一株根際解磷菌的篩選鑒定及溶磷促生作用

王 君，范延輝，尚 帥，李學(xué)平，張玉苗，吳 濤，許驥坤

（濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東省黃河三角洲脆弱生態(tài)帶工程技術(shù)研究中心，山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600）

磷是植物體內(nèi)有機(jī)化合物的重要組成成分，是限制植物生長(zhǎng)且不可代替的第二大營(yíng)養(yǎng)元素。土壤中的總磷含量為0.04%～0.10%（w/w），其中只有極少量的可溶性磷（）能被植物利用［1-2］。磷的缺乏是影響作物產(chǎn)量和分布的一個(gè)重要因素［3］。施加磷肥是提高土壤磷素供給最為有效的途徑。然而，由于土壤中金屬離子的固定作用，施入土壤的磷有70%以上與Ca2+、Al3+、Fe3+、Fe2+等離子結(jié)合轉(zhuǎn)化為難溶磷，難以被植物吸收利用［4］。我國(guó)是人口大國(guó)，為了保障糧食安全，通常會(huì)過(guò)量施加磷肥以提高作物產(chǎn)量，導(dǎo)致磷礦資源的消費(fèi)量逐年提高。按現(xiàn)有的年消費(fèi)量，我國(guó)磷礦的使用年限不足20年［5］。另外，土壤中大量未充分利用的磷素很容易流失到環(huán)境中，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問(wèn)題。提高土壤磷素利用率，減少磷肥使用量，不僅是持續(xù)高產(chǎn)的需要，也是節(jié)約磷資源、減少環(huán)境污染的迫切需求［6］。

解磷或溶磷微生物能夠?qū)⒅参镫y以利用的磷轉(zhuǎn)化或活化為有效態(tài)磷［7-8］。自1903年Stalstrom［9］從土壤中成功分離到解磷細(xì)菌以來(lái)，世界各國(guó)相繼開(kāi)展了相關(guān)研究［10-11］，其中很多菌株在活化土壤中難溶性磷、提高作物產(chǎn)量方面效果顯著［12-16］，有的已經(jīng)商品化生產(chǎn)［17］。溶磷微生物主要通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸、質(zhì)子和酶類來(lái)活化難溶磷。篩選高效解磷菌株，進(jìn)而研制生物肥料制劑已經(jīng)成為一種高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的活化土壤磷素的生物措施。

黃河三角洲是我國(guó)三大三角洲之一，總面積達(dá)5.4×105hm2，其中70%以上為鹽堿地，并且仍在以每年1.3×105hm2的速度增加［18］。對(duì)該地區(qū)的低產(chǎn)鹽堿農(nóng)田進(jìn)行改良和培肥增效，對(duì)于緩解我國(guó)耕地緊缺、保障農(nóng)產(chǎn)品的有效供給具有重要意義。雖然已有很多的溶磷微生物被篩選和鑒定，但它們大多分離自非鹽堿化環(huán)境，難以在鹽堿化土壤中定殖進(jìn)而發(fā)揮其解磷作用［19］。近年來(lái)，耐鹽溶磷微生物的研究受到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高度重視［20］。研究表明，鹽堿化土壤是分離耐鹽解磷菌的主要來(lái)源，從中分離出的解磷菌對(duì)該生境下難溶磷的轉(zhuǎn)化有更好的應(yīng)用潛力［4，21］。本研究從黃河三角洲地區(qū)農(nóng)作物根際采集土樣，旨在從中篩選出耐鹽解磷菌，并對(duì)菌株的解磷能力和對(duì)鹽堿化土壤有效磷含量提高情況進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)適用于黃河三角洲地區(qū)鹽堿化土壤的生物肥料提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土壤來(lái)源

從黃河三角洲地區(qū)鹽堿農(nóng)田采集玉米、小麥、苜蓿、棉花、花生根際土壤樣品 30份。采樣時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)健壯的植株收集根際土，將植株的根小心挖出，抖去和根系結(jié)合松散的土壤，留下與根系結(jié)合緊密的土壤作為根際土。將采集的根際土壤裝入無(wú)菌袋中，在冷藏條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4℃冰箱保藏。

1.2 培養(yǎng)基和磷源

無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，酵母提取物0.5 g，MnSO4·H2O 0.001 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂 18 g，pH 7.0～7.5，115 ℃ 滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0，瓊脂 18 g，121℃滅菌30 min。

供試磷源：AlPO4由生工生物工程有限公司提供，F(xiàn)ePO4由生工生物工程有限公司提供，磷礦粉由泰州市長(zhǎng)浦化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 溶磷菌的分離初篩

取新鮮根際土樣1 g，用0.85%的生理鹽水進(jìn)行系列梯度稀釋，然后分別吸取10-4、10-5、10-63個(gè)梯度的土壤懸液200 μL涂布至PVK平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，挑選出有溶磷圈的菌落，在LB平板上反復(fù)劃線純化并編號(hào)后于4 ℃保藏。

1.4 溶磷菌溶磷能力測(cè)定

1.4.1 基于平板法的菌株溶磷效果測(cè)定

將初篩獲得的解磷菌經(jīng)LB培養(yǎng)活化后，用接種環(huán)涂布于含Ca3（PO4）2的PVK平板中央，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，測(cè)定溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），以D/d值來(lái)初步確定菌株的溶磷能力，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 基于鉬銻抗比色法的菌株溶磷效果測(cè)定

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取磷酸二氫鉀配置成100 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置于棕色試劑瓶中備用。測(cè)定前吸取5 mL磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容制成5 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取0、1、2、3、4、5、6 mL磷標(biāo)準(zhǔn)使用液于7個(gè)50 mL的容量瓶中，加蒸餾水至15～20 mL左右，再加入1滴2，4-二硝基酚指示劑，然后逐滴加入硫酸溶液調(diào)至溶液近無(wú)色，加入0.75 mL抗壞血酸溶液，混勻，30 s后加5 mL鉬酸鹽溶液，用水定容至50 mL，混勻。室溫下放置30 min后用10 nm比色皿在700 nm波長(zhǎng)下比色，以去離子水為參比，分別測(cè)量吸光度。以試劑空白校正吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的磷濃度為橫坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。此標(biāo)準(zhǔn)系列中磷濃度依次為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/L。

從保藏斜面上刮取1環(huán)菌苔于LB液體中培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)24 h后作為種子液，按1% （v/v）的比例，將種子液接種于裝有50 mL PVK液體培養(yǎng)基的錐形瓶（150 mL）中，對(duì)照組接入等體積滅菌后的種子液，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，然后將培養(yǎng)液于8000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定pH值及有效磷含量。

1.5 菌株B19的微生物學(xué)鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性

在LB固體培養(yǎng)基上劃線接種，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌株的生長(zhǎng)情況及菌落特征；挑取單菌落置于潔凈玻片上，革蘭氏染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及染色情況。生理生化特性參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［22］進(jìn)行。

1.5.2 基于l6S rDNA基因序列測(cè)定的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用細(xì)菌總DNA提取試劑提取菌株基因組DNA。用 細(xì) 菌l6S rDNA通 用 引 物（27f：5’-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3’和1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Bio-RAD凝膠成像儀成像觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，PCR產(chǎn)物測(cè)序后用BLAST進(jìn)行相似性搜索和同源性比對(duì)，采用Clustal X2.0進(jìn)行序列比對(duì)分析，得到序列之間的相似值，通過(guò)MEGA 6.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析。

1.6 菌株B19的耐鹽性

配置不同鹽濃度（0%、2%、4%、6%、8%）的LB液體培養(yǎng)基，接種量為1%，30 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣，于660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.7 菌株B19對(duì)難溶性磷酸鹽的溶磷能力

將PVK中的Ca3（PO4）2分別換成AlPO4、FePO4和磷礦粉（加入量均為5 g/L），以考察菌株B19對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解能力，按照1.4.2中的方法進(jìn)行培養(yǎng)和溶磷能力測(cè)定。

1.8 B19菌對(duì)土壤中有效磷含量作用效果研究

試驗(yàn)用土為中度鹽堿化土壤，取自黃河三角洲沾化地區(qū)，土壤取自耕層（0～20 cm），基本性質(zhì)見(jiàn)表1，土壤經(jīng)室溫晾干過(guò)2 mm篩并于121℃滅菌30 min后備用。

表1 供試的土壤化學(xué)性質(zhì)

土壤培養(yǎng)試驗(yàn)參照Chen等［23］的方法進(jìn)行：將菌株B19在LB液體培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)12 h，10000 r/min離心10 min收集菌體，菌體沉淀用無(wú)菌水洗滌2遍后，用無(wú)菌蒸餾水重懸，制成107CFU/mL的菌懸液備用。試驗(yàn)在塑料盆（15 cm×14 cm×11 cm）中進(jìn)行，每盆裝土壤3 kg，加入B19菌液（濃度為107CFU/mL）300 mL，充分混勻。對(duì)照組加入300 mL的無(wú)菌水。試驗(yàn)在25℃下進(jìn)行，試驗(yàn)期間定期補(bǔ)加無(wú)菌水，使土壤濕度保持在30%左右，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。每隔5 d取土樣，風(fēng)干后過(guò)2 mm篩，加入碳酸氫鈉提取劑，振蕩，過(guò)濾，吸取5.00～10.00 mL濾液，加入鉬銻抗顯色劑，輕輕搖動(dòng)排出CO2后加水定容至50 mL，室溫下放置30 min后在880 nm波長(zhǎng)下比色，計(jì)算出土樣中有效磷的含量。

1.9 小麥盆栽試驗(yàn)

為了研究解磷菌對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行小麥盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，供試鹽堿土壤同1.8。將菌株B19在LB液體培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)12 h，10000 r/min離心10 min收集菌體，菌體沉淀用無(wú)菌水洗滌2遍后，用無(wú)菌蒸餾水重懸，制成107CFU/mL的菌懸液備用。試驗(yàn)在塑料盆（15 cm×14 cm×11 cm）中進(jìn)行，每盆裝經(jīng)2 mm過(guò)篩的供試土壤3 kg，基肥（氮、磷、鉀）施加量參照楊玉敏等［24］的報(bào)道進(jìn)行，N、P2O5、K2O施用量分別為0.20、0.15、0.15 g/kg，分別為分析純的尿素、磷酸鈣和氯化鉀。按表2設(shè)計(jì)要求將基肥和B19菌液加入土壤，充分混勻后，裝入塑料盆加水至田間持水量的60%。挑取飽滿的小麥種子（濟(jì)麥22），用5%的NaClO消毒5 min，無(wú)菌水沖洗并浸泡8 h，然后用潮紗布包好靜置一晚后播種，每盆15粒，每個(gè)處理10盆。試驗(yàn)期間重量法補(bǔ)水，保持土壤含水量為田間持水量的60%左右。培養(yǎng)30 d后，從各處理中隨機(jī)抽取25株幼苗，洗凈吸干水分測(cè)定幼苗株高、根系長(zhǎng)度和整株鮮重和根鮮重。

表2 盆栽試驗(yàn)施肥方案

2 結(jié)果與分析

2.1 根際溶磷菌的篩選

采用透明圈法從根際土樣中篩選到溶磷細(xì)菌27株，它們?cè)诤辛姿徕}的培養(yǎng)基上的D/d值范圍在1.06 ～ 3.18之間（圖1），菌株B19的溶磷圈見(jiàn)圖2。通過(guò)鉬銻抗比色法測(cè)定液體培養(yǎng)過(guò)程中的有效磷含量。根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定結(jié)果繪制溶磷曲線圖，獲得y = 0.4407x - 0.0175（R=0.9651）的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。在此基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵液的有效磷含量進(jìn)行測(cè)定。27株溶磷菌液體培養(yǎng)時(shí)有效磷含量在30.4 ～ 230.2 mg/L之間。其中菌株B19（分離自小麥根際）和B22（分離自玉米根際）對(duì)磷酸鈣的溶解能力最強(qiáng)，分別達(dá)到230.2和225.0 mg/L。B19經(jīng)多次傳代后溶磷水平穩(wěn)定，且生長(zhǎng)繁殖速度更快，故做進(jìn)一步研究。

圖1 各菌株的溶磷能力

圖2 菌株B19在PVK固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶磷圈

菌株B19在PVK無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液的pH值快速下降，第1 d測(cè)到的pH值最低，為3.71，之后略有回升并穩(wěn)定在4.25左右。培養(yǎng)液中有效磷磷含量在第3 d最高，達(dá)230.2 mg/L。對(duì)照組中的pH值和有效磷含量一直維持在初始水平（圖3）。

圖3 菌株B19液體培養(yǎng)時(shí)有效磷含量和pH值的變化

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

菌株B19為革蘭氏陰性，細(xì)胞呈短桿狀，無(wú)芽孢，在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落呈淡黃色，表面濕潤(rùn)，呈圓形，邊緣整齊，易挑取。

2.2.2 生理生化特性

菌株主要生理生化特性見(jiàn)表3，根據(jù)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［22］可初步判斷該菌屬于泛菌屬（Pantoeasp.）。

表3 菌株B19的生理生化特性

2.3 l6S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增后菌株B19的16S rDNA序列全長(zhǎng)為1476 bp，將該序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)為KJ957935）進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖4所示。BLAST分析結(jié)果顯示該序列與泛菌屬（Pantoeaspp.）的16S rDNA序列具有很高的同源性，其中與菌 株P(guān)antoeasp.strain CP4D7-04（MK534079.1）、Pantoea cypripediistrain DSM 3873（NR_041973.1）、Pantoeasp.strain CP4V2-03（MK534086.1）、Pectobacterium cypripediistrain B1（JF430157.1）的16S rDNA序列相似性均為99%，綜合形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性，鑒定菌株B19為杓蘭泛菌，即Pantoea cypripediiB19。

圖4 基于菌株B19 l6S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 菌株B19的耐鹽性

耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，菌株B19具有較強(qiáng)的耐鹽性，在0%～4%的NaCl范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好。當(dāng)NaCl濃度為6%時(shí)，OD660值增加不明顯，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)受到了強(qiáng)烈抑制；NaCl濃度為8%時(shí)OD660沒(méi)有增長(zhǎng)，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)受到了完全抑制（圖6）。

圖5 不同處理下小麥幼苗的生長(zhǎng)

2.5 菌株B19對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解能力

在AlPO4、FePO4、磷礦粉為磷源的PVK液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)得的有效磷含量分別為72.1、153.2、28.5 mg/L（表4）。

圖6 B19在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)情況

表4 B19對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解能力 （mg/L）

2.6 菌株B19在土壤中的溶磷能力

為了確定菌株B19在鹽堿化環(huán)境中的應(yīng)用潛力，對(duì)B19進(jìn)行了鹽堿化土壤溶磷效果的研究。土壤有效磷含量測(cè)定結(jié)果表明，在30 d的測(cè)定期內(nèi)，與CK相比，施加B19后土壤有效磷含量均有不同程度地提高。第10 d土壤有效磷含量最高，由27.88 mg/kg增至37.98 mg/kg，比未接菌的對(duì)照組增加了36.2%（圖7）。

圖7 菌株B19對(duì)鹽堿土壤中有效磷的影響

2.7 溶磷菌對(duì)盆栽小麥生長(zhǎng)的影響

小麥盆栽試驗(yàn)結(jié)果如圖5和表5所示。施加B19溶磷菌的小麥幼苗在生長(zhǎng)至第30 d時(shí)，其株高、根長(zhǎng)、株鮮重和根鮮重均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），株高增加了6.95 cm，提高了61.34%；根長(zhǎng)增加了2.66 cm，提高了38.27%；株鮮重增加了0.043 g，提高了29.45%；根鮮重增加了0.022 g，提高了84.62%。以上結(jié)果說(shuō)明菌株B19對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)作用。

表5 不同處理下小麥的生長(zhǎng)情況

3 討論

3.1 溶磷菌B19的分離鑒定

土壤鹽堿化會(huì)引起土壤板結(jié)、肥力下降，是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)的主要障礙因素之一。受氣候、水文地質(zhì)條件、海水入侵等因素的影響，黃河三角洲地區(qū)鹽漬化程度十分嚴(yán)重，有些區(qū)域鹽度含量高達(dá)3%，pH值超過(guò)10，較高的鹽度和pH值使得一般的溶磷菌很難存活和定殖。國(guó)內(nèi)外已有少量耐鹽溶磷菌的研究報(bào)道，主要包括青霉菌、木霉菌和疣孢藍(lán)狀菌等真菌［4，25-26］，有關(guān)溶磷細(xì)菌及其在鹽堿地肥力提升方面的研究卻鮮有報(bào)道［27］。根際是受根系分泌物影響的土壤狹窄區(qū)域，富集于根際的微生物群落復(fù)雜多樣，有“植物的第二基因組”之稱，與植物的生長(zhǎng)和健康密切相關(guān)，近年來(lái)報(bào)道的溶磷菌多數(shù)分離自植物根際［11］。本研究從黃河三角洲鹽堿化根際土壤中篩選獲得27株溶磷細(xì)菌，其中菌株B19分離自小麥根際，經(jīng)鑒定為杓蘭泛菌（Pantoea cypripedii）。

3.2 Pantoea cypripedii B19的溶磷特性

受土壤母質(zhì)和成土過(guò)程的影響［28］，黃河三角洲地區(qū)鹽堿化土壤中的磷素主要以無(wú)機(jī)磷形態(tài)存在，占全磷含量的比例為55.95%～76.35%［29］，其中Ca-P是主要成分［30］。故本試驗(yàn)中選取Ca3（PO4）2為難溶性磷源，通過(guò)固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)法對(duì)溶磷菌進(jìn)行了篩選。透明圈法是初篩溶磷菌的通用方法，從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，D/d值的大小基本上反映了菌株的溶磷能力；從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，D/d值大的菌株，其在液體培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出高的有效磷含量；總體來(lái)看，D/d值越大，有效磷含量越高。值得注意的是，菌株F6、F14和F17在固體培養(yǎng)時(shí)D/d值不高（分別為1.89、1.99和1.90），但在液體培養(yǎng)時(shí)卻顯示出很高的溶磷能力（分別為187、207和213 mg/L），這說(shuō)明培養(yǎng)條件對(duì)菌株的溶磷能力有很大的影響，相較于固體培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)條件下更利于它們的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而活化難溶性磷。另外，菌株B19的D/d值為3.17，僅次于菌株F22（3.18），但其在液體培養(yǎng)時(shí)的溶磷能力稍高一些（菌株B19為230.2 mg/L，菌株F22為225.0 mg/L），而且菌株B19有更好的遺傳穩(wěn)定性，因此選定其進(jìn)行深入研究。雖然透明圈是通用的溶磷菌初篩方法，但很多溶磷菌并不產(chǎn)溶磷圈。葉勁松等［31］獲得了一株解磷菌，其在PVK固體平板不產(chǎn)透明圈，但在搖瓶培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出很強(qiáng)的溶磷能力，說(shuō)明采用不同方法篩選和確定溶磷菌的必要性。

已報(bào)道的解磷細(xì)菌數(shù)量眾多，主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、固氮菌屬（Azotobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、假單胞菌屬（pseudomonas）等類群［11］。研究發(fā)現(xiàn)，不同的菌株之間溶磷能力相差很大，迄今報(bào)道的溶磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌為節(jié)桿菌Arthrobactersp.CCBC03，其搖瓶培養(yǎng)3 d時(shí)有效磷含量達(dá)519.7 mg/L，而分離自同一土樣的戈登氏菌Gordoniasp.CCBC07對(duì)Ca3（PO4）2的 溶 解 量 僅 為31.5 mg/L［32］。需要指出的是，培養(yǎng)基對(duì)菌株的溶磷能力有很大影響，有研究表明，當(dāng)將PVK培養(yǎng)基換成NBRIP培養(yǎng)基時(shí)，溶磷菌的溶磷能力可以提高3倍左右［33］。

泛菌（Pantoeasp.）在自然界分布廣泛，其中在水、土壤及植物的種子中最為常見(jiàn)［34］。近年來(lái)研究報(bào)道有多株泛菌顯示出很強(qiáng)的溶磷能力。Kaur等［35］從甜葉菊（Stevia rebaudiana）根際土壤中分離到1株溶磷菌Pantoea cypripediiPSB-3，對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力為253 mg/L。田間試驗(yàn)表明，接種PSB-3后，土壤肥力（有機(jī)碳、有效磷、總磷和酶活）和作物生長(zhǎng)情況（產(chǎn)量和磷吸收）都有了顯著提升。Singh等［36］從鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）根際土壤中分離到一株溶磷菌Pantoea cypripediiPS1，其對(duì)Ca3（PO4）2的溶解能力約為160 mg/L，接種后可顯著促進(jìn)鷹嘴豆的生長(zhǎng)。本研究篩選到的杓蘭泛菌Pantoea cypripediiB19的溶磷能力為230 mg/L，在已發(fā)現(xiàn)的解磷菌中居中等水平。另外，菌株B19對(duì)多種其他難溶性磷酸（AlPO4、FePO4、磷礦粉）也顯示出了較強(qiáng)的溶解能力，增加了其實(shí)際應(yīng)用的廣泛性。

除了菌株自身的遺傳特性之外，環(huán)境因素，特別是脅迫因子也嚴(yán)重制約著微生物的溶磷能力［37-38］。已報(bào)道的溶磷菌多數(shù)分離自非鹽堿化環(huán)境，高鹽濃度往往導(dǎo)致溶磷能力的急劇下降［39］，不能滿足鹽堿環(huán)境下的需要。相較于普通環(huán)境，分離自高鹽環(huán)境下的微生物在高鹽環(huán)境仍能保持溶磷能力。Srinivasan等［40］從鹽漬化土壤中分離到13株耐鹽解磷細(xì)菌，其中Aerococcussp.PSBCRG1-1在4.7%NaCl濃度時(shí)溶磷量最高，在11.7% NaCl濃度時(shí)仍具有很高的溶磷水平。Zhu等［37］從鹽池沉積物中分離到一株嗜鹽菌Kushneriasp.YCWA18，可以耐受20%的NaCl濃度，在6%的NaCl濃度下生長(zhǎng)最快，在最適生長(zhǎng)條件下11 d的溶磷量為283.16 μg/mL。本研究Pantoea cypripediiB19最高可耐受6%的NaCl濃度，屬中度耐鹽菌。當(dāng)NaCl濃度高于6%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)速率變慢。原因可能是高鹽條件下，微生物需要消耗能量來(lái)抵御鹽脅迫，用于自身生長(zhǎng)代謝的能量變少，導(dǎo)致代時(shí)變長(zhǎng)，細(xì)胞增長(zhǎng)速率變慢［41］。B19在0%～4%的NaCl濃度范圍都有較強(qiáng)的溶磷能力，從耐鹽性方面來(lái)看，可以滿足不同鹽堿化環(huán)境。

3.3 Pantoea cypripedii B19對(duì)鹽堿化土壤磷素的活化作用

菌株B19在實(shí)驗(yàn)室條件下（固體平板、液體培養(yǎng)）表現(xiàn)出了較強(qiáng)的溶磷能力，但其在土壤中的溶磷效果還有待驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示，施加Pantoea cypripediiB19后，土壤中有效磷含量有了明顯提升，在試驗(yàn)初期溶磷上升比較快，第10 d土壤有效磷含量最高，比對(duì)照組提高了36.2%。Chen等［23］從木薯根系分離到一株內(nèi)生解磷菌Pantoea dispersaCav.cy1，可使土壤（紅土，pH值=5.89）有效磷含量增加228.73%。本研究中B19對(duì)土壤磷素的活化水平不是很高，這可能與鹽堿土的理化性質(zhì)有關(guān)，鹽堿土壤中含有較高的Ca2+、Al3+［30］，對(duì)磷有極強(qiáng)的固定作用。孫軍娜等［28］研究了黃河三角洲新生濕地由河向海過(guò)渡帶表層土壤磷形態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)在低濃度磷源條件下，隨著初始磷濃度的升高，土壤對(duì)磷的吸附量增加，吸附率在70%～99%之間。李壽田等［42］發(fā)現(xiàn)，即使施加高濃度的外源磷（2.97 g/kg），堿性鈣質(zhì)土對(duì)磷的固定率仍高達(dá)85.14%。

由于實(shí)驗(yàn)室條件與自然環(huán)境存在巨大差異，很多在實(shí)驗(yàn)室條件下表現(xiàn)高效的溶磷菌，在小區(qū)和大田試驗(yàn)中效果并不理想［43-44］。下一步我們將開(kāi)展田間試驗(yàn)，進(jìn)一步研究Pantoea cypripediiB19的溶磷和促生效果，為鹽堿地生物肥料的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

從黃河三角洲地區(qū)鹽堿農(nóng)田采集根際土壤30份，從中篩選獲得27株溶磷細(xì)菌。對(duì)遺傳性狀更加穩(wěn)定的B19菌株做了進(jìn)一步研究。菌株B19的16S rDNA序列全長(zhǎng)為1476 bp，與Pectobacterium cypripediistrain B1（JF430157.1）位于同一分支，序列相似性為99%。綜合形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性，確定菌株B19為杓蘭泛菌（Pantoea cypripedii）。

菌株P(guān)antoea cypripediiB19在0%～4%的NaCl濃度下生長(zhǎng)良好，最高可耐受6%的NaCl濃度，對(duì)多種難溶性磷源都有較強(qiáng)的溶解能力?？疾炝司闎19對(duì)鹽堿化土壤磷素的活化情況，施加Pantoea cypripediiB19菌后，土壤中有效磷含量有了明顯提升，第10 d土壤有效磷含量最高，比對(duì)照組提高了36.2%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株B19對(duì)小麥植株促生效果顯著，小麥幼苗平均根長(zhǎng)較對(duì)照增加了38.27%，平均株高較對(duì)照增加了61.34%，說(shuō)明溶磷菌B19在改善鹽堿化土壤肥力方面具有很好的應(yīng)用潛力。