Calretinin、S100免疫組化染色診斷先天性巨結(jié)腸的價(jià)值△

張?jiān)弃Q 張君娜

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 開封 475000)

先天性巨結(jié)腸(HD)好發(fā)于嬰幼兒，主要是由復(fù)雜的基因紊亂所致，患兒以頑固性便秘腹脹和巨結(jié)腸伴發(fā)小腸結(jié)腸炎為主要表現(xiàn)，并伴有不同程度的營養(yǎng)不良癥狀，嚴(yán)重影響嬰幼兒的生長發(fā)育[1]。但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[2]，在臨床表現(xiàn)上，HD與其他腸神經(jīng)系統(tǒng)異常疾病具有較高的相似性，因此為避免誤診和漏診現(xiàn)象的發(fā)生，延誤患兒的治療，精確的診斷必不可少。目前，臨床對(duì)HD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是依靠發(fā)現(xiàn)腸組織肌層或黏膜下層的神經(jīng)叢內(nèi)是否缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，同時(shí)在黏膜下層是否存在神經(jīng)纖維的增生，正因如此，病理科醫(yī)師多采用乙酰膽堿酯酶染色的方式尋找黏膜下神經(jīng)纖維來為診斷提供依據(jù)，但該方式耗時(shí)較長、操作步驟相對(duì)較為繁瑣，因此急需尋找快速準(zhǔn)確的診斷方式[3]。對(duì)比本研究選取127例疑似HD患兒展開研究，采用S100免疫組化染色和Calretinin檢測(cè)，觀察兩種方式單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月-2020年12月本院收治的127例疑似HD患兒為研究樣本，所有患兒均存在不明原因的腹脹和便秘癥狀，同時(shí)排除功能性便秘和代謝性紊亂癥狀，所有患兒家長均已知曉本研究目的和潛在的風(fēng)險(xiǎn)，自愿參與本項(xiàng)研究。127例疑似HD患兒中男75例，女52例，出生日齡2～27d，平均出生日齡(18.56±2.33)d。

1.2 方法

分別于患兒病變腸段近端擴(kuò)張段和遠(yuǎn)端狹窄段進(jìn)行取材，免疫組化染色的具體步驟：石蠟包埋、脫臘，逐漸進(jìn)行水化，采用EDTA抗原進(jìn)行修復(fù)，再選用過氧化氫進(jìn)行清除，一抗、二抗孵育后DAB顯色。采用蘇木素復(fù)染，選取鹽水乙醇反藍(lán)，最后在進(jìn)行脫水封片。由兩位病理科資深醫(yī)師在顯微鏡的分別進(jìn)行讀片，觀察神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞染色情況。其中Calretinin染色特點(diǎn)是可在腸組織的黏膜層和固有層發(fā)現(xiàn)呈棕黃色細(xì)絲狀的神經(jīng)纖維，黏膜下層可見棕黃色的粗神經(jīng)纖維和棕黃色顆粒團(tuán)狀的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但在缺失的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中則不染色。而S100免疫組化染色特點(diǎn)則是在腸組織黏膜下層可見呈棕黃色染色的神經(jīng)纖維 和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)纖維之間的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈空泡狀、無染色；而缺失神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腸組織無空泡狀表現(xiàn)，但可見強(qiáng)陽性染色的粗神經(jīng)纖維。

1.3 觀察指標(biāo)

Calretinin染色檢查以黏膜下層可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Calretinin染色為陽性，S100免疫組化染色以存在增粗神經(jīng)纖維S100染色為陽性，而乙酰膽堿酯酶染色結(jié)果顯示鏡下黏膜肌層可見較多的乙酰膽堿酯酶染色信號(hào)為陽性；相反則均為陰性。以乙酰膽堿酯酶染色結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比Calretinin和S100免疫組化染色檢查單獨(dú)以及聯(lián)合檢測(cè)在新生兒HD中的診斷效能[4]。同時(shí)觀察兩種染色方式聯(lián)合檢測(cè)在HD擴(kuò)張段和狹窄段的檢出情況，對(duì)比其與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性和符合率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料(陽性檢出率、診斷效能各項(xiàng)指標(biāo))以(%)表示，行χ2檢驗(yàn)；多組間比較行方差分析；一致性檢驗(yàn)結(jié)果以Kappa值表示，分別以數(shù)值在≥0.75、0.4～0.74、<0.4表示一致性良好、一般和較差。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種染色方式單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)的陽性檢出情況

127例患兒中Calretinin染色檢測(cè)陽性85例，S100免疫組化染色檢測(cè)陽性87例，聯(lián)合檢測(cè)陽性90例，金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)陽性98例，見表1。

表1 兩種染色方式單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)的陽性檢出情況[n=127]

2.2 兩種染色方式單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)陽性結(jié)果的比較

Calretinin染色陽性率66.93%、S100免疫組化染色陽性率68.50%、聯(lián)合檢測(cè)陽性率70.87%、金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)陽性率77.17%，4種檢測(cè)方式對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.730，P=0.292)，見表2。

2.3 兩種染色方式單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)診斷效能比較

聯(lián)合檢測(cè)的特異性、敏感性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均高于Calretinin染色和S100免疫組化染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩種染色方式單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)診斷效能比較[%]

2.4 兩種檢測(cè)方式聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)在擴(kuò)張段和狹窄段檢出情況的一致性和符合率

聯(lián)合檢測(cè)和金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)均為陽性的86例患兒中，聯(lián)合檢測(cè)檢出擴(kuò)張段55例、狹窄段31例；金標(biāo)準(zhǔn)檢出擴(kuò)張段59例，狹窄段27例，兩者對(duì)比Kappa值0.844，一致性良好，符合率為93.02%(80/86)，見表4。

表4 兩種檢測(cè)方式聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)在擴(kuò)張段和狹窄段檢出情況的一致性和符合率[n=86]

3 討論

經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)[5]，在HD患兒的診斷中病理診斷結(jié)果有著至關(guān)重要的作用。目前，臨床對(duì)于HD的病理學(xué)診斷最常見的方式乙酰膽堿酯酶染色，該方式在臨床診斷中不僅具有取材較少的優(yōu)勢(shì)，還可以直接顯現(xiàn)HD直腸黏膜固有層腺體間存在膽堿能纖維增生的情況，具有極高的診斷特異性；但該方式對(duì)待檢組織的新鮮程度有著較高的要求，且檢測(cè)時(shí)間較長，費(fèi)用較高[6]。因此對(duì)于HD的診斷還需尋找更加客觀、有效的輔助診斷方式。Calretinin屬于鈣結(jié)合蛋白，以陽性表達(dá)形式廣泛存在于巨結(jié)腸擴(kuò)張段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞區(qū)域，但在狹窄段則以陰性表達(dá)為主；而S100蛋白屬于天冬氨酸蛋白酶，經(jīng)免疫組化染色后在HD狹窄段黏膜下層粗大的神經(jīng)纖維中呈陽性表達(dá)[7]。對(duì)此有專家學(xué)者提議可將兩者聯(lián)合檢測(cè)用于HD的診斷。

經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn)，以乙酰膽堿酯酶染色為金標(biāo)準(zhǔn)，Calretinin和S100蛋白免疫組化染色聯(lián)合檢測(cè)的特異性86.21%、敏感性87.76%、陽性預(yù)測(cè)值95.56%、陰性預(yù)測(cè)值67.57%，均高于Calretinin染色單獨(dú)檢測(cè)的特異性51.72%、敏感性72.45%、陽性預(yù)測(cè)值83.53%、陰性預(yù)測(cè)值35.71%以及S100蛋白免疫組化染色的特異性58.62%、敏感性76.53%、陽性預(yù)測(cè)值86.21%、陰性預(yù)測(cè)值42.50%(均P<0.05)，由此可見，兩種染色方式聯(lián)合診斷HD的診斷效能更高。究其原因可以發(fā)現(xiàn)，Calretinin具有緩沖胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的作用，屬于周圍神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)的重要活性物質(zhì)，對(duì)神經(jīng)具有一定的保護(hù)作用，將其用于HD患兒的診斷可在巨結(jié)腸擴(kuò)張段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞區(qū)域多呈陽性表達(dá)，而在狹窄段的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失區(qū)域多呈陰性表達(dá)；而S100蛋白屬于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，也廣泛存在于神經(jīng)纖維中，對(duì)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中卻不見其表達(dá)，故而可借助對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)纖維進(jìn)行免疫組化特異性染色來進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示，不同發(fā)育程度和粗細(xì)的神經(jīng)纖維會(huì)呈現(xiàn)不同的表達(dá)，比較特殊的是在巨結(jié)腸擴(kuò)張段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞區(qū)域發(fā)現(xiàn)空泡狀表現(xiàn)，在狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失區(qū)域可見強(qiáng)陽性表達(dá)的增粗神經(jīng)纖維[8]。因此，將兩種方式聯(lián)合檢測(cè)用于診斷HD可以充分發(fā)揮彼此的優(yōu)勢(shì)，提高診斷效能。

與此同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)在擴(kuò)張段病變組織和狹窄段病變組織方面檢出情況與金標(biāo)準(zhǔn)相比Kappa值為0.844，符合率為93.02%，由此可見，聯(lián)合檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)之間具有較高的一致性和符合率。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在HD病理診斷過程中，時(shí)?？梢姛o神經(jīng)節(jié)細(xì)胞檢出的情況，而進(jìn)一步明確是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度過低還是狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失需多次進(jìn)行切片檢查，無形之中增加病理科工作人員的工作量[9]。另外，鑒于新生兒腸壁神經(jīng)節(jié)發(fā)育的特殊性，其腸黏膜下層的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞多為不成熟的神經(jīng)細(xì)胞，加之神經(jīng)節(jié)密度較低、取材的不足，更易發(fā)生漏診或誤診的情況。而在本研究中通過分段取材的方式，可以充分避免取材不足現(xiàn)象的發(fā)生，而聯(lián)合采用兩種染色方式可以有效避免將擴(kuò)張段的診斷結(jié)果誤診為狹窄段的診斷結(jié)果，最大限度的彌補(bǔ)彼此在取材深度和取材位置方面的不足，從而有效提高臨床診斷的準(zhǔn)確性[10]。

綜上所述，在新生兒HD診斷中Calretinin和S100免疫組化染色檢聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能高于兩種染色方式單獨(dú)檢測(cè)的診斷效能，并且聯(lián)合檢測(cè)在擴(kuò)張段和狹窄段的檢出情況與金標(biāo)準(zhǔn)有較高的一致性和符合率，臨床診斷價(jià)值頗高。但本研究仍存一定的不足之處，除研究樣本容量較少以外，未對(duì)確診患兒和未確診患兒之間的染色結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，忽視慢性炎癥等其他疾病對(duì)診斷結(jié)果的影響，因此在今后的研究中還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本容量，完善研究方案，深入探索Calretinin和S100免疫組化染色檢聯(lián)合檢測(cè)在HD患兒中的診斷價(jià)值。