymoma cells

表3 不同藥物方案對胸腺瘤細胞的殺傷情況Tab 3 Killing of thymoma cells by different drug regimens

腫瘤細胞殺傷效果 試驗結(jié)束后，我們對比藥物組和對照組腫瘤細胞的生長情況，得到強殺傷、弱殺傷以及耐藥的對照（圖2）。強殺傷的藥物組合顯著抑制了腫瘤細胞的生長，僅殘留少量腫瘤細胞克隆，殘留的腫瘤細胞內(nèi)可能存在對該藥物組合的耐藥基因。弱殺傷的藥物組合明顯抑制腫瘤細胞的生長，但仍留存較多細胞克隆。耐藥的藥物組合中腫瘤細胞不僅沒有減少，反而持續(xù)增殖。

圖2 化療藥物對胸腺瘤細胞的殺傷效果Fig 2 Killing effect of thymoma cells on chemotherapy

腫瘤細胞殺傷效率 不同的藥物組合方案對胸腺瘤細胞的殺傷效果不同（表2），其中白蛋白紫杉醇、長春瑞濱或表柔比星聯(lián)合順鉑方案對胸腺瘤細胞的殺傷有效率較高，分別為6/8、6/7 和5/6，且耐藥率較低，分別為2/8、1/7 和1/6；而多西他賽、紫杉醇、吉西他濱或培美曲塞聯(lián)合順鉑方案對胸腺瘤細胞的殺傷有效率較低，分別為4/8、3/8、5/8 和3/8，且 耐 藥 率 較 高，分 別 為4/8、5/8、3/8 和5/8（圖3）。

圖3 不同藥物方案對胸腺瘤細胞的殺傷有效率Fig 3 Killing effectiveness of different drug regimens to thymoma cells

基于PDC 的胸腺瘤化療方案推薦我們分析了不同藥物組合對胸腺瘤細胞的殺傷有效率（圖3），強殺傷有效率和殺傷有效率均較高的是白蛋白紫杉醇、長春瑞濱或表柔比星聯(lián)合順鉑方案，耐藥率較高的是多西他賽、紫杉醇、吉西他濱或培美曲塞聯(lián)合順鉑方案。因此，基于該PDC 模型結(jié)果，我們推薦胸腺瘤化療采用白蛋白紫杉醇、長春瑞濱或表柔比星聯(lián)合順鉑方案。之前的研究也指出，盡管胸腺瘤的化療尚無共識，但順鉑+蒽環(huán)類藥物（如表柔比星）是一線化療方案，其次是順鉑+依托泊苷，而順鉑+白蛋白紫杉醇常用于復(fù)發(fā)性胸腺瘤的治療［3，31］。

胸腺瘤PDC 模型的臨床指導(dǎo)意義我們對1例不可切除且穿刺活檢診斷困難的胸腺腫瘤患者進行了胸腔鏡活檢術(shù)，活檢結(jié)果為A 型胸腺瘤，Masaoka Ⅳa 期，我們于術(shù)中留取部分活檢組織用于建立PDC 模型。通過篩選NCCN 等指南推薦的不同胸腺瘤化療方案，該患者PDC 模型的藥敏測試結(jié)果（表4）顯示吉西他濱聯(lián)合順鉑方案具有強殺傷作用，而白蛋白紫杉醇、長春瑞濱或表柔比星聯(lián)合順鉑方案的殺傷效果有限。已經(jīng)有回顧性研究證實，對晚期胸腺瘤的化療使用吉西他濱聯(lián)合順鉑的方案是有效的［32］。因此我們對該患者進行吉西他濱聯(lián)合順鉑化療，化療后胸腺瘤較前明顯縮?。▓D4）。結(jié)果初步證實胸腺瘤PDC 模型可以用于模擬胸腺瘤化療藥物敏感測試和篩選，并用于指導(dǎo)胸腺瘤化療藥物的使用。對于需要化療的患者，可以通過活檢獲取腫瘤細胞建立PDC 模型，篩選出敏感化療藥物，降低腫瘤負荷或分期，增加手術(shù)可能性。

表4 不同方案藥敏測試結(jié)果Tab 4 Susceptibility test results of different drug regimens

圖4 基于胸腺瘤PDC 模型的化療藥物臨床驗證Fig 4 Clinical validation of chemotherapy drugs based on thymoma PDC model

討 論

我們成功建立了胸腺瘤的PDC 模型，旨在模擬體內(nèi)胸腺瘤化療藥物的腫瘤細胞殺傷力，通過藥敏測試篩選出殺傷力最強的化療藥物組合方案，以指導(dǎo)臨床實踐中胸腺瘤化療藥物的使用。既往的研究顯示，PDX 或PDC 模型已成功在多種惡性腫瘤中成功建立，并且用于模擬體內(nèi)化療藥物活性和化療藥物篩選，極大地促進了腫瘤化療藥物運用的發(fā)展［33］。在腎癌中，研究者基于腎癌PDC 模型證實了該模型在組織學(xué)特點、生物標志物表達、腫瘤突變驅(qū)動基因拷貝數(shù)等和原始腫瘤的一致性［19］。而在非小細胞肺癌和食管癌PDC 模型中，研究者篩選出特定克服耐藥的化療藥物組合方案，極大提高了 患 者 的 治 療 效 果［20，23］。這 些 成 果 預(yù) 示 著 腫 瘤PDC 模型在模擬體內(nèi)腫瘤生物學(xué)特點包括藥物敏感性方面有很大的應(yīng)用價值，對篩選腫瘤治療藥物和發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標記物具有重要意義。本次成功建立PDC 模型的胸腺瘤病例都已經(jīng)侵犯包膜以及縱隔脂肪組織，分期較晚，具有較強的侵襲性。與之相對應(yīng)，未能成功建立PDC 模型的胸腺瘤標本中，有8 例Ⅰ期，2 例Ⅱ期和1 例Ⅲ期。提示分期越晚，腫瘤侵襲性越強，建立PDC 模型的成功率可能越高。

目前胸腺瘤尚無特別有效的化療藥物，種類多樣的化療方案，胸腺瘤的高度異質(zhì)性，以及基礎(chǔ)研究的缺乏給臨床醫(yī)師選擇合適的化療方案帶來挑戰(zhàn)。建立胸腺瘤的PDC 模型進行化療藥物篩選將有助于化療方案的針對性選擇，提高化療有效率和患者的臨床預(yù)后。根據(jù)本研究中建立的胸腺瘤PDC 模型，我們篩選了目前常用的胸腺瘤化療藥物方案，發(fā)現(xiàn)白蛋白紫杉醇、長春瑞濱或表柔比星聯(lián)合順鉑方案對大多數(shù)胸腺瘤細胞具有較強的殺傷作用，可以優(yōu)先選擇。然而，在該例A 型胸腺瘤PDC 模型中，盡管推薦方案顯示一定殺傷力，但吉西他濱聯(lián)合順鉑有更明顯的療效。為了避免無效治療，我們選擇后者進行化療，并取得顯著效果。盡管如此，僅僅根據(jù)PDC 模型來選擇化療方案顯然過于片面，臨床實踐中，還必須結(jié)合患者本身的情況，以及各個藥物方案的副作用等綜合選擇。由于胸腺瘤的異質(zhì)性，同一方案對于不同亞型的胸腺瘤可能療效不一。本研究推薦的方案是所有病例中有效率最高的方案，但在該例無法手術(shù)的患者中卻有不同，因此實際用藥的選擇還需要參考具體的PDC 模型。

盡管PDC 模型可以很好地模擬腫瘤在體內(nèi)的生物學(xué)行為，腫瘤細胞可以無限生長并且可以通過高通量篩選以積累大量實驗數(shù)據(jù)［11］，但是也存在一些局限性。例如，離體的腫瘤細胞會選擇性增殖，不斷適應(yīng)培養(yǎng)條件［34］，導(dǎo)致對腫瘤異質(zhì)性的反應(yīng)不如PDX 模型；同時缺乏體內(nèi)腫瘤微環(huán)境和宿主免疫特點等［35］，模型的建立也比較困難，成功率較低。目前尚缺乏大規(guī)模研究以確定多種癌癥類型藥理學(xué)和基因組學(xué)之間的聯(lián)系。Lee 等［12］通過高通量測序證實了多種腫瘤組織和相應(yīng)的PDC 模型間的轉(zhuǎn)錄組相似性；Yin 等［36］通過對21 例PDC 模型進行全轉(zhuǎn)錄組測序，也指出PDC 模型中微腫瘤團和剛離體活體組織在分子特征、測序序列、免疫marker 等指標上保持高度一致性。因此，基于PDC 模型的研究能在一定程度上模擬體內(nèi)腫瘤，為臨床實踐提供參考依據(jù)。

然而，本研究也存在一些不足之處。首先，未對胸腺瘤細胞增殖傳代過程中的進化和基因突變進行檢測。盡管有前人在其他腫瘤類型上的驗證，我們尚不能肯定胸腺瘤PDC 模型可以準確地反映體內(nèi)腫瘤的情況。此外，本次實驗的樣本量較小，且考慮到胸腺瘤亞型的多樣性，最終篩選出的化療方案可靠性有待更大樣本量的研究去進一步驗證。第三，盡管我們收治來自全國各地的患者，但仍然是一個單中心研究，多中心的合作將有助于提高研究結(jié)論的普適性和可靠性。第四，我們根據(jù)所篩選的化療方案對該例無法手術(shù)的患者進行驗證并得到滿意的結(jié)果，但僅一例患者的獲益不具有代表性，仍需要更大規(guī)模的臨床驗證支持。后期本團隊會納入更多需要化療的胸腺瘤患者進行該項研究，以期獲得更加令人更信服的數(shù)據(jù)。為了進一步提高PDC 模型和體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的一致性，在確保PDC 模型建立成功的前提下，進一步改進培養(yǎng)條件也將是本團隊重點關(guān)注的內(nèi)容，例如添加胸腺瘤微環(huán)境中高表達的細胞因子及含量豐富的基質(zhì)細胞、免疫細胞等［37］。

總之，本研究成功建立了胸腺瘤的PDC 模型，并且在合適的條件下進行了化療藥物敏感測試。根據(jù)測試結(jié)果，胸腺瘤化療推薦使用白蛋白紫杉醇、長春瑞濱或表柔比星聯(lián)合順鉑方案。臨床實踐中，還必須結(jié)合患者自身情況，以及各個藥物方案的不良反應(yīng)等綜合選擇。不同亞型的胸腺瘤可能有不同的最佳化療方案，本研究受PDC 模型數(shù)量的限制，提供了初步的探索信息，更大樣本量的研究將為準確的臨床用藥提供指導(dǎo)。

作者貢獻聲明敖永強 數(shù)據(jù)整理分析，圖表繪制，文獻調(diào)研整理，論文撰寫和修改。高健 研究構(gòu)思設(shè)計，論文修改。王帥，丁建勇 研究構(gòu)思設(shè)計。蔣家好 研究構(gòu)思設(shè)計，圖表繪制，論文修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。