副豬嗜血桿菌感染禁食初乳CD 仔豬模型及感染相關(guān)表型組構(gòu)建

劉正芳，朱 穎，張 爍，劉 青，張 晶，周煥煥，周 傲，史良玉*，陳洪波*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，動(dòng)物遺傳繁育與精準(zhǔn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.湖北省家畜種業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023）

副豬嗜血桿菌（，Gps）是于豬漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎和腦膜炎的病料中發(fā)現(xiàn)的一種革蘭氏陰性菌。作為一種定植于豬上呼吸道的常在細(xì)菌，Gps 可在出生不久的仔豬上呼吸道寄居并于應(yīng)激條件下發(fā)病，多發(fā)于仔豬斷奶后的保育階段（4～8周齡），臨床上以格拉瑟氏?。X膜炎、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎）為典型特征。作為豬中常見(jiàn)細(xì)菌性病原，該菌感染正在對(duì)世界各國(guó)生豬養(yǎng)殖造成嚴(yán)重威脅。開(kāi)展相關(guān)抗病育種工作可從根本上解決Gps 感染、提升豬群健康。高效鑒定抗性基因或分子標(biāo)記是抗病育種的核心內(nèi)容之一，但基于實(shí)驗(yàn)豬群的相關(guān)遺傳素材挖掘很大程度上依賴抗病育種表型參數(shù)。與生長(zhǎng)等常規(guī)性狀相比，抗病性狀檢測(cè)的成本較高，因此，構(gòu)建出一套由部分重要參數(shù)組成的關(guān)鍵表型是簡(jiǎn)化程序、降低成本、提升效率的重要前提。由于普通豬大概率已經(jīng)攜帶多種病原，再加上主動(dòng)和被動(dòng)免疫的影響，導(dǎo)致豬的免疫學(xué)背景參差不齊，會(huì)干擾關(guān)鍵表型參數(shù)構(gòu)建的精準(zhǔn)度，在豬抗病育種研究中需要引起特別注意。

禁食初乳（Colostrum-Deprived，CD）仔豬是經(jīng)母豬自然分娩并輔以必要助產(chǎn)后立即隔離且經(jīng)人工飼養(yǎng)存活的仔豬，飼養(yǎng)期間禁食母乳、不對(duì)其做任何免疫接種。通過(guò)該操作，一方面會(huì)極大程度上隔絕仔豬出生早期Gps 在上呼吸道的定植，另一方面會(huì)避免母源抗體的影響，保證了實(shí)驗(yàn)豬群免疫背景的整齊度和干凈度。因此，CD 仔豬在免疫背景上優(yōu)于普通仔豬、制備成本上低于SPF 豬，復(fù)制出病原感染病征的成功率高，是一種比較適合抗病育種研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。陳洪波等曾于國(guó)內(nèi)最早研究了CD 仔豬的制備方法，并探討了其應(yīng)用于Gps 感染的效果，但相關(guān)技術(shù)流程尚有進(jìn)一步優(yōu)化空間。

Gps 強(qiáng)毒株能夠黏附和入侵一系列宿主上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，破壞上皮屏障，是細(xì)菌侵染并引發(fā)嚴(yán)重系統(tǒng)性炎癥的原因。研究表明，感染可導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如和在腦、肺和脾臟等組織中上調(diào)表達(dá)，被認(rèn)為是強(qiáng)毒株（血清型5）感染的特征之一。急性期蛋白被認(rèn)為是監(jiān)測(cè)感染以及評(píng)估疫苗和藥品療效的合適生物標(biāo)志物，已被用于豬的不同細(xì)菌和病毒的實(shí)驗(yàn)性感染評(píng)估。許多群體內(nèi)變量會(huì)影響豬的血液和理化參數(shù)，這些因素包括環(huán)境和生理因素，如年齡、品種、性別、飲食環(huán)境以及病原體感染。Amano等首次描述了Gps 急性感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的白細(xì)胞減少，這通常與免疫細(xì)胞從血液中募集到感染部位有關(guān)，提示炎癥反應(yīng)在Gps 感染的早期階段被激活。

截至目前，尚缺乏對(duì)Gps 感染CD 仔豬的一系列具體參數(shù)分析，數(shù)據(jù)鏈不完整，相關(guān)表型參數(shù)不夠全面。基于此，本研究旨在通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化CD 仔豬制備技術(shù)，構(gòu)建該菌感染CD 仔豬的關(guān)鍵表型組，相關(guān)結(jié)果有望為疫苗研發(fā)、藥物評(píng)價(jià)以及”Gps-豬”互作的分子機(jī)制和抗病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)仔豬及其人工照料 1 日齡杜×長(zhǎng)×大新生仔豬購(gòu)于湖北省云夢(mèng)縣某豬場(chǎng)，共15 頭（♀：5 頭，♂：10 頭）。仔豬出生后用聚維酮碘原液對(duì)仔豬臍帶和肛門消毒，涂抹仔豬爽身粉，禁食母乳，不做任何免疫接種，所有仔豬隔離暫存，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號(hào)：SYXK（鄂）2014-0081）進(jìn)行人工飼喂。運(yùn)輸期間，及時(shí)補(bǔ)喂仔豬超母奶（武漢安佑飼料科技有限公司）。及時(shí)對(duì)仔豬編號(hào)（1～15 號(hào)），并記錄性別，定期對(duì)仔豬稱重并測(cè)量體溫。1—6 日齡使用奶瓶飼喂，每日4～5次，沖奶水溫控制在38～45℃。其中，1 日齡人工乳飼喂量不超過(guò)50 mL/次；2—6 日齡，沖奶溫水中添加土霉素1～2 g/L 以預(yù)防感染。7 日齡后采用料盤(pán)飼喂，15日齡起，使用102A 仔豬教槽料（武漢安佑飼料科技有限公司）與超母奶混合成稀糊狀進(jìn)行教飼，采食期間注意補(bǔ)充溫水。21 日齡時(shí)，停止使用超母奶，使用102A教槽料飼喂并輔以自由飲水；考慮到成本，使用911K仔豬保育料（武漢安佑飼料科技有限公司）作為補(bǔ)充。CD 仔豬具體飼喂參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 CD 仔豬飼喂方案

1.2 攻毒前CD 仔豬病原檢測(cè) 使用一次性無(wú)菌拭子（江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司）經(jīng)鼻腔采樣后于TSB（10%FBS、0.01% NAD）培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，煮沸法提取DNA，利用三重PCR檢測(cè)Gps、豬胸膜肺炎放線桿菌（，App）和豬鏈球菌（，Ss）。采用EDTAK-2 5 mL負(fù)壓采血管（江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司）經(jīng)前腔靜脈采血后分離血漿，分別使用Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus（PRRSV）Antibody Test Kit（99-40959，IDEXX）、Pseudorabies Virus（PRV）gB Antibody Test Kit（PRV gB Ab）（99-09732，IDEXX）和Classical Swine Fever Virus（CSFV）Antibody Test Kit（99-43220，IDEXX）ELISA 試劑盒檢測(cè)豬群是否為PRRSV、PRV 和CSFV 陰性，操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 CD 仔豬攻毒與臨床病征數(shù)據(jù)、樣本采集 Gps 為SH0165 菌株（5 型）。細(xì)菌培養(yǎng)采用TSA（10% FBS、0.01% NAD）和TSB（10% FBS、0.01% NAD）培養(yǎng)基，其中TSA（BD26950）和TSB（BD211825）購(gòu)自BD 公司，NAD（N7004-1G）購(gòu)自Sigma 公司。挑取Gps 細(xì)菌單菌落于TSB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min 培養(yǎng)至OD約為0.7，利用TSB 稀釋至1×10CFU/mL。30 日齡時(shí)，隨機(jī)選擇6 頭CD 仔豬經(jīng)氣管內(nèi)注射（2×10CFU）開(kāi)展攻毒預(yù)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估感染效果；正式實(shí)驗(yàn)中，對(duì)剩余9頭仔豬隨機(jī)選擇3 頭作為對(duì)照，其余6 頭仔豬作為攻毒組，經(jīng)氣管內(nèi)接種2×10CFU 細(xì)菌，攻毒組和對(duì)照組CD 仔豬分別在攻毒間和對(duì)照間隔離飼養(yǎng)。

攻毒后密切觀察豬群情況并定時(shí)依據(jù)臨床癥狀進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：正常：0；異常：行為舉止機(jī)敏性差1'，臥地/垂死掙扎2'；呼吸略急促1'，急促2'；單肢跛行1'，雙肢及以上2'；神經(jīng)癥狀肌肉僵直/顫抖1'，抽搐2'；咳嗽偶爾1'，頻繁2'；進(jìn)食差1'，不食2'。攻毒前后0 hpi（hours post infection）、6 hpi、18 hpi、24 hpi、30 hpi、48 hpi 和72 hpi 采集體溫?cái)?shù)據(jù)；其中，0 hpi、24 hpi、48 hpi 和72 hpi 經(jīng)前腔靜脈采集血液樣本用于血液參數(shù)分析（詳見(jiàn)1.4）。對(duì)瀕死仔豬及時(shí)屠宰，剖檢后分別采集肺臟、腹膜、心包膜、關(guān)節(jié)液和腦膜部位拭子用于Gps 的TSA 平板培養(yǎng)鑒定和PCR 擴(kuò)增鑒定；采集肺臟、肝臟、脾臟、腦膜和腹膜等組織，4%多聚甲醛固定后用于組織病理分析，利用RNA Later（01070270,Invitrogen）保存樣本用于后續(xù)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.4 血液參數(shù)檢測(cè)分析

1.4.1 血液五分類指標(biāo)檢測(cè) 使用BC-500Vet 血細(xì)胞分析儀（邁瑞醫(yī)療）及其配套試劑進(jìn)行全血CBC 和WBC DIFF 參數(shù)采集。檢測(cè)項(xiàng)目包括：紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞血紅蛋白均值（CHCM）、細(xì)胞血紅蛋白含量（CH）、血紅蛋白濃度分布寬度（HDW）、紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）、血小板（PLT）、血小板平均體積（MPV）、嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)值和百分比（NEU#，NEU%）、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和百分比（LYMPH#，LYMPH%）、單核細(xì)胞絕對(duì)值和百分比（MONO#，MONO%）、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值和百分比（EOS#，EOS%）和嗜堿性粒細(xì)胞絕對(duì)值和百分比（BASO#，BASO%）。

1.4.2 血漿生化指標(biāo)檢測(cè) 取500 μL 血漿樣本利用HITEC 7100 全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI）及匹配檢測(cè)試劑（HITACHI 或德賽）進(jìn)行血漿生化指標(biāo)檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)目包括：總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）、肌酐（CREA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、尿素氮（BUN）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、肌酸激酶（CK）。

血液參數(shù)數(shù)據(jù)以Mean±SD 表示，利用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件和最小二乘法分析各血液參數(shù)的差異。

1.5 組織病理分析 組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后送佳維斯（武漢）生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行組織病理切片（HE）的制備，病理切片拍照及分析在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.6 qRT-PCR 檢測(cè)分析 利用qRT-PCR 檢測(cè)8 種細(xì)胞因子（）和3 種急性期蛋白（）基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。具體方法為：利用冷凍研磨儀（JXFSTPRPCLN，上海凈信）將肺臟、脾臟、腦膜和腹膜組織研磨后TRNzol 法（TRNzol Universal Reagent，天根生化）提取組織總RNA；利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA 進(jìn)行質(zhì)檢；采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A，TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄，隨后利用Premix Taq 酶（RR901，TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）和內(nèi)參基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）；利用SYBR Premix Ex Taq（RR420A，TaKaRa）和Multiplate96-Well PCR Plates（low profile/unskirted/clear #MLL9601，Bio-Rad）在定量PCR 系統(tǒng)（Archimed X6，鯤鵬）進(jìn)行定量檢測(cè)；qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)所涉基因引物見(jiàn)表2，其中部分引物利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，采用Oligo 7 Primer Analysis Software結(jié)合NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證引物序列。

表2 qRT-PCR 檢測(cè)分析引物

qRT-PCR 檢測(cè)采用10 μL 反應(yīng)體系，運(yùn)行程序?yàn)椋罕仉A段50℃2 min，95℃5 min；PCR 反應(yīng)95℃30 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段95℃30 s，60℃30 s，熒光信號(hào)采集60～95℃，0.5℃/s。本研究中首先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)Ct 值評(píng)估各目標(biāo)基因表達(dá)豐度，然后根據(jù)豐度高低分別選用合適的內(nèi)參基因；其中，高表達(dá)基因和選用內(nèi)參為，其余較低表達(dá)基因選用內(nèi)參為。定量結(jié)果差異分析采用2法（*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001），采用Graphpad Prism 8.3 軟件對(duì)定量分析結(jié)果進(jìn)行圖形化展示。

2 結(jié)果

2.1 CD 仔豬狀態(tài)與生長(zhǎng)發(fā)育

2.1.1 仔豬生長(zhǎng)情況 通過(guò)優(yōu)化技術(shù)流程，總體上所有CD 仔豬生長(zhǎng)狀態(tài)良好，成活率達(dá)100%。期間，個(gè)別仔豬因較難適應(yīng)奶嘴或者干濕料更換，偶現(xiàn)采食減少情況；個(gè)別仔豬飲水或采食人工乳時(shí)，會(huì)因打濕身體受涼偶發(fā)腹瀉（腹瀉率1.25%）；此外，個(gè)別仔豬出現(xiàn)濕疹，但通過(guò)及時(shí)補(bǔ)水、保溫以及擦涂爽身粉，均很快恢復(fù)正常。

使用人工代乳料飼喂至21 日齡后，分兩階段飼喂顆粒飼料（102A、911K）。與商業(yè)育肥相比，本研究中人工飼養(yǎng)模式下仔豬生長(zhǎng)速度較慢。如表3 所示，仔豬斷奶前（21 日齡）日增重18～66 g 不等，平均日增重38 g；斷奶后（22 日齡）日增重61～247 g，平均日增重約154 g。但仔豬總體能夠較好保持健康生長(zhǎng)，體重持續(xù)增加。

表3 Gps 攻毒前CD 仔豬體重記錄

2.1.2 仔豬血液參數(shù)分析 攻毒前15～30 日齡共3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血常規(guī)（CBC、WBC DIFF）檢測(cè)結(jié)果顯示（表4），斷奶前后CD 仔豬血常規(guī)參數(shù)波動(dòng)較大，但斷奶前后15 日齡和30 日齡2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有12 項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著差異，血液參數(shù)總體上比較平穩(wěn)。3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD 仔豬12 項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果在數(shù)據(jù)波動(dòng)趨勢(shì)上與血常規(guī)類似（表5）。

表4 Gps 攻毒前CD 仔豬血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

表5 Gps 攻毒前CD 仔豬血液生化指標(biāo)檢測(cè)

2.2 攻毒前病原體檢測(cè) 為保證Gps 感染的成功率，研究于攻毒前對(duì)包括Gps 在內(nèi)的5 種病原體（Ss、App、PRRSV、PRV、CSFV）進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，絕大多數(shù)CD 仔豬為上述病原體陰性。其中，僅2 頭CD 仔豬在7 日齡存在Ss 或App 弱陽(yáng)性，隔離飼養(yǎng)后15 日齡復(fù)檢結(jié)果顯示為陰性；所有仔豬未檢出Gps、PRRSV、PRV、CSFV。

2.3 Gps 攻毒后癥狀、血液參數(shù)和組織病理分析

2.3.1 臨床癥狀評(píng)分 對(duì)照組仔豬體各項(xiàng)體征無(wú)異常表現(xiàn)，精神狀態(tài)良好、采食正常。而攻毒組CD 仔豬于攻毒后24 h，豬群開(kāi)始出現(xiàn)明顯臨床癥狀，感染豬只不同程度地表現(xiàn)出精神呆滯、跛行、不愿站立；30 hpi 起，感染豬群中出現(xiàn)跛行，個(gè)別豬關(guān)節(jié)明顯腫大、畏寒、扎堆、被毛雜亂、精神不振、渾身疲軟無(wú)力；36 hpi 起，感染較嚴(yán)重的豬只完全不能站立、食欲廢絕；發(fā)病癥狀稍輕豬只表現(xiàn)為弓背、畏寒、精神不佳、尾巴低垂等。整個(gè)感染期間，個(gè)別豬只偶伴咳嗽。按照出現(xiàn)異常癥狀及記分原則，對(duì)照組和攻毒組的綜合臨床癥狀評(píng)分見(jiàn)表6。綜合上述臨床觀察和評(píng)分情況，本研究中能夠較好地將攻毒后CD 仔豬區(qū)分為輕癥組（4、12、15 號(hào)）和重癥組（8、9、10 號(hào)）。

表6 Gps 攻毒后CD 仔豬臨床癥狀評(píng)分情況

2.3.2 Gps 攻毒后輕重癥組CD 仔豬比較分析 對(duì)于對(duì)照組、輕癥組和重癥組0～72 hpi 的持續(xù)體溫檢測(cè)結(jié)果顯示，Gps 感染導(dǎo)致仔豬體溫明顯升高。其中，輕癥組在6 hpi 時(shí)平均體溫升至41.5℃，各時(shí)間點(diǎn)平均體溫超過(guò)40.5℃；重癥豬體溫升高至42.5℃左右，重癥組在瀕死時(shí)刻，體溫呈直線下降（圖1）。體重?cái)?shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組（日增重130 g）相比，攻毒對(duì)輕癥組仔豬影響不明顯（日均增重160 g）；但重癥組體重增加顯著下降（20 g），個(gè)別嚴(yán)重仔豬（如#9）停止增重甚至下降。整體上，與對(duì)照相比，輕癥組除了出現(xiàn)跛行、喜臥、精神萎靡、被毛粗亂之外，采食基本正常；而重癥組于36 hpi 起陸續(xù)不能站立、食欲廢絕，隨后36 h 內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)⊙Y和倒地劃水癥狀。

圖1 Gps 攻毒后各組CD 仔豬的體溫變化曲線

2.3.3 Gps 攻毒后血液參數(shù)分析 研究分析了攻毒前后對(duì)照組、輕癥組和重癥組18 種血常規(guī)指標(biāo)于0～72 hpi的變化情況，結(jié)果表明，對(duì)照組有3 項(xiàng)指標(biāo)（MON#↓、MON% ↓、MCV ↑）存在顯著波動(dòng)，但變化倍數(shù)不大。輕癥組中共有7 項(xiàng)指標(biāo)（MON%、MCV、EOS#、MCHC、MPV、WBC#、RDW-SD）存在不同程度的顯著變化，但總體上變化幅度較低；輕癥組中MON%和WBC# 均在攻毒后較早時(shí)間點(diǎn)上升，隨后恢復(fù)正常。重癥組共有13 項(xiàng)指標(biāo)（MON%、MON#、EOS%、MCHC、WBC#、RDW-SD、HCT、HGB、NEU#、PDW、PLT、RBC、PCT）存在不同程度的顯著變化。其中7 項(xiàng)指標(biāo)（EOS%、MCHC、RDW-SD、HCT、HGB、PDW、RBC）變化幅度不大；3 項(xiàng)指標(biāo)（NEU#、PLT、PCT）于瀕死前出現(xiàn)顯著下降；3 項(xiàng)指標(biāo)（MON%、MON#、WBC#）顯著升高且變化幅度較大（圖2）。

圖2 Gps 攻毒后輕癥組和重癥組CD 仔豬血常規(guī)指標(biāo)分析

對(duì)攻毒前后對(duì)照組、輕癥組和重癥組12 種血液生化指標(biāo)的分析顯示，對(duì)照組有2 項(xiàng)指標(biāo)（AST ↓、TP ↓）顯著下降。輕癥組AST 和HDL 2 項(xiàng)指標(biāo)顯著上升，而重癥組HDL 顯著下降?？偣灿? 項(xiàng)指標(biāo)（TP、ALB、ALT、BUN、CREA、GGT、GLU、LDL、LDH）在輕癥和重癥組均顯著上升，除BUN 變化幅度較小外，其余8 項(xiàng)均上升2 倍以上，尤其是TP 呈現(xiàn)出與對(duì)照組中截然相反的變化（圖3）。

圖3 Gps 攻毒后輕癥組和重癥組CD 仔豬血液生化指標(biāo)分析

2.3.4 Gps 攻毒后仔豬剖檢、Gps 細(xì)菌檢測(cè)與組織病理分析 Gps 攻毒后，重癥組所有CD 仔豬均在48 hpi 處于瀕死狀態(tài)。盡管輕癥組仔豬于48 hpi 已經(jīng)出現(xiàn)較明顯臨床癥狀，但由于仍能較好地采食。剖檢發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組正常，輕癥組尤其是重癥組均不同程度地出現(xiàn)較典型的格拉瑟氏病癥狀。Gps 感染導(dǎo)致仔豬四肢關(guān)節(jié)尤其是前肢腕關(guān)節(jié)積液增多，胸腔和腹腔積液明顯，頸部和腹部腸系膜淋巴結(jié)腫大充血，重癥組個(gè)別仔豬在心包處不同程度地存在纖維素樣白色沉淀，而輕癥組仔豬纖維素樣沉淀較少甚至不明顯。

對(duì)腹膜、肺、心包膜、關(guān)節(jié)液和腦膜處的Gps 細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組仔豬均未檢出Gps，感染組中在肺臟、心包液、腦膜和腹膜中均檢出Gps。研究依據(jù)此定性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步對(duì)CD 仔豬的感染患病嚴(yán)重程度進(jìn)行了評(píng)分；評(píng)分時(shí)采用簡(jiǎn)化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，即陽(yáng)性菌落檢出較少或PCR 電泳條帶較弱記為“+”，較多或條帶明亮記為“++”，陰性記為“-”，每個(gè)“+”記1 分。具體評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 Gps 攻毒后CD 仔豬關(guān)鍵組織中細(xì)菌的定性檢測(cè)與評(píng)分

組織病理結(jié)果顯示，與對(duì)照組和輕癥組仔豬相比，重癥組仔豬組織內(nèi)肺泡間的間隔斷裂更為嚴(yán)重，形成較大囊腔，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯且肺泡壁充血增厚。腹膜組織中存在較多淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)。腦膜組織中腦實(shí)質(zhì)也出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，且腦實(shí)質(zhì)物理變化較明顯（圖4）。

圖4 Gps 攻毒后CD 仔豬組織病理分析（HE 染色，×200）

2.4 炎性細(xì)胞因子和急性期蛋白表達(dá)分析

2.4.1 細(xì)胞因子表達(dá)分析 對(duì)肺臟、脾臟、腹膜和腦膜中8 種炎性細(xì)胞因子（）基因的表達(dá)檢測(cè)顯示（圖5），輕癥組中只有（肺臟）和（腦膜）顯著上調(diào)但倍數(shù)變化較小；重癥組中差異變化細(xì)胞因子比輕癥組明顯較多，除了無(wú)差異之外，（肺臟）、（肺臟）、（肺臟、腹膜）、（肺臟、腹膜）、（脾臟、腹膜）、和（腹膜）均顯著上調(diào)。重癥組中顯著上調(diào)的細(xì)胞因子中，差異倍數(shù)較大，后兩者均在2 種組織中呈現(xiàn)出較大倍數(shù)變化。從組織類型來(lái)看，肺臟和腹膜中細(xì)胞因子變化較明顯，腦膜中最不明顯。

圖5 Gps 攻毒后組織中細(xì)胞因子和急性期蛋白表達(dá)分析

2.4.2 急性期蛋白表達(dá)分析 對(duì)肺臟、肝臟和脾臟中3個(gè)急性期蛋白基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，輕癥組仔豬只有肝臟中的呈顯著上調(diào)；重癥組仔豬肝臟中的3 個(gè)急性期蛋白基因均顯著上調(diào)；此外，唯有在重癥組仔豬肺臟、肝臟和脾臟中均顯著上調(diào)（圖6）。

圖6 Gps 攻毒后組織中急性期蛋白基因表達(dá)分析

3 討 論

CD 仔豬人工飼喂的成活率十分重要，直接關(guān)系實(shí)驗(yàn)成本。本研究通過(guò)技術(shù)優(yōu)化使得仔豬感染前成活率100%，顯著優(yōu)于國(guó)外以及本實(shí)驗(yàn)室之前研究。此外，建立Gps 感染的CD 仔豬模型時(shí)，有必要確定合適的接種劑量。陳洪波等采用氣管接種10CFU 細(xì)菌，仔豬出現(xiàn)了典型多發(fā)性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎臨床癥狀；接種10CFU～10CFU 的仔豬也表現(xiàn)出纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎癥狀，而接種10CFU～10CFU 時(shí)未表現(xiàn)出明顯癥狀。高劑量Gps 感染容易造成仔豬發(fā)生急性死亡，因此，為避免此類情況，應(yīng)首先確定一個(gè)合適的Gps 細(xì)菌攻毒劑量。本研究結(jié)合之前攻毒經(jīng)驗(yàn)，確定的較佳感染條件為氣管內(nèi)接種（1～2）×10CFU。

Gps 感染可引起豬全身性感染，臨床表現(xiàn)為震顫、動(dòng)作不協(xié)調(diào)、后肢癱瘓或側(cè)臥、體溫顯著升高、厭食和抑郁等。感染模型構(gòu)建成功與否很大程度上依賴臨床癥狀和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)，自18 hpi 開(kāi)始攻毒仔豬可見(jiàn)精神抑郁、呼吸急促和被毛粗亂等癥狀。組織病理分析表明，Gps 感染致使肺泡間隔斷裂嚴(yán)重，形成較大的囊腔，肺泡壁充血增厚；腹膜組織內(nèi)有較多淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞浸潤(rùn)，形成淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)；腦實(shí)質(zhì)變化也比較明顯。表明，感染導(dǎo)致CD 仔豬主要靶組織中呈現(xiàn)出明顯的炎性病變。

PCR 檢測(cè)仍是鑒定Gps 的主流技術(shù)之一。本研究中，感染組所有組織樣本經(jīng)PCR 檢測(cè)均呈Gps 陽(yáng)性，并在腹膜、心包膜和腦膜組織中較高頻率地檢測(cè)出Gps。這表明，Gps 經(jīng)氣管攻毒后突破了呼吸系統(tǒng)的免疫防御，造成了對(duì)周身主要靶組織的深度侵染。對(duì)于該菌移行侵染的路徑及相關(guān)分子機(jī)制有待深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，采用相同劑量細(xì)菌攻毒后不同CD仔豬明顯呈現(xiàn)出輕癥和重癥2 種不同的臨床表現(xiàn)。攻毒劑量相同但臨床癥狀不同這一現(xiàn)象在活體動(dòng)物感染試驗(yàn)中屬正?，F(xiàn)象，之前關(guān)于Gps 感染仔豬肺部轉(zhuǎn)錄組的研究中也發(fā)現(xiàn)存在類似情況，本質(zhì)上還是由于不同豬只存在個(gè)體差異或遺傳學(xué)上針對(duì)該細(xì)菌的應(yīng)答差異。結(jié)合剖檢前后的體溫變化曲線和組織病理分析也可以很好地與這種劃分相匹配。輕重癥CD 仔豬的劃分還進(jìn)一步通過(guò)細(xì)菌定性檢測(cè)的綜合評(píng)分得以驗(yàn)證。以上結(jié)果表明，本研究中Gps 感染CD 仔豬建模比較成功，而且證明細(xì)菌可通過(guò)氣管感染后通過(guò)必要侵染途徑到達(dá)主要臟器，進(jìn)而造成周身性炎性感染；同時(shí)也表明，選擇合適的仔豬攻毒模型可以較好地區(qū)分出Gps 感染的個(gè)體間差異。

截至目前，對(duì)Gps 感染相關(guān)表觀參數(shù)的系統(tǒng)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究不僅全面采集了仔豬生長(zhǎng)發(fā)育、體溫?cái)?shù)據(jù)、臨床病征和組織病理等各方面的數(shù)據(jù)，還對(duì)CD 仔豬攻毒前后的23 項(xiàng)血液常規(guī)指標(biāo)和12 項(xiàng)血液生化指標(biāo)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，感染可導(dǎo)致血液總白細(xì)胞（WBC）顯著變化，其中尤其是單核細(xì)胞數(shù)量增加明顯，暗示炎癥反應(yīng)在Gps 感染的早期階段就能被激活，這與之前研究結(jié)果一致。另一方面，持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致典型的“炎癥風(fēng)暴”，是病理性損傷的重要誘因。因?yàn)檠翰杉鄬?duì)容易，而且能獲取連續(xù)性表征信息，所以血液參數(shù)分析在豬抗病育種表型組研究中具有較大優(yōu)勢(shì)。綜合本研究結(jié)果，血液生化指標(biāo)中TP、ALB、ALT、CREA、GGT、GLU、LDL、LDH 和血液常規(guī)指標(biāo)中的MON%、MON#、WBC# 是對(duì)響應(yīng)Gps 感染較有參考意義的指標(biāo)。

強(qiáng)毒株能夠黏附和入侵一系列宿主上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致上皮屏障被破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，并加速細(xì)胞遷移，這可能是導(dǎo)致全身炎癥的主要原因。Wilkinson 等人在對(duì)Gps 易感的豬中觀察到干擾素刺激基因（ISGs）顯著減少，暗示了干擾素信號(hào)可能被抑制。本研究對(duì)肺臟組織的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)無(wú)論輕癥組還是重癥組IFNG 表達(dá)均不顯著。之前研究表明，促炎細(xì)胞因子如和在腦、肺和脾的靶組織中高度上調(diào)，這可被認(rèn)為是Gps 強(qiáng)毒株5 型感染的重要特征之一。與此相對(duì)應(yīng)，Gps 在上呼吸道粘膜上的定植可誘導(dǎo)NPTR 細(xì)胞凋亡，并釋放和。與腦膜炎發(fā)病密切相關(guān)的血腦屏障中，豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)Gps 感染后也表現(xiàn)出類似結(jié)果。本研究對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)分析結(jié)果與之前研究類似，綜合相關(guān)結(jié)果，和尤其是和對(duì)Gps 感染的響應(yīng)相對(duì)較顯著。

4 結(jié) 論

1）通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化CD 仔豬人工照料的技術(shù)流程，攻毒前成活率達(dá)100%；較全面地獲得了與CD 仔豬飼養(yǎng)管理密切相關(guān)的較完整生長(zhǎng)發(fā)育參數(shù)。

2）利用2×10CFU 的Gps 攻毒后CD 仔豬表現(xiàn)為典型的格拉瑟氏病癥狀，成功構(gòu)建了Gps 感染的CD 仔豬的活體研究模型，建立了一套科學(xué)區(qū)分輕重癥患病仔豬的方法。

3）研究圍繞體溫、臨床癥狀評(píng)分、血常規(guī)參數(shù)、血漿生化指標(biāo)、炎性細(xì)胞因子和急性期蛋白六大類參數(shù)初步構(gòu)建了Gps 感染的關(guān)鍵表型組，為深入開(kāi)展相關(guān)抗病育種研究奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝武漢輕工大學(xué)夏昊、任澤毓、張思怡、薛智慧、李水蓮、鄧祥威以及武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所程蕾、向敏、陶弼菲給予的無(wú)私幫助。