LINC復合體的結構、與細胞骨架的連接及其對細胞功能調控作用研究進展

趙汐冉，張舒，胡澤兵，郭顯，石菲

空軍軍醫(yī)大學航空航天生物動力學教研室 航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，西安 710032

細胞可以感知微環(huán)境中的力學信號，將其轉換為生物化學信號或通過物理傳遞的方式傳導到細胞內，進而調整自身的力學特性和基因表達以適應生存微環(huán)境的改變［1］。近年來，越來越多的研究［2-3］顯示核骨架—細胞骨架連接物（LINC）復合體在細胞機械信號傳導與功能調控過程中扮演重要角色。LINC 復合體是由定位于內核膜的SUN（Sad1、UNC-84）結構域蛋白和定位于外核膜的KASH（Klarsicht、ANC-1、Syne homology）結構域蛋白在核周間隙互作結合形成。在胞質中，KASH 結構域可與胞質骨架的肌動蛋白、微管和中間絲相連，在胞核中，SUN結構域與細胞核骨架的核纖層蛋白、核纖層蛋白結合蛋白及染色質相連，從而為核內外細胞骨架形成機械連接搭建起橋梁。研究［4-7］表明，機械信號可經由LINC復合體傳入細胞核，通過影響細胞核的形態(tài)和遷移、染色質重構和DNA 損傷修復、特異性基因的轉錄與表達等，直接或間接地對多種細胞功能起調控作用?，F就LINC復合體的結構、與細胞骨架的連接及其對細胞功能調控作用研究進展情況綜述如下。

1 LINC復合體的組成及結構域間的相互作用

1.1 LINC 復合體的組成 核膜由兩層脂質雙分子層組成，包括外核膜和內核膜，內、外核膜之間存在著約50 nm 寬的核周間隙，兩層核膜在核孔處融合。內核膜的下方是核纖層，是由A 型、B 型纖層蛋白組成的中間細絲網狀結構，在保證核膜結構完整性以及為染色質和調節(jié)蛋白提供錨定位點方面發(fā)揮重要作用。定位在內核膜和外核膜上的蛋白質在核周間隙中互作結合，形成LINC 復合體，為細胞核骨架與細胞質骨架形成機械連接提供橋梁。LINC 復合體是從酵母到人類高度保守的跨膜蛋白復合體，其主要組成成分包括SUN 結構域蛋白和KASH 結構域蛋白［8-9］。

SUN 結構域蛋白定位于內核膜上，其C 端氨基酸序列與酵母Sad1 蛋白和線蟲UNC-84 蛋白有34%的相似性，因此被命名為Sad1、UNC-84（SUN）結構域。SUN 結構域蛋白具有N 端跨膜區(qū)、C 端保守的SUN結構域及其上游的卷曲螺旋結構域。SUN結構域蛋白的種類隨著生物復雜性的增加而增加，目前在哺乳動物中已發(fā)現5 種SUN 蛋白，SUN1 和SUN2廣泛存在于哺乳動物的各類細胞中，而SUN3、SUN4、SUN5僅在精細胞中特異性表達［8，10］。

KASH 結構域蛋白定位于外核膜上，是尾部錨定的單次跨膜蛋白。由于其C端跨膜區(qū)的氨基酸序列與果蠅Klarsicht蛋白、線蟲ANC-1蛋白、哺乳動物的Syne-1蛋白同源而得名，被稱為Klarsicht、ANC-1、Syne Homology（KASH）結構域。KASH 結構域可以與SUN 結構域結合并發(fā)生相互作用，KASH 肽鏈C-端的PPPX 基序與SUN 結構域中的20個氨基酸環(huán)共同參與LINC 復合體的形成。目前，在人體已發(fā)現6 種KASH 蛋白，其中4 種為核膜血影重復蛋白（Nesprins）。Nesprins的基本結構包括C端跨膜區(qū)的KASH結構域、N端由串聯(lián)成對的鈣結合蛋白同源域組成的肌動蛋白結合域（ABD）以及兩者之間多個血影蛋白重復序列（SR）形成的棒狀區(qū)，不同亞型擁有的SR 個數不同。Nesprin1 與Nesprin2 高度同源，其SR 區(qū)集中于C 端并被螺旋結構的小分子序列隔開，具有良好的彈性。Nesprin1/2 均有大、小兩類亞型：Nesprin1 的 大 亞 型 為Nesprin1G，Nesprin1 α 和Nesprin1 β 為 其 小 亞 型；Nesprin2 的 大 亞 型 是Nesprin2G，小 亞 型 為Nesprin2 α、Nesprin2 β、Nesprin2 γ。Nesprin3 在骨髓和脂肪組織中表達較高，具有Nesprin3α 和Nesprin3β 共2 個蛋白亞型，均不具備N 端的ABD 結構。Nesprin4在分泌性上皮細胞中表達，其結構更簡單，僅包含1個SR和KASH結構域，無ABD。KASH 5 是一種減數分裂期參與同源染色體配對的生殖細胞特異性蛋白，結構也比較簡單，包含1 個中央螺旋區(qū)和KASH 結構域。此外，淋巴限制膜蛋白（Jaw1/LRMP）是一種Ⅱ型整合膜蛋白，定位于內質網和外核膜，具有KASH 肽序列和拓撲結構，可在胞質—胞核間的機械力傳遞以及維持細胞核的定位與形態(tài)中發(fā)揮作用，因此Jaw1/LRMP被認為是KASH 結構域蛋白的新成員。KOZONO等［11］的研究顯示，Jaw1可在核周間隙與SUN1、SUN2蛋白相互作用，并以低聚物的形式與胞質表面的微管結合，通過形成跨核膜LINC復合體起維持細胞核形態(tài)的作用。

1.2 LNIC 復合體結構域間的相互作用 LINC 復合體的主要功能是連接胞質骨架與細胞核骨架，約束定位細胞核，維持整個細胞的機械特性，SUN結構域蛋白和KASH 結構域蛋白之間強而穩(wěn)定的相互作用是實現上述功能的基礎［9］。研究［12］顯示，對細胞實施低強度振動刺激時，Nesprins 和SUN 蛋白去耦聯(lián)會抑制細胞的機械調節(jié)反應。MAYER 等［13］觀察到LINC 復合體去耦聯(lián)會導致小鼠胚胎成纖維細胞（NIH3T3）的核應變和變形明顯降低，證實LINC 復合體功能喪失將影響細胞質骨架與細胞核骨架間的機械力傳導。由于C 端卷曲螺旋的存在，SUN 結構域常折疊成β-夾心結構，延伸出1 個約20 個氨基酸殘基的β-發(fā)卡，被稱為KASH-lid。在該結構的N端，螺旋延伸與相鄰的SUN 結構域形成三重卷曲螺旋，構成1 個“三葉草”形狀的同源三聚體［14］。SUN-KASH 的結合互作在靠近外核膜的核周間隙中進行，與KASH 結合后SUN 結構域的氨基酸環(huán)構象發(fā)生改變，三聚體形式的SUN 結構域與外核膜的3 個KASH 肽相互作用形成復雜的異源六聚體［9］，KASH 肽分布于2 個相鄰的SUN 結構域亞單位所形成的結合裂隙之中。所以，SUN 蛋白的三聚化是它與KASH結合的前提。

迄今為止，所有已經鑒定的KASH 多肽的1 個標志性特征就是嚴格定位于蛋白質的C 末端。研究者為進一步探究SUN-KASH 相互作用的細節(jié)，對KASH 肽殘基用數字進行反向標記［9］，從C 端開始，最后1 個殘基位置記為0，后面的依次為負數。殘基0 位于SUN 原聚體1 表面的1 個疏水口袋中，與羧酸鹽發(fā)生接觸反應，使肽長度維持高度保守性。-1、-2、-3 位置的3 個脯氨酸均為反式構象，通過范德華力與SUN 緊密結合。位置在-4、-5、-6 的殘基更多的暴露在溶劑中，它們的側鏈與SUN 的相互作用不強。-7 位置的酪氨酸處在由SUN 原聚體1 和2 形成的狹隙中，高度保守。接下來的3 個KASH 殘基夾在SUN 原聚體1 的KASH-lid 和SUN原聚體2 的核心之間，它們與KASH-lid 以氫鍵結合，形成一條β 短鏈。-9 處的亮氨酸也位于SUN 原聚體1 與2 之間的縫隙中，同樣高度保守。-11 處的脯氨酸終止了β 鏈。在-11 和-12 之間，肽鏈發(fā)生約90°的扭結，以繼續(xù)連接到-23 位置的N 端半胱氨酸上。扭結后的肽鏈僅與SUN 原聚體2 相互作用，除縮短了與-23 處半胱氨酸的距離外，最主要的作用是將-17 處的苯丙氨酸埋入疏水口袋中。-23 處的半胱氨酸與SUN-C563 以二硫鍵結合，SUN-C563 的保守性及活細胞中SUN-KASH 二硫鍵的存在進一步穩(wěn)定了SUN 與KASH 的相互作用。另外，在SUN原聚體1 和KASH 之間形成了11 個氫鍵，原聚體2與KASH 之間有13 個，通過這24 個氫鍵將KASH 肽與SUN 三聚體牢固的連接在一起。另外，SUN 在N636 處 被 糖 基 化，N636 位 于SUN 表 面 但 不 與KASH 肽接觸，說明N-糖基化對SUN-KASH 結合是非必要的?？偟膩碚f，每條KASH 肽都夾在2 個相鄰的SUN 原聚體之間并與原聚體產生許多緊密互作，以保證SUN-KASH 強而穩(wěn)定的結合關系。KASH 蛋白可以和一種或多種SUN 蛋白配對，因此LINC 復合體存在多種異構體。

2 LINC復合體與細胞骨架的連接

LINC 復合體可作為橋梁連接細胞質骨架與細胞核骨架，使機械力從胞質傳導入胞核，在細胞機械信號傳導中發(fā)揮重要作用。LINC 復合體借助KASH 結構域蛋白的N 端與細胞質骨架中的肌動蛋白、微管和中間絲相連接。細胞受到機械力刺激時，RhoA 信號被激活并在細胞內形成F-肌動蛋白應力纖維，Nesprins 可以與這些肌動蛋白纖維結合以調節(jié)細胞核的形態(tài)、方向和運動［15-16］。Nesprin1是最早發(fā)現的1 個核膜蛋白，與Nesprin2 同源度高，Nesprin1/2 可通過N 端保守的CH 域與細胞骨架肌動蛋白纖維連接。調節(jié)細胞形狀的機械刺激可使與肌動蛋白帽相互作用的Nesprins 的數量增加［15］。相反，如果Nesprins 被消耗，肌動蛋白帽則無法形成，人間充質干細胞（hMSCs）無法通過增加核張力來響應基質硬化，導致成骨激活受影響，hMSCs 從成骨分化轉向成脂分化［17］。還有研究［18］顯示，雖然基質應變激活粘著斑信號的過程不需要Nesprins參與，但當干細胞中的Nesprin1 被耗盡時，基質應變誘導的Yes 相關蛋白（YAP）入核過程會受到抑制。這些結果表明，Nesprins 可通過多種方式與肌動蛋白相互作用，在細胞質骨架和細胞核間傳遞支撐力，由此介導整個細胞的動力傳導。Nesprin3 的N 端缺乏CH 域，不能與肌動蛋白纖維直接結合，但可以與plectin 的actin 結合域相作用，進而與細胞質中的中間絲連接［19］。Nesprin4、KASH5 的N 端可分別招募并結合Kinesin-1 和Dynein，通過這種方式與胞質中的微管相互作用。KASH 結構域蛋白新成員Jaw1 也可以低聚物的形式與微管結合，不過具體機制還有待進一步研究［11］。此外，在細胞質中，肌動蛋白纖維還可以通過肌動蛋白交聯(lián)因子7與微管相連，微管又通過pectin 與中間絲相連。由此，Nesprins 一方面通過N 端以直接或間接的方式與肌動蛋白、微管、中心絲相互作用，參與胞質細胞骨架網狀連接的形成以及核膜外分子在外核膜上的錨定；另一方面，其C 端跨膜區(qū)的KASH 結構域可與SUN 結構域在核周間隙內結合，組裝形成LINC 復合體。

LINC 復合體通過SUN 蛋白的N 端延伸到細胞核中，可以與核孔復合體（NPCs）蛋白、核纖層蛋白Lamins、核纖層結合蛋白Emerin 以及染色質結合。SUN1 與NPCs 的關聯(lián)結合依賴于SUN1 核質結構域和腔內結構域的協(xié)同作用，SUN1 被干涉破壞后，NPCs 發(fā)生聚集，在核膜上的分布改變［20］。SUN1 N 端的核質結構域還可以優(yōu)先結合新合成的A 型核纖層蛋白前體，為NPCs與A型核纖層蛋白相連接提供橋梁，也進一步介導了A型核纖層在NPCs中聚集組裝。ELOSEGUI-ARTOLA 等［21］發(fā)現，生長在硬基質上的細胞會形成局灶性粘連和應力纖維，應力纖維通過與LINC 復合體耦聯(lián)向胞核傳遞力，使胞核變扁、核孔拉伸，降低了核孔轉運的機械阻力，促進YAP 入核。利用轉染阻斷Nesprins 與SUN 間的作用，使LINC 復合體功能受損，則會干擾細胞質與細胞核間的機械耦合，抑制YAP 及其輔助因子TAZ轉位，細胞增殖也會受影響。UZER 等［22］觀察到消耗或破壞SUN1/2 時，小鼠MSCs 細胞中β-連環(huán)蛋白與核骨架的相互作用受損，β-連環(huán)蛋白入核被抑制，核內表達水平下降。這說明LINC 復合體功能不良會降低機械信號（如低強度振動、基質應變等）激活β-連環(huán)蛋白的效率。此外，SUN 結構域蛋白N 端可與Emerin 結合［23］，通過Emerin 與胞核內的肌動蛋白連接，在胞質細胞骨架—核內肌動蛋白—染色質之間建立物理連接，進而影響染色質的移動和轉錄。

由此可見，LINC 復合體通過將胞質內的細胞骨架肌動蛋白、微管、中間絲同核內的核纖層、核纖層結合蛋白、核孔復合體、染色質連接起來，在胞質與胞核之間建立物理連接，確保細胞感受到的機械信號可以從胞質傳導入胞核，引發(fā)細胞核結構和功能改變的同時，影響基因的激活與表達，使細胞對機械力做出完整應答。

3 LINC復合體對細胞功能的調控作用

LINC 復合體以自身結構為基礎在核膜上搭建連接橋，使環(huán)境中的機械刺激可以持續(xù)地從細胞質傳遞到細胞核，將機械信號轉變?yōu)樯锘瘜W信號，直接或間接地調控細胞結構與功能。LINC 復合體在調節(jié)核形態(tài)和遷移、減數分裂與DNA 損傷修復、基因的轉錄與表達中發(fā)揮重要作用。

3.1 調節(jié)核形態(tài)和遷移 LINC 復合體的結構和組成是其調控細胞核形態(tài)與遷移的生物學基礎。Nesprins 決定核周肌動蛋白及中間絲的結構和分布，可對整體細胞形狀和力學響應產生影響。在NIH3T3 細胞中分析Nesprin2G 的受力情況發(fā)現，其受力與肌動球蛋白收縮和細胞伸長有關，且機械張力主要作用在胞核頂端和赤道面，這也為LINC復合體通過感知肌球蛋白依賴性張力來改變胞核形狀提供了佐證［24］。GUILLUY等［25］用磁性鑷子對Nesprin1施加力會觸發(fā)核硬化，這一過程不涉及染色質或核肌動蛋白，但需要核纖層以及位于內核膜上的Emerin。機械力刺激Nesprin1 可誘發(fā)Emerin 的Tyr磷酸化，改變其與Lamin 的結合，從而導致細胞核硬化。Nesprin1 被沉默時，HUVEC 細胞無法對周期應變作出響應而重新定向，胞核高度、粘著斑數量明顯增加，但細胞遷移速率降低［26］。此外，Nesprin1 敲低會使細胞核結合肌動蛋白絲的張力降低［27］。LINC復合體可以耦合細胞核和微管，促進神經發(fā)生及神經元遷移。對遷移細胞的Nesprin2G、SUN2 進行抑制，細胞核移動、中心體重新定向會明顯受阻［5］。此外，在NIH3T3 細胞為遷移而進行中心體定向時，Nesprin2G與SUN2可以組成一種新型核膜蛋白線性陣列，被稱為跨膜肌動蛋白相關核（TAN）線［28］，TAN線能將細胞核與移動的肌動蛋白束耦合，使胞核定位在細胞后方，中心體定位在細胞核與細胞前緣之間。

3.2 調控減數分裂和DNA 損傷修復 LINC 復合體通過與相關肌動蛋白連接，可以影響減數分裂期染色體功能，調控基因組結構，并在染色體重組過程中發(fā)揮重要作用。減數分裂Ⅰ期的染色體配對過程依賴于同源染色體間的物理交叉，在此期間DNA 雙鏈斷裂（DSB）、同源染色體配對聯(lián)會、同源重組以實現高保真的DSB 修復。減數分裂Ⅰ期開始時，核膜上LINC 復合體與端粒結合將染色體連接到細胞骨架［29］，減數分裂特異性蛋白KASH 5與dynein相互作用介導端粒定位，隨后端粒引導染色體運動使染色體在細胞骨架力的推動下聚集在靠近中心體的細胞核極點，最終形成減數分裂花束。在DNA 損傷反應過程中也有LINC 復合體參與［30］，SUN1/2受損時，會導致細胞DNA 損傷過度、基因組不穩(wěn)定性增加、DNA 修復受損。人SUN1 蛋白及其同源物UNC-84可與Ku 70/Ku 80 和DNA 依賴性蛋白激酶DNA-PK相互作用，抑制非同源末端連接（NHEJ）并促進RAD 51到達DSB位點，進行同源重組修復［31］。研究者認為，LINC 復合體在DNA 修復中發(fā)揮保守作用，主要是通過抑制NHEJ 和促進染色體斷裂位點的同源重組來實現的。此外，還有研究［32］顯示在酵母和哺乳動物細胞中，DSB 位點周圍染色質的流動性增加，這與DNA 損傷反應因子53BP1、SUN1/2、LINC復合體和動態(tài)微管的調控有關。

3.3 調控基因的轉錄與表達 LINC 復合體傳遞機械刺激調控基因轉錄與表達的方式主要有以下三種：第一，機械刺激通過LINC 復合體的物理連接將力傳遞到基因組。研究［33］顯示，機械力通過肌動球蛋白和LINC復合體傳導到染色質，通過核纖層—染色質相互作用誘導染色質拉伸并上調轉錄，且施力方向和應力幅度也會影響染色質流動性和基因表達。第二，LINC 復合體介導的機械力傳遞引起核膜成分或生化信號改變。在上皮祖細胞中，LINC 復合體傳導機械力引起的核膜變化可以抵消持續(xù)拉伸引起的轉錄上調［34］。在持續(xù)拉伸過程中，內核膜上的Emerin 重新定位到外核膜并與非肌肉肌球蛋白ⅡA作用促進細胞質肌動蛋白聚合，導致核肌動蛋白水平降低，由于核G-肌動蛋白可以與RNA 聚合酶Ⅱ結合以增強轉錄，所以核肌動蛋白水平降低會使細胞轉錄受抑制［35］。對RhoA/SRF/Mkl1 信號通路，SUN蛋白可通過向RhoA 發(fā)出信號來調節(jié)Mkl1 的激活，但SUN1 與SUN2 在此過程中的作用并不一致。第三，LINC 復合體通過調控microRNA 的合成調節(jié)基因表達。研究［6］發(fā)現，SUN1 主要亞型的核質結構域可以充當輔助因子啟動特定細胞類型中microRNA的生物發(fā)生。

綜上所述，細胞對機械刺激的反應與應答是一個復雜的多層次過程，細胞感受機械信號并將其從細胞質傳遞到細胞核，通過引起自身結構和功能改變以適應生存環(huán)境的變化。LINC 復合體是機械信號從細胞質骨架傳遞到細胞核骨架的橋梁，它可以通過多種途徑直接或間接地調控細胞結構與功能，在細胞生物力學響應中發(fā)揮重要作用。近期研究提示，模擬微重力對細胞胞核形狀、基因轉錄與表達的影響可能與LINC復合體的調控有關。一直以來，在空間生物學研究領域，細胞對重力變化如何感知、如何響應始終備受關注，針對該問題，以跨核膜LINC復合體為切入點，圍繞它在胞質—胞核機械信號傳導中的作用和具體機制繼續(xù)深入探究，有可能獲得更多新發(fā)現，也有望為開展失重生物學效應及防護措施研究提供新思路。