UBE2B在食管癌組織中的表達及其與上皮-間質轉化和轉移的關系

施谷平 孫宇

食管癌是我國常見的一種消化道腫瘤，具有惡性程度高、易復發(fā)、預后差等臨床特點[1]。近年來，雖然食管癌的綜合治療水平得到了明顯提升，但患者的生存率仍然較低[2]。研究證實食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段的復雜過程，多種癌基因和抑癌基因異常表達參與其中[3-4]。因此，深入研究食管癌的分子機制具有十分重要的作用。泛素結合酶E2B（Ubiquitin conjugating enzyme E2 B,UBE2B）是泛素化家族成員之一[5]。越來越多的研究證實，UBE2B參與多種人類惡性腫瘤，如口腔鱗狀細胞癌、直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)病過程[6-8]。然而，目前有關UBE2B在食管癌中的作用研究較少見。本研究主要探討UBE2B在食管癌中的表達情況及其臨床意義，并且初步研究UBE2B在食管癌中的生物學功能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 包含34對食管癌組織及配對癌旁組織的食管癌組織芯片（EC-1402）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。人食管癌細胞株Eca-109購自中科院上海細胞庫。UBE2B抗體、上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）抗體、神經性鈣黏附蛋白（N-cadherin）抗體、Slug抗體、Snail抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記羊抗人的IgG、支原體檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、硝酸纖維素膜均購自上海碧云天生物技術有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、Transwell小室（8 μm孔）均購自美國Corning公司；FBS購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000、Matrigel膠、蛋白酶與磷酸酶抑制劑均購自美國Thermo Fisher公司；BCA定量試劑盒購自美國BIO-RAD公司；UBE2B特異性敲低靶向siRNA及對照siRNA均購自上海生工生物工程有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；倒置熒光相差顯微鏡（型號：CKX53）購自日本Olympus公司；實時熒光定量PCR系統(tǒng)（型號：ABI Step One Plus）購自美國ABI公司；垂直電泳儀（Power Pac Basic）和蛋白轉印模塊（Mini Trans-Blot Cell）均購自美國Bio-Rad公司；低溫離心機（型號：Thermo Scientific MicroCL 21R）購自美國Thermo Fisher公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號：BIO-RAD Gel Doc XR+）購自美國BIO-RAD公司。

1.2 生物信息分析 從癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov）下載食管癌患者臨床信息及轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-Seq）數(shù)據(jù)，利用R語言進行分析。比較食管癌組織與正常組織中UBE2B mRNA的表達差異。根據(jù)表達中值將食管癌樣本分為UBE2B高表達組和低表達組，比較兩組患者生存差異。

1.3 UBE2B蛋白表達檢測 采用免疫組化法。組織芯片置于65℃烘箱中烤片后，經二甲苯和梯度乙醇脫蠟、脫水，0.01 mol/L檸檬酸（pH=6.0）緩沖液高壓修復抗原8 min，3% H2O2去除內源性過氧化物酶10 min，滴加UBE2B抗體（1∶200），4℃孵育過夜，PBS沖洗。二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗人的IgG，37℃孵育30 min，PBS沖洗。滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，脫色，返藍，脫水封固。結果判讀采用雙盲法：由兩位病理科醫(yī)師獨立雙盲閱片，結果取其平均值。每張組織切片在高倍鏡下（×400）隨機選取至少5個視野，每個視野計算＞200個細胞進行免疫染色結果判定。每張切片進行半定量記分，最終積分=細胞染色強度×陽性細胞百分比。細胞染色強度計分：無著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比計分：＜5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分；最終積分0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.4 細胞轉染 人食管癌細胞株Eca-109培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。當細胞融合度達到80%時傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。定期對細胞進行支原體感染的檢測，從而保證細胞正常生長。將Eca-109細胞分別轉染特異性靶向UBE2B的siRNA以敲減UBE2B的表達（si-UBE2B組）和非靶向對照siRNA（sicontrol組）。質粒轉染按照Lipofectamine 3000說明書進行，具體如下：將Eca-109細胞接種到六孔板中培養(yǎng)，當細胞密度達到70%～80%時進行轉染。首先將培養(yǎng)基分別與si-UBE2B以及si-control混合，同時將培養(yǎng)基與Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑混合，室溫靜置5 min，隨后將si-UBE2B培養(yǎng)基混合液及si-control培養(yǎng)基混合液分別與Lipofectamine 3000培養(yǎng)基混合液相混合，混勻后室溫靜置5 min。將上述兩組混合液分別加入六孔板中，繼續(xù)放入37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集轉染后的兩種細胞進行下一步實驗。

1.5 細胞遷移、侵襲能力檢測 采用Transwell小室實驗。遷移實驗小室膜無Matrigel膠覆蓋，而侵襲實驗小室膜有Matrigel膠覆蓋。收集轉染成功的Eca-109細胞，并用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，將100 μl細胞懸液（含5×104個細胞）接種在Transwell小室的上室中，下室則放置含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集染色細胞。Transwell小室先用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，用0.1%結晶紫染色30 min，PBS清洗后干燥，置于顯微鏡下觀察，選取4個低倍視野（×100）拍照并進行細胞計數(shù)，計算平均值。

1.6 細胞UBE2B及上皮-間質轉化標志蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Slug和Snail）表達水平檢測 采用Western blot法。將轉染成功的Eca-109細胞，移去培養(yǎng)基后，PBS清洗3遍。將培養(yǎng)皿放置冰上，加入適量RIPA細胞裂解液裂解，使用細胞刮收集蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。樣品蛋白經100℃高溫變性后放入-80℃冰箱備用。將蛋白樣經過10%SDS-PAGE電泳后，轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗UBE2B抗體（1∶1 000）、E-cadherin抗體（1∶1 000）、N-cadherin抗體（1∶1 000）、Slug抗體（1∶1 000）、Snail抗體（1∶1 000）。4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，通過ECL化學發(fā)光法，在成像系統(tǒng)中掃描并分析結果。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用Graphpad Prim 6.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管癌組織和正常組織中UBE2B mRNA表達水平及總體生存率比較 生物信息分析結果顯示，與正常組織比較，食管癌組織中UBE2B mRNA表達水平較高（P＜0.01），見圖1a。生存分析結果顯示UBE2B高表達組患者總體生存率明顯低于UBE2B低表達組（P＜0.01），見圖1b。

圖1 食管癌組織和正常組織中UBE2B mRNA表達水平及總體生存率比較（a：食管癌組織和正常組織中UBE2B mRNA表達水平比較，*P＜0.01；b：食管癌組織中UBE2B高表達組和低表達組患者總體生存率比較）

2.2 食管癌組織和正常組織中UBE2B蛋白的表達比較 組織芯片免疫組化結果顯示，食管癌組織中UBE2B蛋白陽性表達率為76.47%（26/34），高于正常組織的29.41%（10/34），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.1，P＜0.01），見圖2。

圖2 食管癌組織和正常組織中UBE2B蛋白的表達（免疫組化染色）

2.3 si-UBE2B組和si-control組細胞遷移和侵襲能力比較 與si-control組比較，si-UBE2B組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯降低（均P＜0.01），見圖3和表1。

圖3 si-UBE2B組和si-control組遷移和侵襲細胞的染色圖

表1 si-UBE2B組和si-control組細胞遷移和侵襲能力比較（個）

2.4 si-UBE2B組和si-control組細胞上皮-間質轉化標志蛋白表達水平比較 與si-control組比較，si-UBE2B組細胞上皮標志物E-cadherin明顯升高，而間質標志物N-cadherin、Slug和Snail均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表2和圖4。

表2 si-UBE2B組和si-control組細胞上皮-間質轉化標志蛋白表達水平比較

圖4 si-UBE2B組和si-control組細胞上皮-間質轉化標志蛋白表達的電泳圖

3 討論

食管癌在全球癌癥相關死亡原因中排名第6位，嚴重威脅人類健康[9]。我國是食管癌高發(fā)國，食管癌患者主要集中在河南、河北等中原地區(qū)。食管癌主要分為食管鱗狀細胞癌和食管腺癌2種主要病理類型，我國絕大部分食管癌為食管鱗狀細胞癌[1,10]。近年來，隨著早期診斷、根治性手術和術后輔助治療的快速發(fā)展，我國食管癌患者預后有了一定的改善，但總體5年總生存率僅為20%～40%[2]。食管癌患者預后差主要是由于早期轉移和復發(fā)。研究表明上皮-間質轉化是促進食管癌細胞侵襲和轉移的重要通路[11-12]。因此，迫切的需要從分子水平研究食管癌的發(fā)生及其轉移的分子機制，為食管癌的早期診斷及靶向治療提高新的方向。

UBE2B是泛素結合酶E2家族的成員，參與細胞的分化、周期和代謝等多種生物功能[13-15]。越來越多的研究證實，UBE2B參與了腫瘤的發(fā)病過程。在結直腸癌中，UBE2B的異常高表達降低了腫瘤細胞對放療的敏感性，影響腸癌患者的預后[7]。在口腔癌中，miR-455-5p通過UBE2B參與腫瘤的發(fā)展過程[6]。UBE2B通過調節(jié)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶泛素化水平影響鼻咽癌細胞對化療的敏感性[16]。但在食管癌中尚未研究報道。本研究中，首先應用生物信息分析技術分析TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌RNA-Seq數(shù)據(jù)。分析結果顯示UBE2B mRNA在食管癌組織中異常高表達，并且與不良生存預后顯著相關。為了進一步驗證上述分析結果，本研究應用食管癌組織芯片進行免疫組化實驗，實驗結果再次證實了UBE2B在食管癌組織中異常高表達。免疫組化結果和TCGA生物信息分析結果相互佐證了UBE2B在食管癌中發(fā)揮了癌基因的作用，促進食管癌的發(fā)生、發(fā)展。為了進一步研究UBE2B的生物學功能，siRNA用于敲低食管癌細胞Eca-109細胞UBE2B的表達。生物學功能實驗表明，敲低UBE2B能夠顯著抑制Eca-109細胞的遷移能力。進一步深入研究，本研究發(fā)現(xiàn)敲低UBE2B能夠顯著增加上皮標志物E-cadherin蛋白的表達，降低間質蛋白標志物Slug、Snail和N-cadherin蛋白的表達。因此，UBE2B在食管癌中發(fā)生、發(fā)展中扮演了癌基因的重要角色。

綜上所述，UBE2B異常高表達是食管癌患者生存的獨立影響因素，有望成為判斷預后的分子靶標。UBE2B主要通過調控上皮-間質轉化過程促進食管癌的轉移，為食管癌的治療提高了新的思路。