亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與脂代謝和肝臟脂肪含量的關(guān)系▲

劉景慧 黃國秀 伍朝春 龐 羽 黃定貴 李發(fā)添

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院健康管理中心，廣西南寧市 530021)

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是蛋氨酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，可催化5，10-亞甲基四氫葉酸形成5-甲基四氫葉酸，從而在同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)向蛋氨酸轉(zhuǎn)化中起重要作用；而MTHFR基因突變后可使MTHFR活性下降，導(dǎo)致血Hcy水平升高，進而促進多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與多種代謝性疾病和血管性疾病相關(guān)[2]。動物實驗表明，MTHFR基因突變與肝脂肪變性和肝損害有關(guān)[3]。本研究選取廣西南寧市壯漢族居民，探討MTHFR基因C677T位點多態(tài)性的特點及其與脂代謝、肝臟脂肪含量[受控衰減參數(shù)(controlled attenuation parameter，CAP)]的相關(guān)性，為本地區(qū)居民代謝性疾病的全面健康管理提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2020年6月至2021年1月在我院進行健康體檢且體檢資料完整的238例體檢者的相關(guān)資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)戶籍所在地為廣西南寧市且長期居住廣西南寧市者，民族為壯族或漢族；(2)體檢資料完整者，包括MTHFR基因分型、肝臟CAP、身高、體重、血壓、Hcy水平等檢測項目。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴重肝腎功能和甲狀腺功能異常、酒精性肝病、病毒性肝炎、惡性腫瘤、免疫性疾病等患者。其中男性156例、女性82例，年齡30～66(47.36±11.36)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料的收集：收集研究對象的性別、年齡、血壓、身高、體重、腰圍、臀圍，計算體質(zhì)指數(shù)。體質(zhì)指數(shù)=體重(kg)/身高2(m2)。

1.2.2 生化指標(biāo)的檢測：抽取研究對象空腹12 h以上的靜脈血6～8 mL，其中2 mL全血用于檢測血沉，檢測方法為魏氏法。剩余的血標(biāo)本以3 500 r/min離心后獲取血清，使用日立7600型全自動生化分析儀檢測Hcy、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、空腹血糖、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、尿酸水平，采用質(zhì)譜法檢測維生素D2、維生素D3水平。

1.2.3 肝臟脂肪含量的檢測：使用法國Echosens公司的FibroScan520型肝功能剪切波量化超聲診斷儀，檢測患者空腹?fàn)顟B(tài)下的CAP水平，以評估肝臟脂肪含量，CAP水平≥238 dB/m提示肝臟脂肪含量≥11%，診斷為脂肪肝。

1.2.4 MTHFR基因型的檢測：采集1.5 mL全血，采用乙二胺四乙酸抗凝后，采用MTHFR基因677C/T檢測試劑盒(PCR-熒光探針法；深圳泰樂德醫(yī)療有限公司；生產(chǎn)批號：20200102、20200605、20200902)提取DNA。(1)提取方法。取25 μL全血樣本放于1.5 mL離心管內(nèi)，加入試劑盒內(nèi)R1沉淀劑150 μL振蕩混勻，室溫放置5 min。將離心管轉(zhuǎn)移至X1B型高速離心機(Thermo Scientific公司)，14 000 r/min離心2 min，棄上清，保留沉淀；加入R2洗液150 μL于上述離心管內(nèi)，振蕩以確保沉淀懸浮，4 ℃下14 000 r/min離心 1 min，棄上清，保留沉淀；加入R3裂解液50 μL，振蕩以確保沉淀脫離管底，65 ℃干浴5 min；加入R4穩(wěn)定劑15 μL振蕩混勻，短暫離心使溶液集中于管底。選取4 μL DNA模板用于實時熒光定量PCR，剩余樣本置于-20 ℃保存。(2)檢測方法。應(yīng)用等位基因特異PCR結(jié)合TaqMan熒光探針檢測法進行基因分型檢測，試劑為MTHFR基因677C/T檢測試劑盒，儀器為LightCycler 480型實時熒光定量PCR儀(Roche Instrument Center AG)。PCR反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，1個循環(huán)；95 ℃ 2 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45個循環(huán)。于60 ℃下收集熒光信號，根據(jù)FAM通道和VIC通道所形成的擴增曲線判斷基因型。

1.3 分組方法 根據(jù)MTHFR基因型檢測結(jié)果對研究對象進行分組，其中攜帶MTHFR基因C677T位點CC基因型者為野生組(n=144)，攜帶CT基因型或TT基因型者為突變組(n=94)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用多因素Logistic回歸模型分析影響MTHFR基因突變的相關(guān)因素。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的MTHFR基因C677T位點多態(tài)性及兩組研究對象的基線資料比較 238例研究對象中，攜帶MTHFR基因C677T位點CC基因型、CT基因型、TT基因型各144例(60.5%)、81例(34.0%)、13例(5.5%)。突變組和野生組研究對象的性別構(gòu)成、年齡、腰圍、臀圍、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓和舒張壓比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組研究對象基線資料的比較

2.2 兩組研究對象相關(guān)指標(biāo)水平的比較 與野生組相比，突變組研究對象的血清Hcy、FINS、三酰甘油水平較高，HDL-C水平較低(均P<0.05)；兩組研究對象的ACE、血沉、空腹血糖、尿酸、LDL-C、維生素D2、維生素D3水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。野生組與突變組的脂肪肝檢出率分別為45.83%和54.26%，其中突變組的檢出率稍高，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組的肝臟CAP值差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象相關(guān)指標(biāo)的比較

組別nHDL-C(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)尿酸(x±s,μmol/L)維生素D2(x±s,nmol/L)維生素D3(x±s,nmol/L)CAP(x±s,dB/m)脂肪肝(n)是/否突變組941.29±0.243.32±0.93376.92±97.572.99±0.9756.78±18.43265.46±45.5851/43野生組1441.47±0.433.37±0.66361.62±99.963.14±1.0859.59±20.55257.10±53.1566/78 t/z/χ2值3.6980.2490.6371.0901.0731.2531.614P值<0.0010.8040.5270.2770.2840.2110.204

2.3 與MTHFR基因突變相關(guān)的因素 以MTHFR基因突變情況作為因變量(野生組=0，突變組=1)，將單因素分析中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的變量(Hcy、HDL-C、FINS、三酰甘油水平)作為自變量(均以實際值納入)，采用多因素Logistic回歸模型進行分析。結(jié)果顯示，Hcy、HDL-C水平為MTHFR基因突變的獨立影響因素(均P<0.05)。見表3。

表3 與MTHFR基因突變相關(guān)的因素分析結(jié)果

3 討 論

目前已發(fā)現(xiàn)MTHFR基因存在多種突變，突變的常見位點有C677T、A1298C、G1793A和T1317C等，以C677T突變最為常見且研究較為深入[2，4]。MTHFR基因C677T位點具有多態(tài)性，存在CC型(野生型)、CT型(雜合變異型)和TT型(純合變異型)3種基因型。不同種族、地域、生活環(huán)境、性別人群的突變特點有所不同。MTHFR基因C677T位點CC、CT和TT基因型分布頻率在歐洲波蘭男性人群中分別為47.0%、43.0%、10.0%，在女性人群中分別為49.0%、42.0%、9.0%[5]；在北京地區(qū)男性人群中分別為23.3%、50.5%、26.2%；在女性人群中分別為22.7%、49.4%、27.9%[6]；在廣西紅水河流域壯族長壽老人中分別為65.5%、29.3%、5.2%[4]。本研究以廣西南寧市壯漢族居民為研究對象，結(jié)果顯示其MTHFR基因C677T位點的突變率較高，其中MTHFR CC基因型頻率為60.5%，MTHFR CT基因型頻率為34.0%，MTHFR TT基因型頻率為5.5%。MTHFR基因C677T位點突變可影響酶的活性，導(dǎo)致MTHFR酶的耐熱性下降，使葉酸代謝障礙，Hcy水平隨之升高，引發(fā)一系列疾病[1]。研究顯示，MTHFR基因C677T位點的多態(tài)性與多種疾病如血管性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)精神性疾病，甚至腫瘤等的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[7-10]。近年來還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點的多態(tài)性或可作為預(yù)測新型冠狀病毒肺炎發(fā)病、病情嚴重程度的生物遺傳標(biāo)志物[11]。因此MTHFR基因C677T位點多態(tài)性對人群健康的影響涉及面較廣，值得進一步研究。

高Hcy水平和血脂異常被認為是心血管疾病發(fā)病的獨立危險因素[1，12]。本研究結(jié)果顯示，與攜帶MTHFR基因C677T位點CC基因型相比，攜帶CT或TT基因型人群的血清Hcy、FINS、三酰甘油水平增高，HDL-C水平降低(均P<0.05)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清Hcy和HDL-C水平與MTHFR基因C677T位點突變相關(guān)(均P<0.05)。國內(nèi)外的研究證實，MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與Hcy、葉酸和血脂水平有交互作用[7，13]。動物實驗[13]表明血Hcy與血脂水平相關(guān)聯(lián)的機制為，當(dāng)Hcy水平升高到210.0 μmol/L時，可降低循環(huán)HDL、載脂蛋白AⅠ和大HDL顆粒的濃度，抑制HDL功能，并促進HDL-C的清除；當(dāng)Hcy水平在0.5～2.0 mmol/L時，小鼠原代肝細胞中載脂蛋白AⅠ 的合成分泌減少。然而，關(guān)于不同病種和不同性別人群中MTHFR基因C677T位點突變與血脂水平的相關(guān)性，目前尚未有統(tǒng)一定論。如在高血壓患者中MTHFR基因C677T 位點多態(tài)性與血脂異常無關(guān)聯(lián)，各基因型攜帶者總膽固醇、三酰甘油、HDL-C及LDL-C水平無明顯差異[8，14]。在廣西紅水河流域的長壽老人中，女性變異型(CT/TT)基因攜帶者的總膽固醇、三酰甘油及LDL水平明顯高于野生型(CC)基因攜帶者；而男性3種基因型間的各血脂水平未見有明顯差異[4]。另外，埃及學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T多態(tài)性增加了具有阿拉伯種族遺傳背景人群的肥胖易感性，可能有助于肥胖的發(fā)展[15]。本研究納入的研究對象為廣西南寧市的壯漢族人群，結(jié)果顯示MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與HDL-C水平有關(guān)，但與體質(zhì)指數(shù)、血壓、血糖、尿酸、三酰甘油、LDL-C等指標(biāo)水平無關(guān)，這可能提示在廣西壯漢族人群中MTHFR基因突變對除HDL-C以外的其他代謝性指標(biāo)異常無易感性。但本研究的樣本量不夠大，可能影響研究結(jié)果的可靠性，今后需擴大樣本量進一步研究驗證。

此外，關(guān)于MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)之間的關(guān)系的研究結(jié)論并不確切。早前我國學(xué)者研究證實了MTHFR基因C677T位點多態(tài)性是NAFLD的遺傳性危險因素[16]。但更多的研究否認了類似關(guān)聯(lián)，認為MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與NAFLD的發(fā)生風(fēng)險無關(guān)[17-18]。本研究亦未發(fā)現(xiàn)野生組及突變組之間的肝臟脂肪含量和脂肪肝檢出率存在差異，而肝臟脂肪含量與NAFLD密切相關(guān)，今后將納入NAFLD人群進行分析，以進一步評估該基因突變與NAFLD的關(guān)系。

綜上所述，MTHFR基因C677T位點突變可伴隨脂代謝紊亂，但對肝臟脂肪含量無明顯影響。如能針對我國不同地域不同民族人群開展MTHFR基因篩查，同時聯(lián)合檢測Hcy水平，或可協(xié)助判斷血Hcy水平升高的原因，有助于臨床對高Hcy血癥和血脂異常的評價和治療，為慢病管理提供新的思路。