HPLC波長(zhǎng)切換法測(cè)定不同產(chǎn)地紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量

時(shí)向利，朱 倩

（1.江蘇康緣醫(yī)藥商業(yè)有限公司，江蘇連云港 222000；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222000）

紫菀為菊科植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根和根莖，具有潤(rùn)肺下氣、消痰止咳之功效，用于痰多喘咳、新久咳嗽、勞嗽咳血[1]。紫菀為許多常用中藥復(fù)方制劑的處方藥味之一，2020年版《中國(guó)藥典》收載的含紫菀的中藥復(fù)方制劑有二十余個(gè)，如止咳寶片、蛤蚧定喘丸、小兒肺咳顆粒和二母安嗽丸等，臨床上廣泛用于治療哮喘、咳嗽和肺癌等疾病的治療[2-4]。紫菀中主要含有三萜類(lèi)、蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸及酚類(lèi)化學(xué)成分[5-6]，紫菀含量測(cè)定方面的文獻(xiàn)報(bào)道有紫菀酮的含量測(cè)定[7]、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和香豆素類(lèi)成分的含量測(cè)定[8]，未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定三萜類(lèi)成分和黃酮類(lèi)成分的含量方法報(bào)道。本文以紫菀中特有的三萜類(lèi)化學(xué)成分紫菀酮和黃酮類(lèi)成分芹菜素、槲皮素為對(duì)象，采用波長(zhǎng)切換的方法建立同時(shí)測(cè)定紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮含量的方法，研究不同產(chǎn)地紫菀中3種成分的含量，為完善紫菀質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 儀器和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器；梅特勒MS105DU 型電子分析天平；德意生040S 型超聲波清洗機(jī)。

芹菜素（批號(hào)111901-202004，含量以99.4%計(jì)）、槲皮素（批號(hào)100081-201610，含量以99.1%計(jì)）和紫菀酮（批號(hào)111581-201806，含量以99.4%計(jì)），中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、磷酸為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇為分析純。

28批紫菀藥材產(chǎn)地為河北、安徽、陜西、四川等地，具體信息如下：樣品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，產(chǎn)地為河北安國(guó)；樣品S8，產(chǎn)地為河北定州；樣品S9、S10，產(chǎn)地為河北祁州；樣品S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17，產(chǎn)地為安徽亳州；樣品S18、S19，產(chǎn)地為安徽六安；樣品S20，產(chǎn)地為四川康定；樣品S21、S22，產(chǎn)地為四川德陽(yáng)；樣品S23，產(chǎn)地為四川綿陽(yáng)；樣品S24、S25，產(chǎn)地為陜西西安；樣品S26，產(chǎn)地為湖北蘄春；樣品S27，產(chǎn)地為湖北蘄春；樣品S28，產(chǎn)地為湖北宜昌。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1% 磷酸溶液；梯度洗脫，0～5min：15% 乙 腈；5～22min：15% →32% 乙腈；22～30min：32% →96% 乙 腈；30～55min：96%乙腈；柱溫：40 ℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～30min 設(shè)為360nm（測(cè)定槲皮素和芹菜素），30～55min 設(shè)為200nm（測(cè)定紫菀酮）；進(jìn)樣量為10μL。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

混合對(duì)照品溶液：取芹菜素、槲皮素和紫菀酮對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成混合對(duì)照品溶液，其中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的濃度分別為50μg/mL、80μg/mL 和80μg/mL。

供試品溶液：取紫菀藥材粉末約2g，精密稱(chēng)定，轉(zhuǎn)移至帶塞的三角瓶中，精密量取甲醇50mL 加入三角瓶中，稱(chēng)重，浸泡2h，超聲處理50min，放冷后再次稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，靜置，取上清液離心，即得。

2.3 精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6針。計(jì)算6針進(jìn)樣色譜圖中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的峰面積RSD，結(jié)果分別為0.98%、0.84%和1.20%，表明儀器精密度良好。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

分別稱(chēng)取芹菜素、槲皮素和紫菀酮對(duì)照品13.25mg、17.89mg 和20.25mg，置于100mL 容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇使溶解后稀釋至刻度，記為X1溶液；將X1溶液用甲醇逐倍稀釋得X2、X3、X4和X5溶液。分別精密吸取X 5、X 4、X 3、X 2和X 1溶液各10μL進(jìn)樣測(cè)定。用峰面積對(duì)濃度（μg/mL）進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果如下。

芹菜素：回歸方程Y=15.0101X+11.7500，r=0.9999，線(xiàn)性范圍（μg/mL）：8.23～131.71。槲皮素：回歸方程Y=17.6951X+20.7500，r=0.9998，線(xiàn)性范圍（μg/mL）：11.08～177.29。紫菀酮：回歸方程Y=7.1732X+3.7083，r=1.0000，線(xiàn)性范圍（μg/mL）：12.58～201.29。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取編號(hào)為S1的紫菀藥材粉末，制備一份供試品溶液，于室溫條件下放置0、4、8、12、16和24h 時(shí)，進(jìn)樣分析。計(jì)算6個(gè)時(shí)間點(diǎn)所得圖譜中芹菜素、槲皮素和紫菀酮峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.96%、1.52%和1.88%，表明在室溫條件下供試品溶液放置24h 穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取編號(hào)為S1的紫菀藥材粉末6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算每份樣品中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量和6 份樣品的平均含量。結(jié)果6份供試品中，芹菜素、槲皮素和紫菀酮的平均含量分別為1.42mg/g（RSD=1.63%）、1.74mg/g（RSD=1.48%）和2.09mg/g（RSD=2.02%）。

2.7 回收率試驗(yàn)

取編號(hào)為S1的紫菀藥材粉末，稱(chēng)取9份，每份取約1g，精密稱(chēng)定，分成3組，每組3份，分別加入相當(dāng)于樣品含量50%、100%和150%的混合對(duì)照品母液（混合對(duì)照品母液中芹菜素、槲皮素和紫菀酮濃度分別為0.716 7mg/mL、0.907 8mg/mL 和1.075 2mg/mL，每組加入體積分別為1.0mL、2.0mL 和3.0mL），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算結(jié)果。芹菜素、槲皮素和紫菀酮含量的回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果（n=9）

2.8 樣品測(cè)定

取表1中28批紫菀藥材粉末進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算28批紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮3種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫菀中3種成分的含量（單位：%，n=2）

從表4，芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量分別為0.06%～0.21%、0.12%～0.28%、0.09%～0.41%。28 批紫菀藥材中有3批樣品紫菀酮含量未達(dá)到2020年版《中國(guó)藥典》要求，紫菀酮含量最高的是安徽和四川兩省的紫菀藥材。從芹菜素、槲皮素和紫菀酮3種成分的均一程度來(lái)分析，剔除紫菀酮含量不符合要求的3批次樣品后，均一性最好的為紫菀的道地產(chǎn)區(qū)河北（河北省9批次紫菀中3種指標(biāo)成分含量的RSD 均不大于20%），其次為作為主要種植地的安徽。

3 討論

采用全波長(zhǎng)掃描方式，采集芹菜素、槲皮素和紫菀酮在190～400nm 的吸收光譜，結(jié)果芹菜素和槲皮素360nm 有最大吸收，紫菀酮為一種三萜類(lèi)化合物，分子骨架中無(wú)共軛基團(tuán)，只有紫外末端吸收。為了使3種成分均能較好地檢出，測(cè)定時(shí)選擇波長(zhǎng)切換的方法，設(shè)定360nm 測(cè)定槲皮素和芹菜素的含量、200nm測(cè)定紫菀酮的含量。

以紫菀藥材中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的提取率為考察對(duì)象，對(duì)是否浸泡、浸泡時(shí)間、提取方式和提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果在提取前先浸泡2h 提取效果較好，回流提取和超聲提取兩種方式提取效率相當(dāng)，因此選擇操作簡(jiǎn)便的超聲提??；甲醇作為提取溶劑的效果優(yōu)于乙醇，故選擇甲醇作為提取溶劑。

本文建立了波長(zhǎng)切換的方法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地紫菀中芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量，并進(jìn)行了完整的方法學(xué)驗(yàn)證。從測(cè)定的28批紫菀藥材芹菜素、槲皮素和紫菀酮的含量可知，剔除紫菀酮含量不符合要求的3批次樣品后，紫菀的地道產(chǎn)區(qū)河北和主要種植地安徽均一性?xún)?yōu)于其他產(chǎn)地，不同產(chǎn)地的紫菀藥材可能受生長(zhǎng)環(huán)境和采收季節(jié)的影響，存在良莠不齊的現(xiàn)象，甚至還有不符合2020年版《中國(guó)藥典》要求的藥材，應(yīng)引起重視。