Micro-CT 觀察牙周炎大鼠造模同側(cè)下頜牙槽骨的骨微結(jié)構(gòu)變化

盛晨 陳浩彬 郭亞霖 侯文杰 汪林

牙周炎(Periodontitis)是一種牙周免疫炎癥性疾病，它多由口腔的菌群紊亂導(dǎo)致，菌群紊亂可以通過刺激炎性細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，造成牙周組織的破壞，比如牙齦和牙周韌帶的損傷，以及牙槽骨的吸收[1]?？谇晃⑸锏氖д{(diào)與炎性介質(zhì)的釋放可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的數(shù)量增多與活性增強(qiáng)，并最終造成牙槽骨的結(jié)構(gòu)破壞與骨吸收[2-4]。有研究使用顯微CT(Micro computed tomograhy，Micro-CT)圖像分析牙周炎對大鼠根分叉區(qū)牙槽骨微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠造模側(cè)的根分叉區(qū)牙槽骨骨量下降、骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞，且隨動物模型建模的時間延長而更加嚴(yán)重[5]。而牙周炎大鼠的口腔菌群紊亂，免疫紊亂和破骨細(xì)胞的活化會對整個口腔產(chǎn)生影響[6-7]，可能會導(dǎo)致口腔不同位置的頜骨結(jié)構(gòu)變化。既往關(guān)于牙周炎對牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)影響的研究中，重心主要在牙周炎模型建模同位置的牙槽骨，而缺乏對頜骨不同位置牙槽骨的分析。Micro-CT 不需要破壞牙槽骨，便可通過對其掃描、重建和分析，從而測量出其內(nèi)部的骨微結(jié)構(gòu)信息[8-9]。本研究建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，通過Micro-CT 分析掃描并重建造模處及造模同側(cè)下頜牙槽骨，觀察其骨量和骨微結(jié)構(gòu)變化，初步探討牙周炎局部造模對同側(cè)下頜牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)變化的影響。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8 周齡SPF 級SpragueDawley(SD)雌性大鼠12 只，質(zhì)量(180±20)g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供。于解放軍總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對濕度40%～60%，自由飲水、攝食，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批(批準(zhǔn)號：2019-X15-44)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及相關(guān)材料 實(shí)驗(yàn)用牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)ATCC 33277 株(北京中科質(zhì)檢公司)；戊巴比妥鈉；多聚甲醛(百奧康生物技術(shù)有限公司)；羧甲基纖維素鈉(北京酷來搏科技有限公司)；3-0手術(shù)縫合線(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)；Inveon MM CT(SIEMENS，德 國)；Inveon Acquisition Workplace 掃描軟件(SIEMENS，德國)；Inveon Research Workplace 分析軟件(SIEMENS，德國)；COBRA_Exxim 重建軟件。

1.3 動物分組與模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)性牙周炎組(Experimental Periodontitis，EP)和對照組(Control，CON)，每組n=6，EP 組經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.12mL/100g 麻醉，固定大鼠頭部并充分暴露雙側(cè)上頜磨牙，探針分離牙齦，將3-0 手術(shù)縫合線結(jié)扎于上頜第一磨牙牙頸部[10-11]；CON 組僅麻醉并觀察雙側(cè)上頜磨牙，不做其他處理。術(shù)后，常規(guī)鼠糧飼養(yǎng)。P.gingivalis 細(xì)菌與6%羧甲基纖維素鈉混懸凝膠，涂抹結(jié)扎線處，隔一天一次，至造模手術(shù)后12 周結(jié)束。大鼠每隔2 周稱重，觀察大鼠進(jìn)食及精神活動狀況并隨時檢查EP 組結(jié)扎絲線脫落情況。

1.4 牙周檢測指標(biāo) 觀察牙周組織色、形、質(zhì)的變化，實(shí)驗(yàn)前由同一位口腔專業(yè)醫(yī)生利用牙周細(xì)探針對SD 大鼠檢查記錄齦出血指數(shù)和探診深度。

1.5 動物處死及標(biāo)本制備 造模12 周后使用過量戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠。分離上頜骨和下頜骨，保存于4%多聚甲醛固定液中，樣本固定1 周。

1.6 Micro-CT 掃描及圖像分析 樣本固定1 周后，校準(zhǔn)Inveon MM CT 并將大鼠頜骨放入micro-CT 標(biāo)本倉中進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)為：電壓80kV，電流500μA，曝光時間1000ms，有效像素值為9.21μm。將二維圖像用軟件重建為三維圖像并進(jìn)行分析。牙槽骨吸收情況由各樣本上頜第一磨牙的釉牙本質(zhì)界(cemento-enamel junction，CEJ)至牙槽嵴頂(alveolar bone crest，ABC)的距離表示，即取每一個樣本牙齒的頰側(cè)近中、中間及遠(yuǎn)中共三個位點(diǎn)CEJ-ABC 距離(圖1)并取平均值。本研究選取的興趣區(qū)域(region of interest，ROI)為第一、第二磨牙牙根間的牙槽骨[12](圖2)。利用Inveon Research Workplace 分析該區(qū)域內(nèi)的骨結(jié)構(gòu)參數(shù)，研究參數(shù)如下：骨密度(bone mineral density，BMD)；骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/ total volume，BV/ TV)；骨表面積/ 骨體積(bone surface area/ bonevolume，BS/ BV)；骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)；骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)和骨小梁分離度(Trabecular Spacing，Tb.Sp)。

圖1 牙槽骨CEJ-ABC 距離的測量

圖2 第一、第二磨牙牙根間的牙槽骨興趣區(qū)域(ROI)

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用表示采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大鼠體重的觀察 術(shù)后飼養(yǎng)12 周后，EP組大鼠的平均體重為302.8±50.6g，CON 組大鼠的平均體重為284.8±33.0g。兩組大鼠的體重在喂養(yǎng)的12 周體重均正常上升，兩組體重未產(chǎn)生顯著性差異(圖3)，可以認(rèn)為一般情況和攝食未對兩組的體重產(chǎn)生差異性的影響。

圖3 CON 組和EP 組的大鼠體重隨造模時間延長的變化

2.2 牙周炎模型檢測 建模8 周后CON 組大鼠牙齦正常，無明顯炎癥；EP 組大鼠表現(xiàn)出現(xiàn)牙齦炎癥，部分大鼠結(jié)扎區(qū)可探及較深的牙周袋，臨床可見紅腫，探診易出血，非結(jié)扎區(qū)牙齦無明顯炎癥表現(xiàn)(圖4)。

圖4 CON 組和EP 組大鼠的牙齦表現(xiàn)

2.3 牙周炎水平的判斷 12 周后兩組大鼠上頜牙槽骨Micro-CT 重建圖像顯示，相比于CON組(圖5A)，EP 組的牙槽骨有明顯的吸收(圖5B)，第一磨牙的遠(yuǎn)中根與第二磨牙的近中根明顯暴露出來，EP 組的平均CEJ-ABC 距離為1.09mm，CON組為0.65mm，EP 組顯著高于CON 組(圖5C)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，證明上頜牙周炎模型的建立成功。

圖5 兩組大鼠上頜牙槽骨的吸收程度(CEJ-ABC 距離)

2.4 牙槽骨的Micro-CT 骨微結(jié)構(gòu)變化 對大鼠造模處及造模同側(cè)下頜牙槽骨的松質(zhì)骨進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與CON 組的上頜ROI 相比，EP 組上頜ROI 的牙槽骨骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/ TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)都顯著性降低(P<0.05)，而骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨表面積/ 骨體積(BS/ BV)則顯著性增高(P<0.05)；EP 組骨小梁分離度(Tb.Sp)均數(shù)雖有增高，但未產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(圖6)。而在造模同側(cè)下頜的ROI 處，EP 組的牙槽骨骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/ TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)也都顯著性降低，骨表面積/ 骨體積(BS/ BV)顯著性增高(P<0.05)，與上頜牙槽骨的差異趨勢相同；而EP 組的骨小梁數(shù)量(Tb.N)則是顯著性降低(P<0.05)，與上頜牙槽骨的差異趨勢相反；同時骨小梁分離度(Tb.Sp)的增高也產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P<0.05)(圖7)。這些結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠造模處和造模同側(cè)下頜牙槽骨均產(chǎn)生了骨微結(jié)構(gòu)的變化。

圖6 上頜牙槽骨的骨微結(jié)構(gòu)

圖7 下頜牙槽骨的骨微結(jié)構(gòu)

3.討論

牙周炎是成年人最常見的口腔感染之一，它被認(rèn)為是人類第二常見的口腔疾病，是老年人牙齒脫落的主要原因。牙菌斑生物膜是牙周炎的始動因子，這些細(xì)菌或其毒力因子可以造成牙周組織直接損傷，也可以通過誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)間接損傷牙周組織，引起牙周組織慢性炎癥，導(dǎo)致牙槽骨吸收與顯微結(jié)構(gòu)的破壞[13-15]。目前的研究表明，骨質(zhì)疏松、糖尿病、免疫紊亂導(dǎo)致的疾病等都會加重牙周炎[16-20]。同時，牙周炎也被認(rèn)為與多種全身代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如II 型糖尿病、炎癥性腸病和動脈粥樣硬化[21-22]。

結(jié)扎誘導(dǎo)是牙周炎模型建立的常用方法，通常是將結(jié)扎絲放置于大鼠上頜或下頜磨牙的頸部區(qū)域，通過細(xì)菌的定植積聚，不斷刺激結(jié)扎處牙周組織，從而出現(xiàn)類似于臨床所見的牙槽骨丟失。先前研究已經(jīng)證明牙周炎模型造模處牙槽骨的骨丟失與骨微結(jié)構(gòu)破壞[5]，此外，局部牙周炎還可以改變整個口腔的微生物環(huán)境，而頜骨不同位置的牙槽骨是否會隨口腔微生物環(huán)境的紊亂而受影響，是個未被發(fā)掘的問題。本研究建立大鼠上頜局部牙周炎模型，通過Micro-CT 觀察了局部造模處和下頜同位置牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)變化，初步探討局部牙周炎造模對同側(cè)下頜牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)變化的影響。

骨密度(BMD)與骨體積分?jǐn)?shù)(BV/ TV)是臨床中最常用的衡量骨量的參數(shù)。骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)是評價(jià)骨質(zhì)量的直接指標(biāo)，包括骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)及骨小梁分離度(Tb.Sp)。既往研究發(fā)現(xiàn)，上頜牙周炎建模后8 周，上頜ROI 區(qū)牙槽骨的BMD、BV/ TV、Tb.Th 差異性降低，Tb.N 和Tb.Sp 則差異性增高。Tb.N 的升高被認(rèn)為是牙槽骨相比其他位置松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)特殊所致，牙槽骨吸收使板狀骨小梁形成相互分離的桿狀骨小梁，從而增加骨小梁之間連接點(diǎn)，導(dǎo)致小梁數(shù)的增高。而在我們的研究中，ROI 為第一磨牙、第二磨牙牙根之間的牙槽骨。發(fā)現(xiàn)除了Tb.Sp 的差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0536)，其余骨吸收和小梁結(jié)構(gòu)指標(biāo)都產(chǎn)生了相同方向的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，Tb.N 也出現(xiàn)了差異性增高(圖5E)，同時發(fā)現(xiàn)BS/ BV這一指標(biāo)也產(chǎn)生了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高(圖5C)，這些結(jié)果證明本研究成功建立了牙周炎模型，并且對選取的ROI 也可以重復(fù)出先前的研究結(jié)果。其中Tb.Sp 的t 檢驗(yàn)P 值為0.0536，未達(dá)到明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是由于樣本量的原因所致。而對牙周炎造模同側(cè)下頜的牙槽骨研究發(fā)現(xiàn)，EP 組大鼠下頜牙槽骨BMD、BV/ TV、Tb.Th 也出現(xiàn)差異性降低，Tb.Sp 和BS/ BV 出現(xiàn)了差異性增高，這與上頜骨的牙槽微觀結(jié)構(gòu)變化趨勢是相同的，而EP 組的Tb.N 則出現(xiàn)了差異性的降低，與上頜相反。實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)下頜的牙槽松質(zhì)骨體積較上頜牙槽更大，骨小梁結(jié)構(gòu)也與腰椎和股骨等位置的松質(zhì)骨近似，所以隨著牙槽骨的吸收，下頜骨小梁數(shù)也產(chǎn)生了差異性降低(P<0.05)，這與上頜的結(jié)果相反，但同樣能證明下頜牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)的變化。而下頜牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)的變化與上頜綁線處的骨吸收機(jī)制是否相同，是否與結(jié)扎絲導(dǎo)致的菌群變化相關(guān)，仍然有進(jìn)一步研究的空間。

本研究通過結(jié)扎誘導(dǎo)建立局部牙周炎模型，通過Micro-CT 觀察實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠造模處和造模同側(cè)下頜牙槽骨的骨微結(jié)構(gòu)變化。其結(jié)果顯示，EP 組大鼠下頜牙槽骨BMD、BV/ TV、Tb.Th 出現(xiàn)差異性降低，Tb.Sp 和BS/ BV 出現(xiàn)了差異性增高，這與上頜骨的牙槽微觀結(jié)構(gòu)變化趨勢相同，初步表明造模同側(cè)下頜牙槽骨的骨微結(jié)構(gòu)變化。但本研究樣本量不夠大，對研究結(jié)果的可靠性有所限制，且無法證明局部牙周炎造成同側(cè)下頜牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)變化的原因，也未證明對口腔其他部位骨微結(jié)構(gòu)的影響，需要更多研究進(jìn)一步探索其原因以及局部牙周炎對口腔不同部位骨組織的影響和相關(guān)機(jī)制。