靜脈血栓方防治大鼠股骨骨折后深靜脈血栓實驗研究

段小云，萬 軍，曾琳琳，沈 靈，吳傳紅，仲瑞雪

(1.四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610041；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

深靜脈血栓(Deep venous thrombosis,DVT)好發(fā)于骨科術(shù)后，有研究指出，在無預(yù)防措施前提下，普通外科術(shù)后DVT發(fā)生率為10%～40%[1]。股骨血管網(wǎng)豐富且密集，股骨骨折術(shù)后需長期臥床，下肢活動明顯減少，易并發(fā)DVT[2]。對此，有研究發(fā)現(xiàn)[3]，給予骨科大手術(shù)患者預(yù)防性抗凝措施，可使DVT發(fā)生率及病死率顯著降低，對患者術(shù)后轉(zhuǎn)歸有積極作用。利伐沙班是目前骨科大手術(shù)預(yù)防DVT的常用藥物，改善凝血功能效果顯著[4]。中醫(yī)辨證施治個性化治療特色，患者接受度較高，一些在長期臨床實踐經(jīng)驗基礎(chǔ)上形成的經(jīng)驗方、保密方和協(xié)定方，具有獨特的療效[5]。靜脈血栓方為本院用于防治下肢靜脈血栓的經(jīng)驗方，臨床療效確切，不良反應(yīng)少。但靜脈血栓方對DVT的防治效果及作用機制需要更深入的研究?；诖?，本研究分析靜脈血栓方與利伐沙班對大鼠股骨骨折模型的干預(yù)效果，為靜脈血栓方臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：購自成都達碩實驗動物有限公司的SPF級大鼠36只，體重220～300 g，雌雄不拘，合格證號：SCXK(川)2020-030，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫(24±2)℃，濕度60%～65%，自由飲水、進食。本研究經(jīng)動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 藥物、試劑及儀器：靜脈血栓方由黃芪60 g，黨參、丹參各30 g，當(dāng)歸尾15 g，赤芍、桃仁、紅花、水蛭、三七、川芎各12 g組成，由四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部統(tǒng)一購買并煎制，藥材有固定的產(chǎn)地和中藥質(zhì)控。制備方法：藥材準確稱量，加水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，過濾后將兩次濾液混合，根據(jù)《藥理與中藥藥理實驗》[6]制定靜脈血栓方的劑量，分別煎煮至含生藥量為4.48、2.24、1.12 g/ml。陽性藥物為利伐沙班片(H20181081，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，10 mg/片)。蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色液及戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自美國CUSABIO公司，黃嘌呤氧化酶試劑盒及硫代巴比妥酸試劑盒購自北京雅安達生物技術(shù)有限公司；普通光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，型號為CX-21；全自動凝血分析儀購自日本SYSMEX公司，型號為CS-5100。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模：將36只大鼠分為空白對照組、模型對照組、陽性藥物組及高劑量組、中劑量組、低劑量組(隨機數(shù)字表簡單隨機分組法)，每組6只。除空白對照組外，其他五組共30只大鼠行機械損傷性造模成股骨骨折模型，稱重后，給予1%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉，使大鼠取仰臥位，消毒、鋪巾，雙下肢屈髖屈膝固定；在腹股溝外側(cè)縱行切開1 cm，分離皮下組織，顯露股骨，使用無菌止血鉗夾住股骨兩端并向相反方向旋轉(zhuǎn)，當(dāng)聽到啪的聲響時，檢查股骨干，股骨完整性結(jié)構(gòu)破壞，即確定為造模成功；造模后用1號絲線全層間斷縫合切口，另一側(cè)使用相同方法處理，造模后大鼠正常飼養(yǎng)，未使用抗生素。

1.2.2 給藥：在造模前7 d與造模后7 d期間對各組大鼠灌胃，陽性藥物組給予利伐沙班片11.1 mg/(kg·d)灌胃，空白對照組、模型對照組采用等體積蒸餾水灌胃，高劑量組、中劑量組、低劑量組分別按照靜脈血栓方各劑量以1 ml/100 g灌胃，1次/d。

1.3 實驗指標(biāo)

1.3.1 凝血指標(biāo)：于造模后7 d，取各組大鼠尾靜脈血，使用全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(Activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時間(Prothrombin time,PT)、凝血酶時間(Thrombin time,TT)及D-二聚體(D-dimer,DD)。

1.3.2 炎癥指標(biāo)：將各組大鼠尾靜脈血以3000 r/min離心20 min(離心半徑10 cm)，取上層清液，采用酶聯(lián)免疫分析法檢測血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平。

1.3.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)：采用黃嘌呤氧化酶試劑盒檢測血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平，采用硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平。

1.3.4 HE染色標(biāo)本：于造模后7 d，1%戊巴比妥納1 ml/kg腹腔麻醉后處死，取各組大鼠左大隱靜脈組織標(biāo)本，使用75%、80%、90%、95%、100%乙醇各脫水1 h，石蠟包埋，切成4 μm石蠟切片；石蠟切片再次采用梯度乙醇脫水，行HE染色，脫水封邊，送至電鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠基本狀況 各組大鼠生長良好，除空白對照組外，造模的五組大鼠在造模當(dāng)日飼料食用量減少，活動量明顯減少，但造模后第2天飲食情況逐漸恢復(fù)正常，活動量較造模當(dāng)日增加，但與空白對照組大鼠比較仍較少。

2.2 各組大鼠凝血指標(biāo)比較 見表1。造模后7 d，造模的五組PT、APTT、TT均較空白對照組顯著降低(P<0.05)，DD 則較空白對照組顯著升高(P<0.05)；模型對照組PT低于陽性藥物組、中劑量組與高劑量組(P<0.05)，APTT、TT低于陽性藥物組、低劑量組、中劑量組與高劑量組(P<0.05)，DD 則高于陽性藥物組、低劑量組、中劑量組與高劑量組(P<0.05)；陽性藥物組PT、APTT、TT均高于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，DD則低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)；各劑量組PT、APTT、TT均隨劑量的升高而升高(P<0.05)，DD則隨劑量的升高而降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠PT、APTT、DD、TT比較

2.3 各組大鼠炎癥指標(biāo)比較 見表2。造模后7 d，除陽性藥物組外其他造模的四組血清TNF-α、IL-6水平均較空白對照組顯著升高(P<0.05)；模型對照組血清TNF-α、IL-6水平均高于陽性藥物組及低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.05)，陽性藥物組則低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，各劑量組血清TNF-α、IL-6水平隨劑量的升高而降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6比較(pg/ml)

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表3。造模后7 d，除陽性藥物組外其他造模的四組血清SOD水平較空白對照組顯著降低(P<0.05)，模型對照組低于陽性藥物組及低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.05)，陽性藥物組血清SOD水平高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組血清SOD水平低于高劑量組(P<0.05)；造模的五組血清MDA水平均較空白對照組升高(P<0.05)，模型對照組血清MDA水平高于陽性藥物組及低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.05)，陽性藥物組則低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，各劑量組血清MDA水平隨劑量的升高而降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清SOD、MDA比較

2.5 各組大鼠HE染色標(biāo)本比較 空白對照組大鼠靜脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細胞浸潤；模型對照組見血栓形成，靜脈內(nèi)膜損傷，血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)剝脫現(xiàn)象，血管壁炎性細胞浸潤；陽性藥物組及高劑量組未見明顯血栓形成改變，但存在少量血管壁炎性細胞浸潤；低劑量組及中劑量組可見血栓形成及血管壁炎性細胞浸潤，但病理變化小于模型對照組(圖1)。

A:空白對照組；B:模型對照組；C:陽性藥物組；D:低劑量組；E:中劑量組；F:高劑量組

3 討 論

DVT在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)佟肮赡[”“腫脹”“血瘀”等范疇，國家中醫(yī)藥管理局于1994年將DVT正式命名為“股腫”[7]。《素問·痹論篇》中提到，痹在于脈則血凝而不流?！秱浼鼻Ы鹨健分赋?，氣血凝滯則為痛，脈道阻塞則為腫。久病氣虛，氣虛則推動無力，血行受阻，血瘀痹阻于脈，脈絡(luò)不暢則營血回流受阻，津液外溢而生濕，濕熱、瘀血互結(jié)阻于脈絡(luò)，故DVT以濕、熱、瘀相互為患，脈絡(luò)血瘀濕阻為主要病機[8-9]。因此，DVT的中醫(yī)治療應(yīng)使用益氣活血、清熱化瘀法。靜脈血栓方中黃芪益氣為君，甘溫補氣，氣血充足，則血行通暢；赤芍清熱涼血，散瘀止痛，二者相須為用，能清血分實熱、虛熱，散瘀血而留滯[10]。紅花、桃仁，一溫一平，同入心、肝經(jīng)，有活血祛瘀之功，為活血祛瘀之經(jīng)典藥對[11-12]。當(dāng)歸尾功擅活血，為養(yǎng)血之要藥；丹參歸心、肝經(jīng)，長于清心涼血、活血祛瘀、通經(jīng)止痛，能清肝經(jīng)之瘀，除心經(jīng)之煩[13]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂水蛭有“主逐惡血、破瘀血”之效，《本草求真》謂三七“氣味甘苦，能于血分化其血瘀”，兩味合用使瘀血祛、新血生。佐以黨參，益氣健脾，以防活血祛瘀藥之性烈，顧護正氣，又取其“氣能攝血”之效，防止出血之弊；川芎行氣活血，使諸藥補而不滯[14]。全方有陰有陽，通中有補，溫涼并濟，攻補兼顧，動靜結(jié)合，破而不伐，補而不滯，具有活血祛瘀生新之功效，使?fàn)I衛(wèi)恢復(fù)周流無阻。

本研究對大鼠行機械損傷性造模，形成股骨骨折模型，在造模前、后共14 d內(nèi)行灌胃干預(yù)，發(fā)現(xiàn)模型對照組靜脈管腔內(nèi)血栓形成，且伴靜脈內(nèi)膜損傷、血管內(nèi)皮細胞剝脫及血管壁炎性細胞浸潤，提示股骨骨折術(shù)后DVT形成。另外，低劑量組及中劑量組大鼠也可見血栓形成及血管壁炎性細胞浸潤，但血栓體積及靜脈血管形態(tài)損傷小于模型對照組，提示低、中劑量的靜脈血栓方對防治DVT有一定療效。且陽性藥物組與高劑量組靜脈組織標(biāo)本圖像相近，均存在少量血管壁炎性細胞浸潤，但未見管腔內(nèi)血栓，提示高劑量靜脈血栓方對DVT的防治效果與常規(guī)西藥利伐沙班相當(dāng)。這也說明，靜脈血栓方可發(fā)揮其益氣活血、清熱化瘀、祛瘀生新之功，糾正血瘀濕阻之證，使脈絡(luò)通暢無阻、營衛(wèi)氣血周流恢復(fù)，而減少DVT形成，且高劑量對DVT防治效果最好，可與常規(guī)西藥媲美。

此外，本研究還就DVT形成機制展開分析，發(fā)現(xiàn)模型對照組APTT、TT低于陽性藥物組及各高劑量組，DD 則高于陽性藥物組及各劑量組，提示股骨骨折術(shù)后血液處于高凝狀態(tài)。而各劑量組PT、APTT、TT均隨劑量的升高而升高，DD則隨劑量的升高而降低，陽性藥物組與高劑量組凝血指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示高劑量靜脈血栓方的抗凝效果與利伐沙班相當(dāng)。現(xiàn)代藥理學(xué)表明[15]，黃芪可降低血小板黏附率，改善血液流變學(xué)，川芎抑制血小板聚集，目前在抗血栓治療中常用。這也可能是靜脈血栓方抗凝效果顯著的原因。炎癥及氧化應(yīng)激也參與DVT形成，全身炎癥反應(yīng)可激活凝血系統(tǒng)，引起血栓形成；氧化應(yīng)激的顯著增強也能損傷血管內(nèi)皮細胞，促進血小板黏附，加速血栓形成[16-17]。本研究中，模型對照組血清TNF-α、IL-6及MDA水平高于陽性藥物組及各劑量組，各劑量組隨劑量的升高而降低；模型對照組血清SOD水平低于陽性藥物組及各劑量組，低劑量組則低于高劑量組；且高劑量組與陽性藥物組上述指標(biāo)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。提示靜脈血栓方還具有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，且高劑量靜脈血栓方的抗炎、抗氧化應(yīng)激效果與利伐沙班相近[18]?？紤]與紅花、三七、赤芍等中藥材具有抗炎、抗氧化作用，對抑制炎癥、減輕氧化應(yīng)激具有良好功效有關(guān)[19-20]。

綜上所述，靜脈血栓方對防治股骨骨折術(shù)后DVT療效良好，可通過抗凝、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用減少血栓形成，且高劑量靜脈血栓方療效肯定，能進一步降低患者血栓風(fēng)險。