混合型離子交換反相吸附固相萃取柱串聯(lián)萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定地表水中32種抗生素的含量

張蓓蓓,孫慧婧,吉 鑫

(江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心 國家環(huán)境保護(hù)地表水環(huán)境有機(jī)污染物監(jiān)測分析重點實驗室,南京 210036)

抗生素可用于人和動物相關(guān)疾病的治療,在人類社會及畜禽養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛,已成為一種新型環(huán)境污染物,被國內(nèi)外社會關(guān)注。目前,抗生素在水體中的污染已經(jīng)相當(dāng)普遍,國內(nèi)外各地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)廢水[1-4]、生活污水[5-8]、地表水[9-13]、地下水[14-15]及飲用水[16-17]中均有一定檢出,檢出抗生素種類主要包括四環(huán)素、磺胺、大環(huán)內(nèi)酯、喹諾酮、β-內(nèi)酰胺、林可酰胺等6類,其在除廢水外的水體中的檢出濃度水平為ng·L-1級,屬于痕量污染水平,而在廢水中的檢出濃度水平在μg·L-1級到mg·L-1級內(nèi),屬于微量污染水平。

當(dāng)前,我國環(huán)境行業(yè)尚未制定針對抗生素的環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和污染排放標(biāo)準(zhǔn),僅在GB 8978-1996《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》和GB 21903-2008《發(fā)酵類制藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了部分抗生素的單位產(chǎn)品基準(zhǔn)排水量限值。測定方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為SZDB/Z 323-2018《水產(chǎn)品養(yǎng)殖水中21種磺胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、硝基呋喃類、喹諾酮類和孔雀石綠的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和DB 37/T 3738-2019《水質(zhì) 磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測定 固相萃取/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法》,且以上地方標(biāo)準(zhǔn)不涉及林可酰胺類和β-內(nèi)酰胺類抗生素的測定。

液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法是測定抗生素含量較為成熟的方法,但由于抗生素種類繁多、化學(xué)性質(zhì)差異較大,難以在測定前用統(tǒng)一的前處理方法完成所有類別抗生素的萃取。如在酸度上,磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素為兩性化合物,大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類抗生素為弱堿性化合物,β-內(nèi)酰胺類抗生素為弱酸性化合物;在穩(wěn)定性上,四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺類抗生素在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性環(huán)境中均不穩(wěn)定;在極性上,喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素極性較大,當(dāng)前尚未發(fā)現(xiàn)較為全面萃取水體中抗生素的前處理方法。

鑒于此,本工作以混合型陽離子交換反相吸附固相萃取柱(MCX 小柱,主要用于富集水樣中磺胺類、喹諾酮類、林可酰胺類、β-內(nèi)酰胺類抗生素)和混合型陰離子交換反相吸附固相萃取柱(MAX 小柱,主要用于富集水樣中大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素)串聯(lián)的固相萃取柱萃取水樣,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水樣中6類32種抗生素[16種磺胺類抗生素(磺胺乙酰、磺胺二甲異嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺氯吡嗪、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉)、3種喹諾酮類抗生素(氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星)、2種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(羅紅霉素、克拉霉素)、4種四環(huán)素類抗生素(土霉素、金霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素)、2種林可酰胺類抗生素(林可霉素、克林霉素)、5種β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢克洛、頭孢西丁、頭孢匹林)]的含量,方法所需水樣少、快速、準(zhǔn)確、靈敏,可為水體中抗生素污染水平的全面評估提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

API 6500型超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀,配Analyst Software 1.7.1工作站;SPE 900型全自動固相萃取儀,HLB 固相萃取柱(500 mg/6 mL),MCX 小 柱(500 mg/6 mL),MAX 小 柱(500 mg/6 mL);Turbo Vap II型全自動定量濃縮儀;MILLIPORE RIOS 30型純水機(jī);AG104型電子天平。

32種抗生素及內(nèi)標(biāo)物磺胺甲基嘧啶-d4、磺胺甲惡唑-d4、氧氟沙星-d3、諾氟沙星-d5、羅紅霉素-d7、四環(huán)素-d6、頭孢氨芐-d5的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L-1。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:1.0 mg·L-1,取32 種抗生素的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,用乙腈稀釋,混勻備用。其他混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均由此溶液用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液逐級稀釋制備。

混合內(nèi)標(biāo)使用液:4.0 mg·L-1,取7種內(nèi)標(biāo)物的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,用乙腈稀釋,混勻備用。其他混合內(nèi)標(biāo)溶液均由此溶液用50%乙腈溶液逐級稀釋制備。

乙二胺四乙酸二鈉、氨水為分析純;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;試驗用水為自制純化水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫40℃;進(jìn)樣量2μL;流動相A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B 為乙腈;流量0.4 mL·min-1。梯度洗脫程序:0 min,A 為95%,保持2 min;2～10 min,A 由95% 降 至30%;10～13 min,A 由30%降至10%,保持1 min;14～15 min,A 由10%升至95%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI+)模式;離子化電壓5 500 V;離子源溫度250 ℃;噴霧氣壓力3.45×105Pa,輔助加熱氣壓力3.45×105Pa,氣簾氣壓力1.38×105Pa,碰撞氣壓力0.62×105Pa;監(jiān)測駐留時間0.03 s;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1 (續(xù))

1.3 試驗方法

將MCX 小柱與 MAX 小柱串聯(lián),依次用10 mL甲醇、10 mL 水活化,期間保證2 根小柱柱頭浸潤。500 mL地表水樣經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后,加入0.4 g乙二胺四乙酸二鈉,以約2 mL·min-1上樣速率過柱。上樣完畢后,將2 根小柱分開。MCX 小柱先用2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液10 mL淋洗,以去除柱中保留較弱的雜質(zhì),再用氮氣吹掃30 min,以去除柱中殘留的水分,然后依次用甲醇4 mL、含5%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水的甲醇溶液4 mL洗脫,收集并合并洗脫液。MAX 小柱先用5%氨水溶液10 mL淋洗,再用氮氣吹掃30 min,然后依次用甲醇4 mL、含2%甲酸的甲醇溶液4 mL洗脫,收集并合并洗脫液。合并兩個小柱的洗脫液,氮吹至盡干,用50% 乙腈溶液稀釋至1.0 mL,加入混合內(nèi)標(biāo)使用液5.0μL,使溶液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度達(dá)到20.0 μg·L-1,混勻后過0.22μm 濾膜,濾液置于進(jìn)樣瓶中,按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

常用HLB固相萃取柱萃取水體中不同種類的抗生素,而本工作涉及的待測抗生素酸性不同,在水中的電離程度不同。為獲得較好的萃取效率,需要調(diào)節(jié)水樣酸度,使目標(biāo)抗生素處于分子狀態(tài)。調(diào)節(jié)加標(biāo)水樣(加標(biāo)量為20 ng·L-1)的酸度分別達(dá)到pH 4,7,10,考察了不同酸度水樣對各抗生素回收率的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,不同種類抗生素在不同酸度水樣中的回收率相差較大。其中,磺胺類抗生素在酸度為pH 4,7、喹諾酮類和林可酰胺類抗生素在酸度為pH 10、四環(huán)素類抗生素在酸度為pH 4、β-內(nèi)酰胺類抗生素在酸度為pH 7時,分別具有較好的回收率,說明試驗無法在同一酸度條件下完成32種抗生素的同時萃取,需要分3 次進(jìn)行不同種類抗生素的萃取。

圖1 采用HLB固相萃取柱萃取時不同酸度加標(biāo)水樣中32種抗生素的回收率Fig.1 Recoveries of the 32 antibiotics in spiked water samples with different acidity during extraction with HLB solid phase extraction column

同時,32種抗生素化學(xué)性質(zhì)及極性差異較大,調(diào)節(jié)水樣酸度可能導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類等化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的抗生素降解。考慮到混合型離子交換反相吸附固相萃取柱同時具有離子交換和反相吸附的作用,試驗考察了分別采用MCX 小柱和MAX 小柱萃取時對加標(biāo)水樣中32 種抗生素回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 用MAX 小柱和MCX 小柱萃取時加標(biāo)水樣中32種抗生素的回收率Fig.2 Recoveries of the 32 antibiotics in spiked water samples during extraction with the MAX cartridge and the MCX cartridge

由圖2可知:采用MCX 小柱萃取時,磺胺類、喹諾酮類、林可酰胺類和β-內(nèi)酰胺類抗生素回收率較高;采用MAX 小柱萃取時,大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素回收率較高。因此,試驗選擇將MCX 小柱和MAX 小柱串聯(lián),用于水樣中32種抗生素的同時萃取。

2.2 上樣速率的選擇

當(dāng)采用混合型離子交換反相吸附固相萃取柱萃取水體中抗生素時,發(fā)現(xiàn)上樣速率對回收率具有較大影響。因此,試驗比較了上樣速率分別為2,5,10 mL·min-1時各抗生素回收率的變化。結(jié)果顯示,各抗生素的回收率隨上樣速率的增加而降低,推測上樣速率過快,不利于吸附劑和待測物的充分交換和結(jié)合,從而導(dǎo)致待測物穿透,回收率降低。因此,試驗選擇的上樣速率為2 mL·min-1。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣,對32種抗生素的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。由于抗生素具有一定極性,選擇電噴霧離子源進(jìn)行電離,并比較了正、負(fù)離子模式下的掃描結(jié)果。結(jié)果顯示,32種抗生素在正離子模式下有更好的響應(yīng),基峰均為[M+H]+。選定[M+H]+為母離子,進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,尋找子離子碎片,確定特征離子,并進(jìn)一步優(yōu)化各抗生素的去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù),詳見表1。

在優(yōu)化的試驗條件下,含20.0μg·L-1內(nèi)標(biāo)的50.0μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖見圖3。

圖3 含內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of the mixed standard solution containing internal standard substances

由圖3 可知,32 種抗生素和7 種內(nèi)標(biāo)物在ESI+模式下均有很好的響應(yīng),能夠滿足試驗定量分析要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

用50%乙腈溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)使用液逐級稀釋成1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列(7 種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度均為20.0μg·L-1),按照儀器工作條件測定,以各抗生素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,各抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為1.0～50.0μg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

參考HJ/T 168-2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》,分析7 個加標(biāo)水樣(加標(biāo)量4.0 ng·L-1),以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)計算檢出限(3s),以4倍檢出限計算測定下限,結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表2 (續(xù))

由表2 可知,32 種抗生素的檢出限為0.3～1.4 ng·L-1,靈敏度高,滿足地表水中抗生素的分析要求。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法分析加標(biāo)量為5.0,20.0,80.0 ng·L-1等3個濃度水平的加標(biāo)地表水樣品,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

由表3 可知:32 種抗生素測定值的RSD 為1.3%～17%;32種抗生素的回收率為48.5%～93.4%,6類抗生素回收率大多在70.0%以上,雖然部分喹諾酮類抗生素低濃度水平加標(biāo)樣品的回收率較低(約50.0%),但其測定值的RSD 較低,依然符合痕量分析的要求。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3 (續(xù))

2.6 樣品分析

應(yīng)用本方法測定太湖流域8 個飲用水源地監(jiān)測點位水體中32 種抗生素的含量,檢出結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples

表4 (續(xù))

由表4可知,太湖流域飲用水源地水體中抗生素污染較為普遍,磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、林可霉素、克林霉素、克拉霉素和諾氟沙星均有不同程度檢出,其中林可霉素檢出量最大,為33.9 ng·L-1,屬于痕量污染水平。

本工作以混合型離子交換反相吸附固相萃取柱串聯(lián)萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定地表水中32種抗生素的含量,方法具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確度高和精密度好等特點,適合大批量地表水樣的分析。