黃芪多糖對小鼠食管癌前病變的影響及機制研究

夏秀麗，趙樹山，李 云，宋曉明，徐 珊，程麗敏，李 森，徐 超

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

食管癌是全球范圍內(nèi)較常見的惡性腫瘤之一，約占癌癥患者的3.2%，我國為食管癌高發(fā)地區(qū)[1-2]。食管癌在中醫(yī)屬于“噎膈”范疇，憂思暴怒、瘀血頑痰、氣機郁滯是其主要病機。黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫、味甘，具有補氣固表、托毒排膿等功效。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)為中藥黃芪的主要有效成分，既往研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠通過提高免疫力改善宮頸癌和卵巢上皮性癌患者療效[3-4]；能夠通過調(diào)控信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transduction and activator of transcription factor 3，STAT3)、缺氧誘導因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達對口腔鱗癌、肝癌、胃癌均具有一定的抑制作用[5-7]。本研究旨在探討黃芪多糖對小鼠食管癌前病變的影響及其機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性C57BL/6小鼠96只，5周齡、體重(20±2)g，購自河北醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2019-001]，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(24±1)℃、相對濕度50%～70%，自由進食、飲水。本研究獲得我院倫理委員會審核批準。

1.2 藥物與試劑 注射用黃芪多糖(規(guī)格：100 mg/瓶)購自天津賽諾制藥有限公司(批號：20200419)；全反式維甲酸、4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)購自美國Sigma公司(批號：38H2079、SLBD6960)；CD3+、CD4+、CD8+T細胞和自然殺傷細胞(NK)細胞熒光素標記單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(批號：BF0159、BF0174、BF0235、EC6872)；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自日本Takara公司(批號：20A0127C、AI61180A)；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Thermo公司(批號：K1622)；二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(批號：102517180413)；STAT3、HIF-1α、VEGF、β-actin抗體購自北京博奧森生物科技有限公司(批號：bs-55208R、bs-20399R、bs-1313R、bsm-33036M)；增強型化學發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Millipore公司(批號：WBKLS0500)。

1.3 主要儀器 RM2235型石蠟切片機(德國Leiea公司)；BX53型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；FACS Cailobur型流式細胞儀(美國BD公司)；VELO18R型高速低溫離心機(英國Dynamica公司)；EMUC7型超薄切片機(德國Leica公司)；H-7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；FSH-2型高速勻漿機(江蘇金壇市佳美儀器有限公司)；DU640型蛋白核酸分析儀(美國Beckman公司)；ABI7500型RT-PCR儀(美國Thermo公司)；Power Pac型電泳儀(美國 Bio Rad公司)；VE-186型轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組、造模：適應性飼養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法將144只實驗用小鼠分為四組：正常組，模型組，黃芪多糖組和全反式維甲酸組，每組36只。除正常組外，其他組均參照紀曉花等[8]報道的方法，通過喂養(yǎng)4NQO溶液(100 μg/ml)15周誘導制備食管癌前病變小鼠模型。造模完成后，分別取正常組和模型組2只小鼠，頸椎脫臼處死后迅速剝?nèi)∈彻芙M織，行HE染色，通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠食管上皮組織未見異常，模型組食管上皮組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂、細胞數(shù)量增多、出現(xiàn)異型細胞等病變，提示造模成功(圖1)。

圖1 正常組和模型組食管上皮組織病理學改變(HE染色，×400)

1.4.2 給藥：造模完成后，黃芪多糖組50 mg/kg，1次/d，灌胃給藥[相當于人臨床劑量，換算公式：小鼠劑量(mg/kg)=12.27×人臨床劑量(mg)/體重(kg)，人體重以60 kg計算]；全反式維甲酸組7.5 mg/kg，每2 d 1次，灌胃給藥[8]；正常組和模型組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液，1次/d,共10周。

1.4.3 HE染色法觀察食管上皮組織病理學改變：治療完成后，每組隨機取12只小鼠，頸椎脫臼處死后，立即剝?nèi)∈彻芙M織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，去除筋膜，縱向切開、平鋪、卷曲后置于4%多聚甲醛中固定72 h，經(jīng)石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、展片處理后，行常規(guī)HE染色，封片后通過光學顯微鏡觀察食管上皮組織病理學改變。參照胡艷華[9]報道的方法，由病理科醫(yī)生對食管癌上皮組織病變進行判斷。①正常：基底膜完整，上皮層薄厚均勻、細胞排列整齊；②單純增生：基底膜完整，上皮層細胞排列整齊，但細胞數(shù)量增多、無異型細胞；③癌前病變：基底膜完整，上皮層組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞數(shù)量增多、出現(xiàn)異型細胞；④癌變：基底膜完整，上皮層全部結(jié)構(gòu)紊亂，細胞呈現(xiàn)多角形，胞核深染、位于細胞中央，可見病理性核分裂像。

1.4.4 透射電子顯微鏡觀察食管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變：治療完成后，每組隨機取12只小鼠，頸椎脫臼處死后，立即剝?nèi)∈彻芙M織，修飾成1 mm×1 mm×1 mm小塊后置于4%戊二醛溶液中固定2 h、四氧化鋨固定1.5 h，梯度丙酮溶液脫水、環(huán)氧樹脂包埋后行50 nm超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛依次染色30 min后，通過透射電子顯微鏡觀察食管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5 流氏細胞儀檢測血液中CD3+、CD4+、CD8+T細胞和NK細胞比例：取各組剩余的12只小鼠，摘除眼球取血2 ml，4 ℃、3000 r/min離心10 min取沉淀，分別加入CD3+、CD4+、CD8+T細胞和NK細胞熒光素標記單克隆抗體，4 ℃孵育1 h，加入1 ml細胞洗液，4 ℃、300 g離心5 min取沉淀，加0.5 ml細胞洗液、將沉淀吹打均勻后，通過流式細胞儀測定血液中CD3+、CD4+、CD8+T細胞和NK細胞比例。

1.4.6 RT-PCR法檢測食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達：頸椎脫臼處死后，立即剝?nèi)∈彻苌掀そM織，取100 mg食管上皮組織、提取并純化總RNA，通過核酸分析儀檢測RNA濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行RT-PCR擴增反應，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)，4 ℃ 5 min終止反應，然后通過凝膠分析儀成像。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算mRNA相對表達量。STAT3、HIF-1α、VEGF、β-actin的RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.7 Western blot法檢測食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達：取食管上皮組織100 mg，加入5倍量4 ℃裂解液研磨勻漿，4 ℃、12000 r/min離心30 min取上清液，通過BCA法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PDVF膜、5%牛血清白蛋白封閉2 h，STAT3(1∶500)、HIF-1α(1∶800)、VEGF(1∶500)、β-actin(1∶1000)抗體4 ℃孵育12 h，洗膜后IgG二抗(1∶2000)37 ℃孵育2 h，洗膜后ELC顯色，以目標蛋白與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。本研究計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊的兩兩比較采用Dunnett T3法；計數(shù)資料比較以[例(%)]表示，采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠食管上皮組織病理學改變比較 正常組小鼠食管上皮組織基底膜完整，上皮層薄厚均勻、細胞排列整齊；模型組小鼠食管上皮組織呈現(xiàn)黏膜充血、色澤灰暗，上皮層組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞數(shù)量增多、出現(xiàn)異型細胞，可見點狀或條狀白色斑塊不典型增生灶、原位癌病灶等病理學改變；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組食管上皮組織病理學改變明顯改善，其中黃芪多糖組病變未超過上皮層下1/3處、未見原位癌病灶，效果優(yōu)于全反式維甲酸組。正常組小鼠食管上皮組織未見癌前病變或癌變；模型組食管上皮組織癌變率66.67%；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組癌變率顯著降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組癌變率顯著降低(P<0.05)。見表2(圖2)。

圖2 各組小鼠食管上皮組織病理學改變(HE染色，×400)

表2 各組小鼠食管上皮組織病理學改變比較[例(%)]

2.2 各組小鼠食管上皮組織細胞超微結(jié)構(gòu)改變比較 正常組小鼠食管上皮組織細胞排列整齊，胞核居中，核膜核仁清晰；模型組小鼠食管上皮組織基底細胞增生多層，細胞數(shù)量增多、排列紊亂、胞核大小不等、核分裂相增多等超微結(jié)構(gòu)改變；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組食管上皮組織細胞超微結(jié)構(gòu)改變明顯改善，其中黃芪多糖組效果優(yōu)于全反式維甲酸組(圖3)。

圖3 各組小鼠食管上皮組織細胞透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)改變(×10000)

2.3 各組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+T細胞和NK細胞比例比較 與正常組比較，模型組小鼠血液中CD3+、CD4+T細胞和NK細胞比例均降低，CD4+/CD8+比值降低，CD8+T細胞比例均升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組CD3+、CD4+T細胞和NK細胞比例均升高，CD4+/CD8+比值升高，CD8+T細胞比例降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組CD3+、CD4+T細胞和NK細胞比例均升高，CD4+/CD8+比值升高，CD8+T細胞比例降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+ T細胞和NK細胞比例比較

2.4 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達比較 見表4。與正常組比較，模型組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)。

表4 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA表達比較

2.5 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達比較 與正常組比較，模型組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖組和全反式維甲酸組STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)；與全反式維甲酸組比較，黃芪多糖組STAT3、HIF-1α、VEGF 蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)。見表5(圖4)。

表5 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達比較

圖4 各組小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表達

3 討 論

食管癌是我國最常見的上消化道惡性腫瘤，其中超過90%的患者病理分型屬于鱗狀細胞癌。食管癌鱗狀細胞癌的發(fā)生及進展是一個多階段的漸進過程，主要經(jīng)歷單純增生、癌前病變、癌變等階段，其中癌前病變以異型細胞層不超過食管上皮層下1/3處、上皮層下1/3至2/3處、超過上皮層下2/3處分為輕、中、重度，癌變過程分為原位癌、浸潤性鱗狀細胞癌兩個階段。流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，從食管輕度癌前病變發(fā)展為原位癌，需要約5～10年時間[10]。范煥芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)在癌前病變階段給予適當藥物干預，能夠誘導食管上皮細胞向正常細胞分化，降低癌變率。

中藥黃芪具有補氣固表、托毒排膿、托瘡生肌等功效，常用于氣虛乏力、久瀉脫肛、子宮脫垂等癥的治療。黃芪多糖為黃芪的主要活性成分，對食管癌細胞生長具有抑制作用[12]、對食管癌細胞化療敏感性具有改善作用[13]，但黃芪多糖是否對食管癌前病變具有抑制作用尚未見文獻報道。4NQO是一種水溶性喹啉衍生物致癌劑，其代謝產(chǎn)物4-羥氨基喹啉-1-氧化物與DNA形成加合物，使第7號染色體第12位密碼子發(fā)生嘌呤-腺苷轉(zhuǎn)換，導致DNA突變而致癌[14]。4NQO飲水法誘導制備的食管癌小鼠模型為鱗狀細胞癌，較符合人類食管癌90%以上為鱗狀細胞癌的病理特點，并且該方法成模自然、操作簡單，是國內(nèi)外普遍認可的食管癌動物模型制備方法[15]。全反式維甲酸是一種腫瘤細胞分化逆轉(zhuǎn)劑，具有抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞向正常細胞分化的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，食管癌前病變模型小鼠食管上皮組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)異型細胞、不典型增生灶、原位癌病灶等病理學改變；食管上皮細胞可見胞核大小不等、核分裂相增多等超微結(jié)構(gòu)改變，與紀曉花等[8]報道一致。經(jīng)黃芪多糖治療能夠明顯改善食管癌前病變小鼠食管上皮組織病理學改變和上皮細胞超微結(jié)構(gòu)病變，癌變率顯著降低，黃芪多糖組效果優(yōu)于全反式維甲酸組，提示黃芪多糖對小鼠食管癌前病變進展具有抑制作用。

免疫功能下降是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，因此提高食管癌患者機體免疫功能是改善其預后的有效途徑[17]。Chraa等[18]研究發(fā)現(xiàn)T細胞亞群和NK細胞在機體抗腫瘤免疫反應過程中揮著重要的調(diào)節(jié)作用。CD3+是T細胞成熟的標志，能夠反映T細胞總量；CD4+T細胞能夠輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體而殺傷腫瘤細胞；CD8+T細胞對細胞免疫具有負調(diào)控作用，表現(xiàn)為抑制免疫作用；CD4+/CD8+比值能夠反映機體免疫功能狀態(tài)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖治療能夠明顯提高食管癌前病變小鼠血液中CD3+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞比例并降低CD8+T細胞比例，提高CD4+/CD8+比值，并且黃芪多糖組對各指標的調(diào)控作用優(yōu)于全反式維甲酸組，提示黃芪多糖對食管癌小鼠細胞免疫功能具有改善作用。

血管新生是食管癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，為腫瘤組織生長供給養(yǎng)分、為癌細胞轉(zhuǎn)移提供通道。研究表明，若沒有新生血管，實體瘤體積不會超過2 mm[20]。STAT3是哺乳動物細胞中普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，對細胞增殖、分化、凋亡等具有重要的調(diào)控作用[21]。VEGF具有促進內(nèi)皮細胞增殖、分裂等生物學活性，是促進腫瘤組織血管生成最直接、最重要的細胞因子。STAT3能夠與VEGF啟動子特異位點結(jié)合而誘導VEGF轉(zhuǎn)錄表達。腫瘤細胞快速增殖導致局部乏氧、誘發(fā)HIF-1α表達，HIF-1α能夠誘導VEGF表達而增加腫瘤組織微血管密度；HIF-1α為STAT3的下游靶基因，因此，STAT3也能夠通過誘導HIF-1α表達而間接誘導VEGF轉(zhuǎn)錄表達[22]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪多糖治療能夠明顯降低食管癌前病變小鼠食管上皮組織STAT3、HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達，黃芪多糖組效果優(yōu)于全反式維甲酸組，這可能是黃芪多糖抑制小鼠食管癌前病變進展的重要機制。

綜上所述，黃芪多糖對小鼠食管癌前病變進展具有抑制作用，其機制可能與提高細胞免疫功能及抑制STAT3、HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄表達有關。本研究為黃芪多糖用于食管癌前病變的治療提供了理論依據(jù)。