減氮和秸稈還田對旱地土壤微生物和硝化潛勢的影響

劉 晶，鄭利芳，王 穎,，黨廷輝,

(1.西北農林科技大學資源環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100；2.中國科學院水利部水土保持研究所，陜西 楊凌 712100)

氮肥在促進我國糧食作物增產和農業(yè)持續(xù)發(fā)展過程中起到重要作用。由于氮肥在土壤中形態(tài)不穩(wěn)定，易損失，因此加強農田土壤氮素管理具有重要意義。眾多學者研究結果表明，施氮增加土壤硝化潛勢，且隨施氮量的增加而增加。硝化作用增強，氮肥易被硝化成硝態(tài)氮，使作物可利用的有效氮素降低，造成氮肥無效輸入、損失嚴重及環(huán)境污染等一系列問題。減肥增效是我國農業(yè)糧食生產持續(xù)發(fā)展的目標。科研人員進行大量研究以求優(yōu)化氮肥投入，保證作物增產的同時減少硝態(tài)氮損失，促進農業(yè)健康發(fā)展。趙士誠等研究表明，當?shù)貍鹘y(tǒng)施肥下減量施氮30%后，提高了夏玉米產量，減少田間氮素損失。秸稈還田是實現(xiàn)節(jié)肥增效、綠色發(fā)展的重要措施。吳傳發(fā)等分別在北方潮土和南方紅壤2種典型旱作農田上進行研究后表明，秸稈還田配施減量氮肥能減緩土壤硝化潛勢，提高土壤肥力，增加作物產量。因此，優(yōu)化氮肥管理措施以更好地減少氮肥投入，并利用秸稈資源對促進旱地玉米產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

氨氧化微生物驅動的氨氧化過程是硝化作用的限速步驟，在農田氮素調控中發(fā)揮著關鍵作用。合理施肥和秸稈還田不僅可以提高土壤質量，而且顯著影響土壤氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的數(shù)量和活性。郭俊杰等在白土型水稻土上采用田間試驗研究發(fā)現(xiàn)，施肥通過影響AOB豐度，提高土壤硝化潛勢，因此在調控氮素硝化進程時，需重點研究AOB群落結構；而Ella等研究表明，秸稈配施氮肥顯著增加AOA的豐度，對AOB影響不顯著，認為AOA主導試驗土壤的氨氧化過程。因此，土壤氨氧化微生物對施氮和秸稈還田調控氮素轉化的響應存在差異，有必要開展進一步深入研究。

黃土旱塬春玉米連作區(qū)屬于雨養(yǎng)農業(yè)區(qū)域，該地區(qū)農田長期存在過量施氮或不平衡施氮等問題，造成土壤中硝態(tài)氮殘留量過高。減量減氮、秸稈還田是當?shù)刈杩叵鯌B(tài)氮淋溶的重要措施，但其影響土壤氮素轉化的微生物學機制等相關研究較少，有待于進一步研究。因此，本研究在長武地區(qū)布設3年的田間試驗，通過探究黃土高原旱地春玉米連作系統(tǒng)中減氮和秸稈還田對春玉米產量、硝態(tài)氮殘留量及微生物學特性等指標的影響，以期為本區(qū)玉米種植區(qū)氮肥管理和農業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論與技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

田間試驗于2017年4月至2019年9月在陜西長武試驗站(35°12′N，107°40′E)進行，海拔1 200 m，屬半干旱濕潤性季風氣候，年日照時間2 230 h，年均氣溫9.2 ℃，年均降水量560 mm，且集中在7-9月。供試土壤為黏壤質黑壚土，試驗初耕層土壤的有機碳含量6.5 g/kg，全氮含量0.8 g/kg，速效磷含量5.0 mg/kg，速效鉀129.3 mg/kg，pH 8.4。供試作物為春玉米“先玉335”，種植制度為每年一熟，連作種植。

1.2 試驗設計

采用隨機區(qū)組設計，共5個處理，分別為：(1)CK，不施肥(對照)；(2)N250，傳統(tǒng)施氮，施氮量為250 kg/hm；(3)N250+S，傳統(tǒng)施氮配合秸稈還田，施氮量為250 kg/hm；(4)N200，傳統(tǒng)施氮量的80%，即減氮20%，施氮量為200 kg/hm；(5)N200+S，減氮20%配合秸稈還田，施氮量為200 kg/hm)，所有處理3次重復。秸稈還田量約為15 000 kg/hm，供試秸稈為當?shù)厣霞居衩资斋@后所得原小區(qū)的全部玉米秸稈，將全部玉米秸稈切割為30 cm的小段，在田間小區(qū)內開6條溝，溝寬40 cm，溝間距40 cm，均勻地將秸稈埋入對應小區(qū)30 cm土層，覆土時，將相應位置挖出的全部土壤原位回填。所有處理均施用等量的磷鉀肥(PO120 kg/hm和KO 38 kg/hm)，肥料采用撒施方式，根據當?shù)氐牧晳T施肥方式，作基肥播前一次性施入，不追肥，氮肥為尿素(含N 46.4%)，磷肥為過磷酸鈣(含PO16%)，鉀肥為硫酸鉀(含KO 51%)。在2017—2019年的原位試驗中，玉米于每年的4月下旬播種，9月下旬收獲。小區(qū)面積為46.75 m(8.5 m×5.5 m)，采用半地膜種植模式，膜寬80 cm，行距60 cm，株距30 cm。

1.3 土壤樣品采集

試驗第3年(2019年)在樣方內采用5點取樣法于玉米吐絲期用土鉆在0-20 cm土層采集土樣，另于玉米收獲后采用同樣方法分層采集0-300 cm的土樣(0-100，100-300 cm土層分別按間隔10 cm和20 cm等層多點混合取樣)。2個時期的土壤樣品均按層次混合后放入塑封袋，用冰盒運輸于實驗室冷凍保藏(-20 ℃)。玉米吐絲期土壤樣品過2 mm篩，挑去篩下土壤中可見的雜質、石塊以及根系，然后將其分成2部分：一部分鮮土樣測定硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、土壤硝化潛勢、微生物量碳和氮，余下一部分自然風干后測定土壤全氮；另一部分冰箱保存(-80 ℃)，用于土壤總DNA提取及后續(xù)分析。玉米收獲后采集的土壤樣品過2 mm篩，挑去篩下土壤中可見的雜質、石塊以及根系，用于測定硝態(tài)氮殘留量。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 玉米產量測定 在每年玉米收獲期，各小區(qū)隨機選擇16 m的樣方取樣，稱量全部玉米穗鮮重，再從中選取20個代表性玉米穗，帶回實驗室，脫粒后風干，稱取籽粒重并折算其產量。

1.4.2 土壤樣品測定 全氮采用凱氏定氮法測定，硝(銨)態(tài)氮的測定是將鮮土樣混勻后過2 mm篩，稱取5.0 g樣品，用1 mol/L KCL浸提，然后采用流動分析儀測定。硝化潛勢采用氯酸鹽抑制法(水土比4∶1)。土壤微生物量碳和氮(SMBC、SMBN)的測定是氯仿熏蒸—KSO浸提法(水土比4∶1)。

1.5 氨氧化微生物(AOA、AOB)功能基因數(shù)量的測定

1.5.1 DNA提取 土壤總DNA的提取使用Fast DNA Spin Kit For Soil試劑盒，參照說明進行提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA純度和完整性，用核酸定量儀測定提取DNA濃度和純度。

1.5.2 標準品制備及熒光定量PCR 將提取的混合DNA作為模板對目標基因進行PCR，經過瓊脂糖凝膠純化后，測定PCR產物濃度，根據公式計算目標基因的拷貝數(shù)，然后逐漸稀釋，制備成拷貝數(shù)的10～10倍的標準品。AOA和AOB的amoA基因拷貝數(shù)采用SYBR Green I染料法進行實時定量PCR。提取的DNA原液稀釋5倍(約5 ng/μL)后，作為定量PCR的模板DNA。PCR反應體系為25 μL：其中12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM(Takara)，正反向引物各0.17 μL，DNA模板2 μL，然后用ddHO補足至25 μL。陰性對照用ddHO代替DNA模板。實時定量PCR所用引物序列及反應程序等見表1。將待測樣品和標準品在定量PCR儀上同時進行PCR循環(huán)，依據一系列標準品的值會自動得出標準曲線，然后根據樣品的值和標準曲線求得基因拷貝數(shù)。

表1 實時定量PCR所用引物及反應程序

1.6 數(shù)據處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0軟件進行方差分析和相關性分析，LSD法進行多重比較(=0.05)；采用Origin 2021軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 減氮和秸稈還田對玉米產量及土壤硝態(tài)氮殘留量的影響

減氮、秸稈還田可以增加玉米籽粒產量，并減少土壤硝態(tài)氮殘留量。從表2可以看出，2017-2019年各處理玉米平均籽粒產量分別為13.1 t/hm(N250)，13.9 t/hm(N200)，14.3 t/hm(N250+S)和14.9 t/hm(N200+S)。對玉米籽粒產量的方差分析表明，N200處理沒有降低玉米籽粒產量，N200較N250處理玉米籽粒產量提高5.9%。秸稈還田顯著提高玉米籽粒產量(<0.05)，N200+S較N200處理玉米籽粒產量提高7.4%，N250+S較N250處理玉米籽粒產量提高9.1%。可見，在黃土高原旱地春玉米連作區(qū)減氮20%不會降低春玉米籽粒產量，秸稈還田配施減量氮肥獲得3年平均最高產量。

表2 不同處理下玉米籽粒產量 單位：t/hm2

從第3年玉米收獲后土壤硝態(tài)氮測定結果(圖1)來看，施氮顯著增加0—300 cm土層硝態(tài)氮殘留量，增加幅度為65.91%～315.48%，100—300 cm土層，土壤硝態(tài)氮殘留量對施氮處理的響應與0—300 cm土層規(guī)律一致，與CK相比，N200+S、N200、N250+S和N250處理土壤硝態(tài)氮殘留量平均增幅分別為39.16%，134.93%，171.62%，342.36%。減氮和秸稈還田處理(N200、N250+S、N200+S)均能降低土壤硝態(tài)氮殘留量(<0.05)，且減少硝態(tài)氮向下移動。N200較N250處理硝態(tài)氮殘留量在0—300 cm土層和100—300 cm土層分別減少51.3%和46.9%；N200+S較N200處理硝態(tài)氮殘留量在0—300 cm土層和100—300 cm土層分別減少18.0%和40.8%，N250+S較N250處理硝態(tài)氮殘留量在0—300 cm土層和100—300 cm土層分別減少41.2%和38.6%?？梢?，減氮、秸稈還田可以降低土壤硝態(tài)氮殘留量，且阻控硝態(tài)氮向下淋溶。

注：同一土層不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 減氮和秸稈還田對土壤硝化潛勢的影響

2.3 減氮和秸稈還田對土壤微生物量碳、氮(SMBC、SMBN)的影響

從第3年玉米吐絲期0—20 cm土壤測定結果(表3)可以看出，SMBC和SMBN的變化趨勢為N200+S>N250+S>N200>N250>CK。施氮處理的SMBC、SMBN含量顯著高于對照處理(<0.05)，SMBC、SMBN含量分別比對照提高12.4%～37.5%和32.0%～78.1%，減氮提高SMBC、SMBN含量，但未達到統(tǒng)計學上的差異。而秸稈還田對SMBC、SMBN影響顯著，N250+S較N250處理SMBC、SMBN分別顯著提高17.5%和24.0%，N200+S較N200處理SMBC、SMBN分別顯著提高18.4%和31.3%。表明秸稈還田顯著提高土壤微生物碳(SMBC)和微生物氮(SMBN)含量。

表3 不同處理下土壤微生物量碳、氮含量 單位：mg/kg

2.4 減氮和秸稈還田對土壤氨氧化微生物(AOA、AOB)的影響

從第3年玉米吐絲期0—20 cm土壤測定結果(圖2)可知，各處理AOA數(shù)量明顯高于AOB。不同處理中AOA和AOB的amoA基因拷貝數(shù)log值分別為6.70～6.77，5.49～6.29 copies/g。方差分析結果顯示,AOA數(shù)量在各處理間無顯著差異，施氮顯著增加AOB數(shù)量(<0.05)，增幅大小依次為N200+S>N250+S>N250>N200。與CK相比，施氮處理的氨氧化細菌數(shù)量顯著增加10.3%～14.5%。減氮對AOB數(shù)量的變化不明顯，秸稈還田增加AOB數(shù)量，N250+S較N250處理土壤AOB數(shù)量增加0.6%，N200+S較N200處理土壤AOB數(shù)量增加3.9%。綜合來看，施氮和秸稈還田對AOB影響較大，而AOA則沒有明顯的響應。

圖2 不同處理對土壤氨氧化微生物的amoA基因拷貝數(shù)的影響

2.5 土壤氨氧化微生物與土壤性質的相關性分析

將氨氧化微生物與土壤性質進行相關性分析(表4)表明，氨氧化細菌(AOB)的amoA基因豐度受到旱地春玉米土壤的硝態(tài)氮(=0.677)、銨態(tài)氮(=0.839)、SMBC(=0.755)、SMBN(=0.750)和硝化潛勢(=0.783)的共同影響(<0.01)，其中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、AOB基因豐度對土壤硝化潛勢有較強影響，具體表現(xiàn)為硝化潛勢與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、AOB基因豐度均呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別達到0.877，0.698，0.775，0.750和0.783(<0.01)。SMBN與全氮呈顯著正相關，與SMBC、銨態(tài)氮呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.913，0.739(<0.01)，硝態(tài)氮與銨態(tài)氮呈極顯著正相關，而氨氧化古菌(AOA)amoA基因豐度和影響因子沒有明顯的相關性。

表4 氨氧化微生物與土壤性質的Pearson相關系數(shù)

3 討 論

減肥增效是我國農業(yè)糧食生產持續(xù)發(fā)展的目標。本研究相關性分析表明，土壤硝化潛勢受到硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的共同影響，與硝(銨)態(tài)氮均呈極顯著正相關關系，說明施氮一方面提高土壤氮素水平，另一方面也易引起硝態(tài)氮向深層土壤淋溶累積，導致氮素損失風險加大，易造成環(huán)境污染。氮肥用量對作物產量及環(huán)境影響的研究表明，在過量施氮地區(qū)，常規(guī)施肥下適量減少氮肥用量不會降低作物產量，張建軍等通過3年田間定位試驗研究表明，秸稈還田配施減量20%～40%氮肥能提升玉米產量，并改善產量性狀；李錦等進行4年田間定位試驗(小麥—玉米輪作系統(tǒng))研究發(fā)現(xiàn)，在秸稈還田條件下較常規(guī)施肥(玉米施氮量188 kg/hm，小麥施氮量150 kg/hm)減氮15%，土壤質量逐步提高，土壤NO—N積累量明顯降低，且作物籽粒增產7.2%。本研究3年試驗結果表明，在傳統(tǒng)施肥的基礎下，適量減少氮肥提高春玉米產量，顯著降低土壤硝態(tài)氮殘留量。進一步證實眾多學者針對黃土高原旱作農業(yè)區(qū)的研究結論，即傳統(tǒng)施肥下適量減少施氮量能阻控硝態(tài)氮淋溶，且不會對玉米產量產生消極影響。傳統(tǒng)施肥模式較減氮模式作物產量下降，可能是因為氮肥超量施用導致玉米過量吸收氮肥，植株葉片生長旺盛，株間通風透光能力降低，光能利用率下降；另外也導致玉米呼吸作用旺盛，提高對光合產物的消耗，使得消耗大于合成，導致減產。其次有研究發(fā)現(xiàn)，過量施氮會抑制作物對磷素養(yǎng)分的吸收，降低產量收益。

在黃土旱塬區(qū)，傳統(tǒng)施氮模式下造成硝態(tài)氮在土壤剖面中大量累積，不利于環(huán)境和經濟效益的提升。土壤殘留氮是不容忽視的氮素資源，因此，在氮素管理中要將其考慮在內，控制氮肥用量。本研究中，秸稈還田配施減量氮肥起到減肥增效的作用，這主要是因為玉米秸稈施入土壤后經過微生物的分解轉化，生成大量的有機碳源和氮源，不僅可以替代氮肥發(fā)揮作用，減少氮肥投入，降低氮肥超量施用帶來的潛在風險，還可進一步給土壤微生物提供充足的養(yǎng)分，有利于配肥土壤，提高玉米產量。添加玉米秸稈可以刺激土壤微生物活動，促進其對硝態(tài)氮的生物固持過程，減緩土壤硝化潛勢，降低土壤硝態(tài)氮殘留量。此外，本研究中，將玉米秸稈均勻埋入30 cm土層，在翻埋秸稈過程中疏松土壤，改良土壤結構，增加好氣微生物的活性，綜合改善土壤質量。

土壤微生物在土壤碳、氮轉化中起到重要作用，是秸稈的主要分解者。土壤微生物量碳、氮(SMBC、SMBN)雖然在土壤中絕對數(shù)量不多，但對外界環(huán)境變化響應強烈，是評價土壤質量變化的活指標。本研究中，秸稈還田顯著增加SMBC、SMBN含量，這與眾多學者研究結果一致，王芳等在渭北旱塬耕地上進行田間試驗表明，不同有機物料與化肥配施均增加SMBC、SMBN含量，其中秸稈堆肥處理效果為最優(yōu)；馬想等在南方紅壤旱地試驗田上探究土壤微生物對玉米秸稈配施氮肥的響應表明，添加玉米秸稈的3個處理，SMBC含量約為其他處理的10倍，SMBN含量約為其他處理的8倍。這主要是因為，玉米秸稈在微生物的作用下被分解轉化為有機物質，補充土壤中的碳源和氮源，改善土壤理化性質，促進微生物對土壤活性碳氮的固定作用，從而顯著增加SMBC、SMBN含量。相關性分析表明，土壤硝化潛勢與SMBC、SMBN并未達到顯著相關關系，這表明該地春玉米土壤硝化潛勢變化趨勢與SMBC、SMBN變化趨勢并不一致。這與前人研究結果不同，說明不同地區(qū)土壤類型、水肥條件、氣候差異等也影響土壤硝化潛勢。

旱地黑壚土呈弱堿性，施入土壤中的氮肥易被轉化為硝態(tài)氮，導致氮素淋溶損失的風險大大增加。氨氧化微生物驅動的氨氧化過程是硝化作用的限速步驟，在農田氮素循環(huán)調控中發(fā)揮著關鍵作用，因此，土壤硝化潛勢的變化可能與氨氧化微生物密切相關。氨氧化微生物的數(shù)量和活性與土壤肥力和土壤理化性質密切相關，施氮量多少和有機物料還田均對土壤產生不同的影響，進而影響氨氧化微生物的數(shù)量。本研究中，雖然土壤AOA的amoA基因拷貝數(shù)量大于AOB，但土壤AOB對施氮和秸稈還田的響應強于AOA，傳統(tǒng)施肥下減氮20%、秸稈還田顯著增加土壤AOB數(shù)量，對AOA數(shù)量影響較小，這與郭俊杰等研究結果一致。雖然AOA和AOB都在氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，但本研究中只有AOB能迅速對氮肥和玉米秸稈施用造成的土壤環(huán)境變化做出響應，這表明AOB可能主導本試驗土壤的硝化過程。相關性分析也表明，土壤硝化潛勢與AOA豐度無明顯相關關系，但與AOB豐度呈極顯著正相關。因此，在調控土壤硝化潛勢時可以重點關注AOB豐度。但多種影響因子的調控造成了硝化潛勢的差異，要想確定主導土壤硝化作用的微生物群落還需要進一步研究。

4 結 論

(1)與傳統(tǒng)施氮模式(N250)相比，減量減氮20%(N200)和秸稈還田(N250+S、N200+S)處理可以提高春玉米產量，減緩土壤硝化潛勢，阻控硝態(tài)氮向深層土壤淋溶。

(2)秸稈還田顯著提高土壤微生物量碳氮含量，增加微生物對土壤活性碳氮的固定作用。

(3)各處理土壤氨氧化古菌(AOA)數(shù)量高于氨氧化細菌(AOB)，但AOB對施氮和秸稈還田的響應強于AOA。

(4)氨氧化細菌(AOB)豐度與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、土壤微生物量碳氮(SMBC、SMBN)和硝化潛勢均呈極顯著正相關，而氨氧化古菌(AOA)豐度和影響因子沒有明顯的相關性。