280例孕晚期胎兒異常的羊膜腔穿刺情況、遺傳學檢測結(jié)果及妊娠結(jié)局分析

魯建央 魯才娟 詹欣 吳雅楓 翟洪波

羊膜腔穿刺術(shù)是最常用的有創(chuàng)性胎兒取材技術(shù)，通過獲取羊水細胞行細胞或分子遺傳學檢測，通常在孕16～24周進行，便于孕婦28周之前作出是否繼續(xù)妊娠的決定。新基因組時代，染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis,CMA）是胎兒結(jié)構(gòu)異常的首選分子遺傳學檢測方法，對比傳統(tǒng)的核型分析，CMA額外增加6%的拷貝數(shù)變異（copy number variants,CNVs）檢出率[1]。鑒于CMA的高分辨率，臨床意義不明的拷貝數(shù)變異（variants of uncertain clinical significance,VUS）檢出率也隨之增加[2]，給產(chǎn)前遺傳咨詢增添不少難度。本研究回顧性分析孕晚期選擇羊膜腔穿刺的280例胎兒資料，探討其指征、穿刺并發(fā)癥、遺傳學結(jié)果及妊娠結(jié)局，為孕晚期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常患者的咨詢及產(chǎn)前診斷方法的選擇提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2017年1月至2021年1月孕28周之后超聲發(fā)現(xiàn)胎兒異常，至浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科，經(jīng)遺傳咨詢后行羊膜腔穿刺的280例胎兒資料。孕婦年齡18～43（29.43±4.50）歲，孕周28～34（29.14±2.52）周。對高度懷疑單基因遺傳病的胎兒行家系全外顯子組測序（whole exome sequencing,WES）。納入標準：（1）孕周28～33+6周；（2）符合介入性產(chǎn)前診斷指征，且獲得孕婦知情同意；（3）夫妻雙方年齡≥18周歲。排除標準：（1）孕周＜28周；（2）符合介入性產(chǎn)前診斷指征，但孕婦選擇臍血穿刺。產(chǎn)前超聲異常包括超聲結(jié)構(gòu)畸形及非結(jié)構(gòu)異常[3]。超聲結(jié)構(gòu)畸形包括：（1）神經(jīng)系統(tǒng)畸形；（2）頭面部畸形；（3）呼吸系統(tǒng)畸形；（4）心血管系統(tǒng)畸形；（5）腹壁畸形；（6）消化系統(tǒng)畸形；（7）泌尿系統(tǒng)畸形；（8）骨骼系統(tǒng)畸形；（9）其他畸形（胎兒水腫及腫瘤）。非結(jié)構(gòu)異常包括：（1）軟指標陽性；（2）胎兒生長發(fā)育受限；（3）羊水量異常。所有胎兒父母均接受產(chǎn)前遺傳咨詢、簽署知情同意書，并同意將所得數(shù)據(jù)用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 在超聲實時引導下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水10 ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA提取及CMA分析 按照德國凱杰QIAamp DNA Blood mini kit（Qiagen）說明書提取羊水基因組DNA。采用單核苷酸多態(tài)性微陣列（SNP array）檢測平臺（Affymetrix），基于CytoScan750K Array芯片進行全基因組CNVs檢測。Chas 3.0軟件進行芯片數(shù)據(jù)的分析，以≥50個探針標記，≥100 kb的分辨率用于分析基因組CNVs。

1.2.3 成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3）基因檢測 采用Sanger測序技術(shù)對胎兒FGFR3基因c.1138G＞A/C位點進行檢測，明確胎兒是否攜帶該熱點致病突變，陽性結(jié)果重復驗證。

1.2.4 家系WES檢測 對高度懷疑單基因遺傳病的胎兒，通過高通量測序技術(shù)檢測22 000個基因的外顯子，對發(fā)現(xiàn)的突變采用Sanger測序進行位點驗證及家系驗證。

2 結(jié)果

2.1 孕晚期羊膜腔穿刺的指征分析 孕晚期羊膜腔穿刺的主要指征是超聲異常266例（95.0%），其中位于前3位的是神經(jīng)系統(tǒng)異常73例（27.4%）、泌尿系統(tǒng)異常57例（21.4%）、股骨短小32例（12.0%）。除超聲異常外的指征有14例（5.0%），詳見表1。

表1 孕晚期羊膜腔穿刺的指征分析

2.2 孕晚期羊膜腔穿刺的并發(fā)癥分析 孕晚期羊膜腔穿刺后發(fā)現(xiàn)胎死宮內(nèi)2例（0.7%）；早產(chǎn)3例（1.1%），其中1例穿刺操作后11 d早產(chǎn)，分娩前未得到CMA結(jié)果，詳見表2。

表2 孕晚期羊膜腔穿刺的并發(fā)癥分析

2.3 分子遺傳學檢測結(jié)果與妊娠結(jié)局

2.3.1 染色體畸變與妊娠結(jié)局 共檢出18例染色體畸變，檢出率為6.4%。其中致病性或可疑致病CNVs 14例，其他染色體異常4例（包括18三體1例、單親二倍體2例、46，XY/47，XYY 嵌合體1例）。除外1例性染色體嵌合，17例（94.4%）染色體畸變胎兒的孕婦選擇優(yōu)生引產(chǎn)，見表3。

表3 18例染色體畸變結(jié)果與妊娠結(jié)局

2.3.2 VUS與妊娠結(jié)局 共檢出19例VUS，檢出率為6.8%，其中雜合性缺失2例。13例（68.4%）選擇驗證親代來源，其中12例遺傳自父親或母親，僅1例為新發(fā)變異。最終胎死宮內(nèi)及早產(chǎn)各1例；因胎兒結(jié)構(gòu)畸形選擇優(yōu)生引產(chǎn)4例；活產(chǎn)13例，其中1例產(chǎn)前提示側(cè)腦室增寬，產(chǎn)后因特殊面容、多毛、連眉、發(fā)育遲緩，基因檢測確診“德朗熱綜合征”，余12例活產(chǎn)兒隨訪情況見表4。

表4 19例VUS與妊娠結(jié)局

2.3.3 單基因遺傳病 共檢出單基因遺傳病胎兒7例，檢出率為2.5%，選擇優(yōu)生引產(chǎn)6例，雙胎減胎術(shù)1例。5例因股骨短小行CMA+FGFR3基因c.1138G＞A/C位點檢測，均為FGFR3基因c.1138G>A雜合突變，診斷“軟骨發(fā)育不全”。1例孕29+3周超聲提示心臟多發(fā)橫紋肌瘤，羊水CMA+WES檢測提示TSC2基因錯義突變。1例孕28周超聲提示側(cè)腦室前角增寬0.6 cm，側(cè)腦室后角1.0 cm，MRI提示側(cè)腦室陳舊性出血，孕婦2014年因“胎兒宮內(nèi)窘迫”剖宮產(chǎn)一女嬰（夭折），訴有腦室增寬，2016年因“胎兒水腫”引產(chǎn)，結(jié)合病史，行CMA+WES檢測，結(jié)果提示JAM3基因c.712+2T＞A與c.813C＞G復合雜合致病性突變，分別遺傳自父親與母親。

3 討論

本研究顯示超聲結(jié)構(gòu)異常是孕晚期羊膜腔穿刺最主要的指征，占95.0%，前3位的分別是神經(jīng)系統(tǒng)異常（27.4%）、泌尿系統(tǒng)異常（21.4%）及股骨短?。?2.0%）。胎兒發(fā)育是一個動態(tài)發(fā)展的過程，部分遲發(fā)畸形在妊娠晚期才表現(xiàn)出來[4]。Yinon等[5]報道47例＜孕24周大排畸超聲正常、但孕晚期診斷神經(jīng)系統(tǒng)異常的胎兒，診斷孕齡中位數(shù)31.1周。Melcer等[6]研究57例＞24周因神經(jīng)系統(tǒng)異常引產(chǎn)的胎兒資料后得出結(jié)論：即使常規(guī)產(chǎn)檢，39%的神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒在妊娠晚期才可能被檢出。本研究中最常見的胎兒結(jié)構(gòu)異常是神經(jīng)系統(tǒng)異常，與胎兒發(fā)育的特點以及文獻報道的結(jié)果一致。Yi等[7]報道了943例側(cè)腦室增寬的胎兒診斷孕周為（23.8±8.2）周。除超聲結(jié)構(gòu)異常外，部分孕婦因害怕恐懼流產(chǎn)風險而主動選擇孕晚期介入性產(chǎn)前診斷[8]。對錯過羊膜腔最佳穿刺孕周的孕婦，一般建議臍靜脈穿刺，但該操作母胎損傷風險較大，技術(shù)要求高，存在胎兒丟失、穿刺失敗、胎盤出血、胎心過緩、臍帶血腫等[9]。國內(nèi)關于晚期羊膜腔穿刺的研究較少提到相關并發(fā)癥的發(fā)生率[10-12]。本研究280例晚期羊膜腔穿刺后早產(chǎn)3例，發(fā)生率1.1%，低于國外文獻報道（5.7%～6.6%）[13-14]。為降低早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)病率，晚期羊膜腔穿刺前是否使用糖皮質(zhì)激素仍未有定論[15]。多數(shù)研究認為中孕期單胎羊膜腔穿刺后胎兒丟失率＜0.5%[14,16]。本研究中胎死宮內(nèi)2例，發(fā)生率0.7%，略高于Daum等[13]報道的0.6%。孕晚期羊膜腔穿刺與中孕期相比是否增加胎兒丟失率，仍需更多高質(zhì)量的研究探討。

本研究應用CMA檢出14例致病或可疑致病CNVs，4例其他染色體異常，染色體畸變檢出率為6.4%。筆者還通過WES和FGFR3基因熱點突變檢測檢出了7例單基因遺傳病，檢出率為2.5%。對孕晚期超聲提示胎兒股骨生長停滯或彎曲的患者，選擇FGFR3基因熱點突變檢測有助于提高軟骨發(fā)育不全的基因診斷率[17]，且報告周期較短，可減少孕婦及家屬等待報告的時間。研究報道即使應用CMA技術(shù)，超過60%結(jié)構(gòu)畸形胎兒的病因仍不明確[18]。WES技術(shù)用于胎兒結(jié)構(gòu)畸形的病因?qū)W研究是目前的熱點，在核型和CMA檢測陰性時，WES增加8.5%～19.0%的致病性基因變異檢出率[18-20]。這些致病性基因變異更常見于胎兒心臟畸形、骨骼系統(tǒng)畸形、淋巴水囊瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形和腎臟畸形。2020年美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會建議，對產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒，核型和CMA檢測陰性時，可考慮WES檢測[21]。本研究2例應用WES技術(shù)案例，均在發(fā)現(xiàn)胎兒畸形后數(shù)天選擇優(yōu)生引產(chǎn)，因此報告周期的壓力較小。1例WES結(jié)果提示結(jié)節(jié)性硬化，這是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)皮膚綜合征，臨床表型包括：癲癇發(fā)作和智力減退、面部皮脂腺瘤等，胎兒期主要表現(xiàn)為心臟橫紋肌瘤[22]。1例WES結(jié)果提示JAM3基因復合雜合致病性變異，可導致出血性腦損傷、室管膜下鈣化和白內(nèi)障，是一種嚴重的常染色體隱性遺傳疾病[23]。臨床上，由于WES檢測費用高昂，報告周期較長，胎兒宮內(nèi)表型的限制性及結(jié)果解釋的復雜性，產(chǎn)前診斷領域尚未全面推廣，仍需更多高質(zhì)量的臨床研究。

VUS是指人群中不常見的CNVs，沒有或很少量的證據(jù)可用來評估臨床致病性。VUS因臨床表型的不確定性，可能增加孕婦的焦慮壓力，難以作出是否繼續(xù)妊娠的抉擇。VUS的檢出受檢測平臺、檢測指征、報告標準等因素影響，文獻報道檢出率為1.4%～12.3%[24-27]。本研究VUS檢出率為6.8%，與既往研究基本一致。產(chǎn)前咨詢中，建議孕婦驗證VUS來源非常重要，這影響著孕婦是否繼續(xù)妊娠的決定。Chen等[28]發(fā)現(xiàn)拒絕驗證VUS來源的孕婦與驗證組相比，更傾向選擇引產(chǎn)，差異有統(tǒng)計學意義，但兩組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義。由于胎兒表型限制性，VUS的產(chǎn)前咨詢是個巨大的挑戰(zhàn)。通常遺傳自表型正常父母的CNVs筆者認為胎兒出現(xiàn)臨床表型的概率較小，屬于家族性良性變異可能性較大。CNVs的大小、內(nèi)含的基因、遺傳模式等有助于辨別更偏向良性還是致病性。然而一些CNVs具有表現(xiàn)度及外顯率差異，即使父母表型正常，也不能預測胎兒的臨床結(jié)局[27]。建議由經(jīng)驗豐富的專家針對VUS進行咨詢，并能提前查閱數(shù)據(jù)庫，跟胎兒父母詳細解釋數(shù)據(jù)庫中基因型表型的相關性[1]，避免盲目引產(chǎn)。VUS胎兒分娩后，仍需兒科隨訪，觀察是否出現(xiàn)相應疾病癥狀以便及時診治。

本研究回顧分析了280例孕晚期因胎兒異常行羊膜腔穿刺的資料，發(fā)現(xiàn)超聲結(jié)構(gòu)異常是最主要的穿刺指征；晚期羊膜腔穿刺術(shù)后早產(chǎn)發(fā)生率1.1%，胎死宮內(nèi)發(fā)生率0.7%，染色體畸變檢出率6.4%，VUS檢出率6.8%，CMA基礎上應用WES技術(shù)有助于提高陽性檢出率。本研究結(jié)果為孕晚期超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒的產(chǎn)前診斷提供了一定的臨床參考價值，對害怕臍血穿刺的孕婦，可考慮晚期羊膜腔穿刺。本研究的不足之處在于，研究對象進行了羊水CMA檢測，未做羊水細胞培養(yǎng)，將在后續(xù)的工作中探索孕晚期羊水細胞培養(yǎng)的條件及成功率。