青藤堿基于CASC11/AKT3軸對腦膠質瘤原位荷瘤裸鼠腫瘤生長及血管生成的抑制作用▲

祁大勇 劉 軍 趙志煌 李 剛 韓永剛

(1 河北省唐山市工人醫(yī)院神經外科，河北省唐山市 063000； 2 河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經外科，河北省邯鄲市 056000； 3 河北省滄州市中心醫(yī)院神經外科，河北省滄州市 061000)

腦膠質瘤是臨床常見的顱內原發(fā)性腫瘤，其在顱內惡性腫瘤中的占比超過80%，年發(fā)病率約為0.06‰，且隨年齡的增長發(fā)病率逐漸升高，具有惡性程度高、易復發(fā)、預后差等特征[1]。近年來，隨著手術切除方案及放化療方案的不斷優(yōu)化，腦膠質瘤患者的預后有所改善；但血腦屏障會限制化療藥物的效果，加之腦膠質瘤的侵襲性高，患者的臨床治療效果受到明顯影響，其中高度惡性腦膠質瘤患者的中位生存期仍不到15個月[2]。青藤堿是中藥青風藤的主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、降壓、增強胃腸道興奮性、抗炎等藥理作用[3]。有研究表明，青藤堿可抑制視網膜母細胞瘤細胞的增殖，并促進腫瘤細胞的凋亡，具有抗腫瘤活性[4]。然而，目前關于將青藤堿用于腦膠質瘤治療的研究尚少，且缺乏對應的機制研究。本研究通過建立腦膠質瘤原位荷瘤小鼠模型，研究青藤堿對腦膠質瘤血管生成的抑制作用，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞株 無特定病原體級BALB/c裸鼠45只，雄性，6周齡，體重(19±2)g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司[生產許可SCXK(滬)2017-0010]。大鼠購入后飼養(yǎng)于清潔、通風環(huán)境，溫度為(23±2) ℃，濕度為(60±5)%，明暗周期12 h/12 h循環(huán)。人腦星形膠質母細胞瘤U87-MG細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 青藤堿(純度>98%)購自上海禾午生物科技有限公司(批號：6080-33-7)。LipofectamineTM3000試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：L3000001)，腫瘤易感候選基因11(cancer susceptibility candidate 11,CASC11) mimics質粒購自上海銳賽生物技術有限公司，TRIzol試劑購自上海聯邁生物工程有限公司(批號：LM-0010)，反轉錄試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司(批號：R2043)，實時熒光定量PCR SYBR Ⅱ試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司(批號：QPG-020)，免疫組織化學染色試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司(批號：E670033-0100)，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司(批號：23225)，辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢艾美捷科技有限公司(批號：A21010)， GAPDH、兔抗小鼠CD31、絲氨酸/蘇氨酸激酶3(serine/threonine kinase 3，AKT3)一抗購自美國Abcam公司(批號：Ab9485、ab28364、ab32505)。StepOnePulsTM實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，BX41顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社，Gel Doc EZ凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染 將人腦星形膠質母細胞瘤U87-MG細胞置于含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗的DMEM中，37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，待細胞融合至貼壁，胰酶消化傳代培養(yǎng)。取對數生長期細胞，使用PBS進行洗滌2次，調整細胞密度為1×106個/mL，接種至6孔板，2 mL/孔，待細胞融合至貼壁，按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作，將CASC11過表達質粒CASC11 mimics轉染至U87-MG細胞，6 h后更換為不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。另取U87-MG細胞按照上述步驟進行培養(yǎng)，但不進行轉染。

1.4 實時熒光定量PCR檢測轉染后細胞中CASC11 mRNA的表達情況 取未轉染和轉染48 h后的U87-MG細胞，使用PBS洗滌后，采用TRIzol法提取細胞總RNA，隨后反轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參檢測CASC11 mRNA的表達水平。配制反應體系：雙倍核酸染料10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA 2 μL，雙蒸水補足至總體積為20 μL。擴增條件：94 ℃預變性40 s；95 ℃變性8 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，重復40個循環(huán)。實驗所用引物：CASC11上游引物為5′-GCTGCAGAAGGTCCGAAGAA-3′，下游引物為5′-TTCACCACGTCCAGTTGCTT-3′；GAPDH上引物游為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用2-△△Ct法計算各待測基因的相對表達量。設置5個復孔，實驗重復3次，取均值。

1.5 建立腦膠質瘤原位荷瘤裸鼠模型 參考文獻[5]進行建模。取全部BALB/c裸鼠，采用隨機數字表法選取10只設為空白組，右腋皮下注射生理鹽水0.1 mL。其余35只建立腦膠質瘤原位荷瘤模型，隨機選取25只裸鼠，給予右腋皮下注射未轉染的U87-MG細胞懸液0.1 mL(細胞密度為1×108個/mL)，以瘤體積100 mm3左右為建模成功標準，建模成功20只，剔除不合格裸鼠5只，再采用隨機數字表法將這20只裸鼠分為腦膠質瘤組、青藤堿組各10只。給予剩余10只裸鼠右腋皮下注射轉染48 h后的U87-MG細胞懸液0.1 mL(細胞密度為1×108個/mL)，設為mimics聯合青藤堿組，均建模成功。

1.6 干預方式 參考文獻[6]進行干預。建模后7 d，給予青藤堿組、mimics聯合青藤堿組裸鼠腹腔注射青藤堿生理鹽水溶液(經生理鹽水稀釋后濃度為1.2 mg/mL)20 mg/kg，空白組、腦膠質瘤組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，持續(xù)14 d。

1.7 組織取材及抑瘤率和脾臟指數的測定 干預結束后次日，稱取裸鼠重量，通過腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉裸鼠后將其脫頸處死，迅速剝離腫瘤塊，稱取其重量，計算抑瘤率，抑瘤率=(腦膠質瘤組腫瘤重量-干預組腫瘤重量)/腦膠質瘤組腫瘤重量×100%。取部分腦膠質瘤組織分成兩份，一份置于預冷的40%中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，使用切片機將其切為厚度4 μm的連續(xù)切片，用于免疫組織化學染色；另一份置于液氮中保存，用于蛋白檢測。開腹分離出脾臟，生理鹽水沖去殘留血液后，用濾紙吸干水分并稱重，計算脾臟指數，脾臟指數=脾臟質量(mg)/體質量(g)。

1.8 免疫組織化學染色法檢測微血管密度 取膠質瘤組織切片，經二甲苯脫蠟、PBS洗滌后，加入3%過氧化氫溶液浸泡10 min，然后加入抗原修復液1 mL，微波抗原修復，冷卻至室溫，蒸餾水漂洗，滴加5%胎牛血清5 mL封閉孵育20 min，棄去血清，加入兔抗人CD31一抗(1 ∶500)2 mL，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌2次，加入二抗(1 ∶2 000)1 mL，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌2次。二氨基聯苯胺顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，常規(guī)脫水，封片劑封片，隨機選取5個不重復視野，以棕黃色單個內皮細胞或細胞群作為一個血管，記錄每個視野的血管數量，計算5個視野的均值，以每個視野平均血管數量表示血管密度。

1.9 Western blot檢測腫瘤組織AKT3蛋白的表達量 取在液氮中保存的膠質瘤組織，用眼科剪剪碎后，于研磨器中研磨，加入RIPA裂解液2 mL，轉移至離心管，4 ℃ 10 000 r/min離心8 min(離心半徑12 cm)，取其上清，采用二喹啉甲酸法測定總蛋白并定量。取50 g待測蛋白，加入5倍體積上樣緩沖液混勻，水浴加熱沸騰5 min，相同條件下離心取上清，恒定電壓下行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕法轉膜，封閉液封閉2 h，混合兔抗小鼠AKT3一抗(1 ∶5 000)、GAPDH一抗(濃度1 ∶500)各1 μL，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，與1 μL二抗(1 ∶2 000)混合，室溫孵育1 h，TBST洗膜，發(fā)光液顯色，暗室曝光，經凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，AKT3蛋白相對表達量=AKT3條帶灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 未轉染和轉染細胞中CASC11 mRNA的表達量的比較 未轉染U87-MG細胞、轉染48 h后U87-MG細胞中CASC11 mRNA的表達量分別為(0.21±0.03)、(0.98±0.12)，轉染24 h后U87-MG細胞的CASC11表達量高于未轉染U87-MG的細胞(t=13.920，P<0.001)，提示轉染成功。

2.2 青藤堿組和mimics聯合青藤堿組抑瘤率的比較 mimics聯合青藤堿組、青藤堿組的抑瘤率分別為(30.29±4.46)%、(52.10±6.87)%，前者低于后者(t=8.420，P<0.001)。

2.3 4組裸鼠脾臟指數的比較 與空白組比較，腦膠質瘤組的脾臟指數降低(P<0.05)；與腦膠質瘤組比較，青藤堿組的脾臟指數升高(P<0.05)；與青藤堿組比較，mimics聯合青藤堿組的脾臟指數降低(P<0.05)。見表1。

2.4 4組裸鼠腫瘤微血管密度的比較 與腦膠質瘤組比較，青藤堿組的微血管密度降低(P<0.05)；與青藤堿組比較，mimics聯合青藤堿組的微血管密度升高(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 4組裸鼠脾臟指數和腫瘤微血管密度的比較(x±s)

圖1 各組荷瘤裸鼠腫瘤微血管生成情況(免疫組織化學染色，×400，標尺25 μm)

2.5 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織AKT3蛋白表達量的比較 與腦膠質瘤組比較，青藤堿組AKT3蛋白的表達量降低(P<0.05)；與青藤堿組比較，mimics聯合青藤堿組AKT3蛋白的表達量升高(P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 Western blot檢測腫瘤組織AKT3蛋白表達量

表2 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織AKT3蛋白的相對表達量(x±s)

3 討 論

腦膠質瘤是起源于神經外胚葉組織的中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤，其深入腦組織呈浸潤性生長，與正常組織無明顯分界點[7]。腦膠質瘤的臨床表現為顱內壓增高、視力下降、頭痛、嘔吐，部分患者出現癲癇癥狀[8]。目前其發(fā)病機制尚未完全闡明，多認為與基因突變、細胞信號通路改變等有關[9]。腦膠質瘤的浸潤生長與內部大量新生血管的生成密切相關，是腦膠質瘤發(fā)展及復發(fā)的主要原因之一，腦膠質瘤細胞可分泌大量血管內皮生長因子，增強血管內皮細胞有絲分裂，加快血管生成[10]。因此，尋找有效抑制腫瘤血管生成的藥物或手段，對于改善患者預后、降低病死率與復發(fā)率具有重要意義。

中醫(yī)認為腦膠質瘤屬于“積癥”“眩暈”“癲狂”范疇，是風、火、痰、瘀、濕多種病理因素共同作用的結果，其主要病機為外感風毒、肝腎不足、正氣虛弱，以致風痰瘀血于腦絡、積毒腦內、腫大成塊終而發(fā)病，故治療上應以祛風扶正為主[11]。中醫(yī)青風藤取自防己科植物青藤的干燥藤莖，性平，味苦、辛，歸肝經、脾經，可除濕、祛風、行氣、利水?！墩憬炷可剿幹仓尽酚涊d，青風藤可治風水腫、腳氣、風濕、關節(jié)疼痛、口眼歪斜，癰腫惡瘡[12]。青藤堿是一種活性生物堿，Ik等[13]在觀察其對慢性哮喘小鼠的治療作用時發(fā)現，青藤堿可抑制血管生成，并調節(jié)Th2相關免疫反應。脾臟是機體重要的外周免疫器官，是免疫應答反應的主要部位，脾臟指數可反映機體的免疫功能狀態(tài)[14]。血小板內皮細胞黏附分子CD31參與腫瘤細胞對內皮細胞的黏附過程，是一種穩(wěn)定性較高的血管內皮細胞標志物，可作為惡性腫瘤免疫組織化學實驗的常規(guī)指標[15]。因此本研究選取脾臟指數和基于CD31標記的微血管密度作為觀察指標。結果顯示，腦膠質瘤組的脾臟指數較空白組降低(P<0.05)，提示膠質瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能降低；而給予青藤堿干預后，膠質瘤原位荷瘤小鼠的抑瘤率為(52.10±6.87)%，且脾臟指數升高、微血管密度降低(均P<0.05)，提示青藤堿可提升腦膠質瘤裸鼠的免疫功能、抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，具有一定的抗腦膠質瘤作用。

CASC11是一種長鏈非編碼RNA，其作為一種致癌基因高表達于多種惡性腫瘤，參與調節(jié)多個細胞通路，在腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，常作為惡性腫瘤的潛在治療靶點及預后評估的標志物[16]。AKT3是AKT家族亞型之一，作為磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的下游效應因子，可被PI3K1活化，活化后的AKT3可磷酸化AKT殘基的底物，間接激活其下游蛋白因子，從而與其共同作用參與腫瘤組織血管生成的調節(jié)[17]。Ma等[18]研究認為，過表達AKT3可促進癌細胞生長，消除G0/G1期的細胞周期停滯，增強其增殖及遷移能力，從而促進結腸癌發(fā)展，提示AKT3可促進惡性腫瘤生長。本研究結果顯示，與青藤堿組比較，mimics聯合青藤堿組的抑瘤率、脾臟指數降低，微血管密度升高，提示過表達CASC11可削弱青藤堿抑制腦膠質瘤血管生成及腫瘤生長、改善免疫功能的作用。此外，青藤堿組AKT3蛋白的表達量低于腦膠質瘤組，而mimics聯合青藤堿組AKT3蛋白的表達量反而高于青藤堿組(P<0.05)。這提示青藤堿可能通過抑制CASC11的表達來下調AKT3蛋白的表達，從而發(fā)揮其抑瘤作用。

綜上所述，青藤堿可提升腦膠質瘤原位荷瘤裸鼠的免疫功能，抑制腫瘤血管生成，其可能通過抑制CASC11表達進而下調AKT3蛋白表達來發(fā)揮作用。然而，本研究存在一定不足，如僅檢測了正常裸鼠的脾臟指數進行比較，未取正常裸鼠腦組織檢測微血管密度及AKT3蛋白表達量，今后將進一步完善實驗設計以驗證所得結論。