系統(tǒng)分析肝臟轉(zhuǎn)錄組解析豬脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制

邢 凱，翟麗維，侍玉梅，沈 奧，曹永春，王楚端*，白立景

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518120）

肝臟是動(dòng)物機(jī)體最大的腺體器官，也是體內(nèi)最重要的代謝器官，功能廣泛。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，肝臟在膽固醇代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和體內(nèi)能量的穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要功能。在豬上，肝臟則是極低密度脂蛋白的合成分泌、膽固醇的從頭合成、脂肪酸氧化的主要部位。還有研究發(fā)現(xiàn)，豬肝臟中也能進(jìn)行少量的脂肪酸從頭合成?？梢?，肝臟在脂肪、膽固醇、脂蛋白等多種脂質(zhì)的合成和代謝中發(fā)揮著主要作用。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是一種基于高通量測(cè)序技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的技術(shù)，具有靈敏度高、成本低、檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)。比較不同脂肪沉積能力豬肝臟的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是鑒定影響豬脂肪沉積關(guān)鍵基因的主要方法之一。吳正明等比較了肉質(zhì)兼用型品種撒壩豬和瘦肉型豬杜洛克豬的肝臟轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)等基因和PPAR 信號(hào)通路等通路在脂肪沉積過程中發(fā)揮了重要作用。Huang 等比較了金華豬和長(zhǎng)白豬肝臟轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)基因參與了氧化還原、脂質(zhì)合成和代謝的過程。Sodhi 等比較了韓國本地豬和巴克夏豬肝臟的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果表明差異表達(dá)基因顯著富集在物質(zhì)代謝、免疫應(yīng)答和蛋白質(zhì)綁定等過程。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)也應(yīng)用于不同脂肪沉積能力豬肝臟組織轉(zhuǎn)錄組研究。Li比較了不同背膘厚度沂蒙黑豬的肝臟轉(zhuǎn)錄組，鑒定出CYP1A1/2、HMGCS2、ACSS2 和 UBE2L6 等基因?yàn)橛绊懼境练e的關(guān)鍵基因。Xing 等通過分別比較不同背膘厚度的長(zhǎng)白豬和松遼黑豬肝臟轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要參與了脂質(zhì)代謝的過程。但是，不同研究間的結(jié)果并不盡相同。

本研究以不同背膘厚度長(zhǎng)白豬和松遼黑豬肝臟轉(zhuǎn)錄組為研究對(duì)象，系統(tǒng)分析品種和背膘厚度對(duì)肝臟中基因表達(dá)的影響，以期鑒定豬肝臟中影響豬脂肪沉積的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究選擇了具有顯著差異背膘厚度的6 頭長(zhǎng)白豬和松遼黑豬（每個(gè)品種內(nèi)背膘厚高低個(gè)體各3 頭）為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。品種內(nèi)背膘厚度高低個(gè)體間脂肪沉積能力差異極顯著。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屠宰后，采集肝臟組織樣品，立即保存于液氮用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 文庫的構(gòu)建和測(cè)序 采用Trizol 法提取肝臟組織的總RNA。1% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 檢測(cè)RNA的質(zhì)量、濃度和純度。質(zhì)量合格的RNA 用于反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并構(gòu)建測(cè)序文庫。文庫質(zhì)檢合格后，在Illumina Hiseq 2000 平臺(tái)上進(jìn)行雙端轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理 使用軟件Trimmomatic刪除raw data 中接頭序列和低質(zhì)量reads 后，獲得高質(zhì)量clean reads 進(jìn)一步用于后續(xù)分析。使用軟件Bowtie2建立豬基因組（Sscrofa 11.1,ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/sus_scrofa/dna/）索引。使用TopHat v2.0.1軟件將clean reads 比對(duì)到豬參考基因組上。使用HT-seq 軟件鑒定基因在不同樣本中的表達(dá)量。

1.4 差異表達(dá)基因分析 為分析品種和背膘厚度對(duì)肝臟中基因表達(dá)水平的影響，R 包DEseq2 被用于鑒定差異表達(dá)基因（Differentially Expression Genes,DEGs）。采用一般線性模型為y=breeding+backfat+breeding*backfat，其中breeding 為品種的效應(yīng)；backfat 為背膘厚度的效應(yīng)；breeding*backfat 為二者的交互作用。篩選條件為FDR<0.05 及|logFC|>1。

1.5 差異表達(dá)基因分析 為進(jìn)一步分析DEGs 的生物學(xué)功能，在線分析平臺(tái)Omicshare Tools（https://www.omicshare.com/tools/）用 于DEGs 的GO 和KEGG 功能富集分析及可視化。value<0.05 通路和GO 條目為DEGs 顯著富集的通路。

2 結(jié)果

2.1 基因整體表達(dá)水平 測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控、比對(duì)到基因組上后，每個(gè)樣本平均獲得2.19×10條reads。這些reads 在12 個(gè)樣本中共被注釋到24 796 個(gè)基因上。通過相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，不同樣本間基因表達(dá)水平的相關(guān)性都在0.8 以上（圖1A），且其中的78.89%在4 個(gè)分組中都有表達(dá)（圖1B）。

圖1 基因的整體表達(dá)水平

2.2 差異表達(dá)分析 使用DESeq2 系統(tǒng)分組分析不同表型和品種對(duì)肝臟組織中基因表達(dá)的影響。以FDR<0.05及|logFC|>1 為篩選條件，在不同表型豬肝臟中共鑒定出差異表達(dá)基因395 個(gè)，其中厚背膘組豬肝臟中高表達(dá)基因177 個(gè)，薄背膘組豬肝臟中高表達(dá)基因218 個(gè)（圖2A）。以同樣的篩選條件，在不同品種豬肝臟中共鑒定出差異表達(dá)基因458 個(gè)，其中松遼黑豬肝臟中高表達(dá)基因134 個(gè)，長(zhǎng)白豬肝臟中高表達(dá)基因324 個(gè)（圖2B）。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖

2.3 差異表達(dá)基因功能富集分析 對(duì)不同表型豬肝臟中差異表達(dá)基因KEGG 通路功能富集分析，共鑒定出顯著富集的通路18 條（<0.05）。其中花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝、P450 細(xì)胞色素代謝過程、脂肪酸代謝、胰島素抵抗、皮質(zhì)醇的合成和分泌等通路影響脂質(zhì)在體內(nèi)的積累和代謝。

對(duì)不同豬種間差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)26 條顯著富集的通路。其中PPAR 信號(hào)通路、新陳代謝通路、細(xì)胞色素P450 代謝通路、鞘糖脂生物合成通路、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分解調(diào)控通路、甘油三酯代謝通路、主要膽汁酸合成、MAPK 信號(hào)通路等在脂肪合成和代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

通過GO 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同表型間的差異表達(dá)基因顯著富集GO 條目94 條；不同品種間差異表達(dá)基因顯著富集GO 條目84 條。這些GO 條目主要參與了氧化還原酶的激活、脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶激活、脂肪酸生物合成、各種小分子的綁定、多種物質(zhì)代謝的激活、免疫激活等過程。

3 討 論

肝臟是調(diào)控豬體內(nèi)物質(zhì)代謝最重要的器官之一，同時(shí)也調(diào)控著其體重和采食量。近年來，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘肝臟中與豬重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的研究也越來越多。但是，多數(shù)研究只針對(duì)一對(duì)比較，影響因素較多，導(dǎo)致各研究之間的結(jié)果差異很大。本研究系統(tǒng)分析了不同背膘厚度的長(zhǎng)白豬和松遼黑豬的肝臟轉(zhuǎn)錄組，采用DEseq2 中雙因素的方法鑒定差異表達(dá)基因，更好地剖分了不同分組之間的影響因素，減少了結(jié)果的假陽性。

在本研究中，395 個(gè)差異表達(dá)基因在不同表型豬肝臟組織中被檢測(cè)到。先前研究報(bào)道，肝臟主要參與脂肪降解的過程，并未參加脂肪酸從頭合成的過程。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)脂肪酸合成關(guān)鍵基因乙酰輔酶A 羧化 酶（Acetyl-CoA Carboxylase Alpha，）、ELOVL 脂肪酸延長(zhǎng)酶 6（ELOVL Fatty Acid Elongase 6，）和酮戊二酸脫氫酶L（Oxoglutarate Dehydrogenase L，）在厚背膘組顯著高表達(dá)。ACACA 編碼乙酰輔酶A 羧化酶，催化乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，是脂肪酸從頭合成的限速步驟?；蚴浅L(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)和去飽和的關(guān)鍵基因。參與了三羧酸循環(huán)的過程，其為脂肪酸的從頭合成提供。這表明，豬肝臟中也可能發(fā)生了脂肪酸從頭合成的過程，進(jìn)而影響了脂肪沉積的能力。肝臟中差異表達(dá)基因涉及了多種物質(zhì)的代謝，如藥物、長(zhǎng)鏈脂肪酸、外源物質(zhì)、氨基酸等。這與肝臟在機(jī)體內(nèi)解毒的生物學(xué)功能相一致。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（Carnitine Palmitoyltransferase 1A，）、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 omega 2（Glutathione S-transferase Omega 2，）、-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶5（Gammaglutamyltransferase 5，）等基因，在多種物質(zhì)的代謝中發(fā)揮著重要的作用?？梢源呋€粒體攝入長(zhǎng)鏈脂肪酸，是長(zhǎng)鏈脂肪酸氧化的限速步驟。當(dāng)肝臟中表達(dá)水平較高時(shí)，可以增加脂肪酸的降解和減少機(jī)體脂肪的含量。和在谷胱甘肽代謝中發(fā)揮著重要作用。谷胱甘肽是種氧化還原緩沖劑，具有清除自由基、解毒、修復(fù)蛋白、合成DNA等多種免疫和抗氧化應(yīng)激的功能。這些基因在薄背膘組豬肝臟中表達(dá)水平更高，表明其氧化脂肪酸的能力更強(qiáng)。是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞營養(yǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過影響采食量來調(diào)控哺乳動(dòng)物的脂質(zhì)代謝。與本研究結(jié)果一致，肥胖組個(gè)體肝臟中基因的表達(dá)水平較高。這些表明，豬肝臟中脂肪的生成和分解過程都影響了脂肪沉積的多少。

圖3 不同表型豬肝臟中差異表達(dá)基因富集的通路

圖4 不同品種豬肝臟中差異表達(dá)基因富集的通路

圖5 差異表達(dá)基因顯著富集的GO 條目

松遼黑豬是一個(gè)培育品種，在生長(zhǎng)性能和免疫性狀上與瘦肉型豬都有顯著的差異。在本研究中，松遼黑豬和長(zhǎng)白豬肝臟間共檢測(cè)到458 個(gè)差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因等顯著富集到PPAR 信號(hào)通路。PPAR 信號(hào)通路是維持體內(nèi)調(diào)控能量平衡、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞分化和增殖的關(guān)鍵通路。其中，編碼的蛋白是最豐富的脂滴蛋白，可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的生成。酶在線粒體中催化中鏈脂肪酸的氧化，并間接影響了甘油三酯的代謝。是甘油三酯的運(yùn)輸?shù)鞍?。敲除基因的小鼠，增加了其甘油激酶的活性，促進(jìn)了甘油三酯的生成，導(dǎo)致小鼠的肥胖和代謝障礙。是一個(gè)脂肪細(xì)胞因子，其紊亂可提高脂肪生成和抑制脂肪酸氧化引起脂肪肝、肥胖和胰島素抵抗。是核受體蛋白PPAR 家族中的一員，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的脂肪酸氧化、線粒體功能、胰島素抵抗等?？梢?，PPAR 信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的差異表達(dá)引起了不同品種豬間的脂肪沉積能力差異。這與上述同一品種中豬脂肪沉積能力差異的原因并不相同。同樣，不同品種豬肝臟中發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因差異表達(dá)，如：等。是T 淋巴細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子，可以促進(jìn)T 細(xì)胞的活化、增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子，對(duì)于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞存活和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。是一種通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定于細(xì)胞膜表面的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白,具有抑制同源補(bǔ)體攻膜復(fù)合物（MAC）形成和參與介導(dǎo)T 細(xì)胞活化等多種功能,進(jìn)而保護(hù)宿主細(xì)胞。是一種誘導(dǎo)共刺激分子，優(yōu)勢(shì)表達(dá)在活化的T 細(xì)胞表面，在機(jī)體的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，主要參與免疫系統(tǒng)中T 細(xì)胞活化，介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移及運(yùn)動(dòng)等。在癌癥中，能夠激活腫瘤干細(xì)胞，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，并通過激活腫瘤細(xì)胞逃逸宿主免疫機(jī)制以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡?；蛞卜Q原癌基因，其編碼蛋白在細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它也可以通過細(xì)胞凋亡作用引起先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良和增殖性筋膜炎。INF 是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中的細(xì)胞因子，在細(xì)胞抗病毒免疫中發(fā)揮重要的作用，其血清學(xué)水平與肝臟疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。以上這些基因在2個(gè)品種豬肝臟中表達(dá)的差異，可能引起了他們免疫性狀上的不同。

4 結(jié) 論

本研究系統(tǒng)分析了具有2 個(gè)品種內(nèi)顯著差異脂肪沉積能力的松遼黑豬和長(zhǎng)白豬的肝臟組織測(cè)序數(shù)據(jù)。不同表型間差異表達(dá)基因結(jié)果提示，等基因是肝臟中調(diào)控脂肪合成和代謝的關(guān)鍵基因；不同品種間差異表達(dá)基因分析表明，PPAR 信號(hào)通路改變了2 個(gè)品種間脂肪沉積能力，且等基因調(diào)控了免疫性狀。本研究對(duì)豬脂肪性狀的遺傳改良、肝臟功能解析有一定意義。