Carb/NH2 固相萃取柱凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測定乳粉中二苯胺的殘留量

安紅梅,王麗娟,李春揚,何蕙園,謝精精

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015; 2.中輕檢驗認證有限公司,北京 100015)

二苯胺是一種常見的殺菌劑、保鮮劑,其能引起變性血紅素癥,為可疑致癌物[1]。歐盟嚴格規(guī)定了各類食品中二苯胺的限量,其中乳制品中二苯胺的限量為0.05 mg·kg-1[2]。GB 2763-2021[3]《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》僅規(guī)定了生乳中二苯胺的殘留限量(0.01 mg·kg-1),并無乳粉中殘留限量的規(guī)定。為全面評估乳粉進出口風險,應持續(xù)有效監(jiān)控乳粉中二苯胺的殘留量。

目前,乳制品中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-6]、氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-10]等。雖然文獻報道的乳制品中的檢測對象種類繁多,但均未涉及二苯胺[1]。國內(nèi)乳粉中二苯胺的檢測標準有GB/T 23210-2008《牛奶和奶粉中511種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[11]和GB/T 23211-2008《牛奶和奶粉中493種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[12]。受制于試驗成本等因素,GB/T 23210-2008所采用的GC-MS的應用較為廣泛,但是該標準存在一定局限性,比如易受基質(zhì)干擾,容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等問題,故標準要求采用空白基質(zhì)匹配法補償基質(zhì)效應,但通過標準方法很難得到二苯胺空白基質(zhì)。鑒于此,本工作對國家標準 GB/T 23210-2008的前處理方法進行改進,以乙腈作提取溶劑,以石墨化碳黑-氨基復合固相萃取柱(Carb/NH2小柱)凈化,以GC-MS檢測,外標法定量。該方法操作簡單、靈敏度高,避免了GB/T 23210-2008易出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象,能夠滿足乳粉中二苯胺殘留量日常監(jiān)控的需求。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2020 型氣相色譜-質(zhì)譜儀;GCMSTQ8040型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀;DC-12型氮氣吹干儀;RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;R-104 型均質(zhì)器;十八烷基鍵合硅膠固相萃取柱(C18小柱,2 000 mg/12 mL);弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱(Florisil小柱,1 000 mg/6 mL);Carb/NH2小柱(500 mg/6 mL)。

二苯胺標準儲備溶液:100 mg·L-1,于4 ℃條件下儲存。

二苯胺標準中間使用液:10.0 mg·L-1,以正己烷稀釋二苯胺標準儲備溶液配制而成,于4 ℃條件下儲存。

二苯胺標準溶液系列:取適量二苯胺標準中間使用液,用正己烷逐級稀釋,配制成0.01,0.02,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L-1的標準溶液系列,于4 ℃條件下儲存。

乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純;10種乳粉樣品(包含6 種國產(chǎn)乳粉和4 種進口乳粉)均購自當?shù)厮幍辍⒊小?/p>

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

DB-17MS 石英毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mm,0.25μm);載氣為氦氣,純度為99.999%;恒線速率模式,線速率39.8 cm·s-1;進樣口溫度290 ℃;不分流進樣;進樣量1μL。柱升溫程序:初始溫度55 ℃;以30 ℃·min-1升溫至130 ℃;以10 ℃·min-1升溫至290 ℃,保持8 min;總運行時間為26.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源;電離能量70 e V;離子源溫度230 ℃;接口溫度280℃;溶劑延遲時間5 min;選擇離子監(jiān)測(SIM)模式;掃描離子質(zhì)荷比(m/z)169,168,167,第一個離子為定量離子。

1.3 試驗方法

將3 g(精確至0.01 g)乳粉樣品置于50 mL 具塞離心管中,加入20 mL乙腈和5 g氯化鈉,用均質(zhì)器均質(zhì)2 min,以4 200 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 雞心瓶中。用20 mL 乙腈重復提取一次,合并上清液,于40℃旋蒸至1 mL。用體積比3∶1 乙腈-甲苯混合溶液5 mL 潤洗Carb/NH2小柱,保持柱體濕潤,將上述溶液過柱,收集流出液。用體積比3∶1乙腈-甲苯混合溶液5 mL 洗滌雞心瓶,洗滌液過柱,再加入體積比3∶1乙腈-甲苯混合溶液20 mL洗脫柱子,收集流出液。凈化過程控制流出速率為1 mL·min-1,合并流出液,于40℃水浴中旋蒸至近干,氮氣吹干,用1 mL乙酸乙酯溶解后按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

按照儀器工作條件測定二苯胺標準溶液,保留時間為10.0 min,其色譜圖見圖1。

圖1 二苯胺的色譜圖Fig.1 Chromatogram of diphenylamine

2.2 提取條件的選擇

試驗比較了分別以丙酮、乙腈、體積比1∶1乙酸乙酯-正己烷混合溶液作為乳粉中二苯胺的提取溶劑時的提取效果。結(jié)果表明,除乙腈外,其他提取溶劑均會提取出大量脂肪,給后續(xù)凈化帶來較大負擔,故試驗選擇以乙腈作為提取溶劑。

另外,GB/T 23210-2008 在提取時會加入一定量的無水硫酸鎂用于除水,因此試驗比較了加入無水硫酸鎂前后加標樣品中二苯胺回收率的變化。結(jié)果表明,加入無水硫酸鎂前后,二苯胺的回收率無顯著差異,推測與乳粉屬于干性樣品且二苯胺在水中溶解度極低有關(guān)。因此,試驗選擇在提取時不加無水硫酸鎂。

2.3 凈化柱的選擇

參照GB/T 23210-2008,以乙腈作提取溶劑,以C18小柱作凈化柱,在SIM 模式下(以m/z169作為定量離子,m/z167,168 作為定性離子)用GCMS測定10種市售乳粉中二苯胺的殘留量,以基質(zhì)匹配法定量。結(jié)果顯示,樣品中二苯胺的檢出率為100%,推測可能存在假陽性現(xiàn)象。為驗證這一推測,參照GB/T 23210-2008,用GC-MS 對二苯胺標準溶液和乳粉樣品溶液分別進行質(zhì)譜全掃描。結(jié)果顯示,二苯胺標準溶液質(zhì)譜圖的基峰為m/z169,而樣品溶液質(zhì)譜圖中豐度比較高的峰分別在m/z73,169處,其中基峰為m/z73,提示有基質(zhì)干擾存在。進一步用GC-MS/MS 進行二級質(zhì)譜確認,所得二苯胺的定量離子對為m/z169.1/66.0,定性離子對為m/z167.1/139.1和m/z167.1/77.0,其中二苯胺標準質(zhì)譜圖中3個離子對的豐度比為100∶99∶49,而樣品中的豐度比為100∶21∶16,說明樣品中疑似二苯胺的物質(zhì)為干擾物質(zhì),即以GB/T 23210-2008檢出的二苯胺結(jié)果為假陽性,可能原因為國家標準方法前處理過程凈化不完全,乳粉中的干擾物質(zhì)隨著待測物一起流出,造成基質(zhì)干擾。

Florisil小柱和Carb/NH2小柱均是農(nóng)殘分析常用的固相萃取凈化柱,其中前者成本較低,可用于復雜基質(zhì)樣品的分析;后者上層是活性炭,脫色效果明顯,下層為富含氨基的物質(zhì),能和糖、蛋白質(zhì)、脂肪中的相關(guān)基團形成氫鍵,從而去除基質(zhì)中大部分干擾物[13]。分別采用Florisil小柱和Carb/NH2小柱替代C18小柱凈化加標樣品(加標量為0.05 mg·kg-1)。其中,以Florisil小柱凈化時,先分別用體積比1∶9 丙酮-正己烷混合溶液和正己烷各5 mL潤洗Florisil小柱,保持柱體濕潤;將提取液氮吹至干,用2 mL正己烷復溶,過Florisil小柱,收集流出液,用體積比1∶9 丙酮-正己烷混合溶液5 mL洗滌雞心瓶,洗滌液過柱,加入體積比1∶9的丙酮-正己烷混合溶液5 mL 洗脫柱子;凈化過程控制流出速率為1 mL·min-1,合并流出液,于40 ℃旋蒸至近干,氮氣吹干,用1 mL 乙酸乙酯溶解,按照儀器工作條件測定。

結(jié)果顯示:Florisil小柱和Carb/NH2小柱所得二苯胺的回收率分別為129%和89.6%,前者所得回收率超出GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[14]關(guān)于回收率范圍的規(guī)定(加標量小于0.1 mg·kg-1時,回收率為60%～120%),說明采用Carb/NH2小柱所得測定值的準確度更高。

分別采用Florisil小柱和Carb/NH2小柱凈化空白樣品,比較了兩種凈化柱的雜質(zhì)去除效果,結(jié)果見圖2。

圖2 Florisil小柱和Carb/NH2 小柱凈化后空白樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of blank sample solutions purified by Florisil cartridge and Carb/NH2 cartridge

由圖2可知:經(jīng)Florisil小柱凈化后,空白樣品溶液分別在9.4,11.5 min處出現(xiàn)兩處峰展寬較大的雜質(zhì)峰,對色譜系統(tǒng)有潛在污染,儀器的維護成本高;而Carb/NH2小柱的凈化效果較好,并未出現(xiàn)峰展寬較大的雜質(zhì)峰。

乳粉基質(zhì)復雜,含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪和糖等[15],基質(zhì)干擾較大。參考文獻[16-19],進一步比較了分別采用Florisil小柱和Carb/NH2小柱凈化時的基質(zhì)效應。分別用空白樣品溶液和正己烷配制基質(zhì)匹配標準溶液系列和標準溶液系列(濃度點均為0.01,0.02,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L-1),按 照儀器工作條件測定并進行線性回歸。以前者標準曲線和后者標準曲線斜率的差值與后者標準曲線斜率比值計算基質(zhì)效應(ME)值[20]。結(jié)果表明:Florisil小柱所得ME值為53.3%,顯示出強基質(zhì)效應(ME值絕對值大于50%),應通過一定補償措施來降低或消除,比如加入同位素標記的目標物、采用基質(zhì)匹配法、加入目標物保護劑、增加凈化步驟或進樣前稀釋等[15,20];Carb/NH2小柱所得ME 值為-5.3%,顯示出弱基質(zhì)效應(ME 值絕對值不大于20%),可直接采用正己烷配制的二苯胺標準溶液系列定量[19]。

綜上,采用Carb/NH2小柱凈化時,測定值準確度高、樣品溶液中干擾物少且基質(zhì)效應較弱,因此試驗選擇以Carb/NH2小柱凈化樣品。

2.4 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定二苯胺標準溶液系列,以二苯胺質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示,標準曲線的線性范圍為0.01～1.00 mg·L-1,線性回歸方程為y＝4.855×105x+1.350×103,相關(guān)系數(shù)為0.998 8。

以不小于3倍信噪比對應的質(zhì)量濃度計算檢出限,所得結(jié)果為3.4μg·kg-1。

2.5 精密度和回收試驗

對空白乳粉樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,加標量分別為0.01,0.05,0.20 mg·kg-1,加標后混勻并靜置2 h,按照試驗方法分析,每個濃度水平均分析6個平行樣,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示,3個濃度水平下二苯胺的回收率分別為84.6%,88.1%,93.1%,測定值的RSD 分別為7.5%,5.5%,4.2%,精密度和準確度均符合檢測要求[14]。

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析10種市售乳粉樣品,若為陽性樣品,則用GC-MS/MS 進行進一步確證。結(jié)果顯示,10種乳粉樣品中均未檢出二苯胺,在一定程度上說明市售乳粉中二苯胺殘留風險較低。

針對國家標準方法GB/T 23210-2008假陽性率高的現(xiàn)象,本工作改進了國家標準方法,以Carb/NH2小柱代替C18小柱凈化樣品,用GC-MS測定,以普通外標法代替基質(zhì)匹配法進行定量。本方法簡單、快速、精密度高、準確度好,可用于乳粉中二苯胺殘留量的測定。