lncRNA RP11-680F8.1在肺癌組織中的表達(dá)及對肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

張雁飛 吳中杰 胡奕 丁聰毅

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[1]。盡管近年來手術(shù)切除、免疫治療、化療、放療等肺癌治療方式得到不斷改進(jìn)，但是肺癌患者的預(yù)后仍較差[2]。因此，迫切需要尋求新的具有治療價值和預(yù)后監(jiān)測價值的分子靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）屬于非編碼RNA分子，長度＞200個核苷酸，其通過在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)特定基因譜的表達(dá)，影響細(xì)胞表觀遺傳信號傳導(dǎo)，從而參與各種細(xì)胞活動[3]。越來越多的研究顯示，lncRNA在肺癌的發(fā)生和進(jìn)展過程中起到關(guān)鍵作用，在肺癌組織和細(xì)胞系中表現(xiàn)為多種lncRNA表達(dá)水平的異常降低或升高[4-6]。根據(jù)Ensembl Release v105數(shù)據(jù)庫顯示，RP11-680F8.1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，長度為2 588個核苷酸。RP11-680F8.1在腫瘤特別是肺癌中的表達(dá)和作用尚未闡明。本研究通過分析RP11-680F8.1表達(dá)水平與肺癌患者總生存期和無病生存期的關(guān)系，檢測肺癌組織和細(xì)胞系中RP11-680F8.1的表達(dá)，構(gòu)建敲減RP11-680F8.1的肺癌細(xì)胞模型，探討RP11-680F8.1調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系、試劑和儀器 人肺癌細(xì)胞系H1650、A549、HCC1588、H1299、HCC827和正常肺泡上皮細(xì)胞系HPAEpiC均購自美國ATCC細(xì)胞培養(yǎng)中心。FBS、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和基質(zhì)膠均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物科技公司；抗RP11-680F8.1慢病毒、非靶向?qū)φ章《尽P11-680F8.1-WT載體、RP11-680F8.1-Mut載體、miR-NC、miR-195-5p均購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Transwell小室均購自美國Invitrogen公司；Ⅰ抗和Ⅱ抗叉頭框K1（forkhead box K1,FOXK1）、磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P）、磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B,p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）、磷酸化血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（phosphorylated serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1,p-SGK1）、beta肌動蛋白（beta actin,β-actin）均購自美國Santa Cruz公司。酶標(biāo)儀（型號：Multiskan?FC）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。凝膠成像儀（型號：ChemiDoc MP）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 臨床標(biāo)本 收集2021年2月至2022年1月嘉興市第一醫(yī)院心胸外科手術(shù)切除的肺癌組織及相應(yīng)癌旁組織32對，均經(jīng)至少2位病理科專家確診。所有標(biāo)本均冷凍保存在液氮中，所有患者術(shù)前均未接受放化療及生物治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 生物信息學(xué)方法 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RP11-680F8.1表達(dá)水平與肺癌患者總生存期和無病生存期的關(guān)系。采用LncBase Predicted v.2軟件分析RP11-680F8.1與miR-195-5p的靶向關(guān)系。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 H1650、HCC1588、H1299、HCC827細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，A549和HPAEpiC細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。選擇RP11-680F8.1表達(dá)水平最高的HCC1588細(xì)胞為研究對象，將對數(shù)生長期的HCC1588細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)至融合度65%。將HCC1588細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染抗RP11-680F8.1慢病毒以敲減RP11-680F8.1的表達(dá)（sh-RP11-680F8.1組）和非靶向?qū)φ章《荆╯h-NC組）。轉(zhuǎn)染時將 200 μl RPMI 1640 培養(yǎng)基與 10 μl慢病毒混勻，靜置15 min，添加至HCC1588細(xì)胞培養(yǎng)基中；72 h后，采用RT-qPCR驗證慢病毒轉(zhuǎn)染后的敲減效率。

1.5 RP11-680F8.1、miR-195-5p和FOXK1 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-qPCR法。采用Trizol試劑分離組織或細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)一步反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR反應(yīng)條件：97℃預(yù)變性7 min、54℃ 20 s、71℃20 s，共32個循環(huán)。GAPDH用于標(biāo)準(zhǔn)化RP11-680F8.1和FOXK1 mRNA的相對表達(dá)，U6用于標(biāo)準(zhǔn)化miR-195-5p的相對表達(dá)。RP11-680F8.1上游引物：5'-CCCCAGGTAAGAGGGAAGAG-3'，下 游 引 物 ：5'-CCAACACACCTGTTGGTCAG-3'；FOXK1上游引物：5'-TCCAGGAGCCGCACTTCTA-3'，下游引物：5'-CTCCGGGATGTGGATCTTCA-3'；GAPDH上游引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'；U6 上 游 引 物 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-195-5p 上游引物 ：5'-GCGTAGCAGCACAGAAATATTGGC-3'，下游引物：5'-CTGTCGTCGTAGAGCCAGGGAA-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算RP11-680F8.1、miR-195-5p和FOXK1 mRNA相對表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將兩組HCC1588細(xì)胞以每孔2.5×103個接種至96孔板，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。每天相同時間點(diǎn)，每孔加入40 μl CCK-8溶液，避光孵育3 h，通過酶標(biāo)儀分析每孔在450 nm波長處的吸光度（A）值。A值越大，HCC1588細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將兩組HCC1588細(xì)胞以每孔2.5×104個接種至涂有基質(zhì)膠的Transwell上室，在下室中加入500 μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，用2%多聚甲醛溶液固定，用0.3%結(jié)晶紫溶液染色。在倒置顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5個視野計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8 RP11-680F8.1和miR-195-5p的靶向關(guān)系檢測采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。采用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將RP11-680F8.1-WT+miR-195-5p、RP11-680F8.1-WT+miR-NC、RP11-680F8.1-Mut+miR-195-5p、RP11-680F8.1-Mut+miR-NC共轉(zhuǎn)染HCC1588細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，采用裂解液裂解細(xì)胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測每組細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.9 FOXK1蛋白水平和PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號通路蛋白水平檢測 采用Western blot法。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液，采用細(xì)胞刮收集細(xì)胞裂解物。以恒壓120 V經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，以恒流200 mA轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。在10%脫脂牛奶中常溫封閉3.5 h，經(jīng)TBST溶液洗膜，加入Ⅰ抗FOXK1抗體（1∶2 000）、PI3P（1∶2 500）、p-Akt（1∶3 500）、mTORC1（1∶3 500）、p-SGK1（1∶3 500）、β-actin（1∶3 000），冰箱內(nèi)孵育 15 h。經(jīng)TBST溶液洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶20 000），室溫孵育3.5 h。經(jīng)TBST溶液洗膜，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像儀中曝光、顯影。使用Image J軟件計算各個條帶的灰度值，即蛋白表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同RP11-680F8.1表達(dá)水平肺癌患者總生存期和無病生存期比較 GEPIA數(shù)據(jù)庫資料分析顯示，與RP11-680F8.1高表達(dá)患者相比，RP11-680F8.1低表達(dá)患者總生存期和無病生存期均較長（均P＜0.01），見圖1。

圖1 不同RP11-680F8.1表達(dá)水平肺癌患者總生存期和無病生存期比較（a：總生存期；b：無病生存期）

2.2 RP11-680F8.1在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá) 與癌旁組織相比，肺癌組織中RP11-680F8.1表達(dá)水平明顯上調(diào)（1.48±0.12比5.53±0.24，P＜0.01），見圖2。與正常肺泡上皮細(xì)胞系HPAEpiC相比，肺癌細(xì)胞系H1650、A549、HCC1588、H1299、HCC827中RP11-680F8.1表達(dá)水平均上調(diào)（均P＜0.05），其中HCC1588細(xì)胞中RP11-680F8.1表達(dá)水平最高，見圖3。

圖2 肺癌組織和癌旁組織中RP11-680F8.1表達(dá)水平比較

圖3 不同肺癌細(xì)胞中RP11-680F8.1表達(dá)水平比較

2.3 轉(zhuǎn)染抗RP11-680F8.1慢病毒的敲減效率 在HCC1588細(xì)胞中轉(zhuǎn)染抗RP11-680F8.1慢病毒和非靶向?qū)φ章《竞螅瑂h-NC組和sh-RP11-680F8.1組細(xì)胞中RP11-680F8.1表達(dá)水平分別為7.50±0.75和1.02±0.10，與sh-NC組相比，sh-RP11-680F8.1組細(xì)胞中RP11-680F8.1表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）。

2.4 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對HCC1588細(xì)胞增殖能力的影響 sh-RP11-680F8.1組細(xì)胞在2、3、4、5 d時的增殖能力均明顯低于sh-NC組（均P＜0.05），見圖4，提示敲減RP11-680F8.1表達(dá)降低了HCC1588細(xì)胞增殖能力。

圖4 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對HCC1588細(xì)胞增殖能力的影響

2.5 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對HCC1588細(xì)胞侵襲能力的影響 sh-NC組和sh-RP11-680F8.1組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（70.56±4.71）和（37.33±8.32）個/視野，sh-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于sh-RP11-680F8.1組（P＜0.05），見圖5，提示敲減RP11-680F8.1表達(dá)抑制了HCC1588細(xì)胞侵襲能力。

圖5 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對HCC1588細(xì)胞侵襲的影響（a：侵襲細(xì)胞染色圖；b：侵襲細(xì)胞數(shù)柱狀統(tǒng)計圖，與sh-NC組相比，**P＜0.01）

2.6 RP11-680F8.1和miR-195-5p之間的靶向關(guān)系LncBase Predicted v.2軟件預(yù)測顯示，miR-195-5p可能是RP11-680F8.1的靶點(diǎn)，見圖6。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與共轉(zhuǎn)染miR-NC和RP11-680F8.1-WT相比，共轉(zhuǎn)染miR-195-5p和RP11-680F8.1-WT的HCC1588細(xì)胞相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），見圖7，證實miR-195-5p是RP11-680F8.1的直接靶點(diǎn)。

圖6 RP11-680F8.1與miR-195-5p的結(jié)合位點(diǎn)

圖7 RP11-680F8.1與miR-195-5p的靶向關(guān)系

2.7 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對miR-195-5p和FOXK1 mRNA表達(dá)的影響 與sh-NC組相比，sh-RP11-680F8.1組細(xì)胞中miR-195-5p表達(dá)水平上調(diào)、FOXK1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)（均P＜0.01），見表1，提示敲減RP11-680F8.1表達(dá)促進(jìn)了miR-195-5p表達(dá)，抑制了FOXK1 mRNA表達(dá)。

表1 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對miR-195-5p和FOXK1 mRNA表達(dá)的影響

2.8 敲減RP11-680F8.1表達(dá)對FOXK1蛋白和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響 與sh-NC組相比，sh-RP11-680F8.1組HCC1588細(xì)胞中FOXK1蛋白表達(dá)水平降低，PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)水平降低，見圖8。

圖8 敲減RP11-680F8.1后HCC1588細(xì)胞FOXK1蛋白和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

隨著深度測序的廣泛應(yīng)用，lncRNA已成為表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[7]。lncRNA通過調(diào)節(jié)各種分子信號通路，在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，有望成為各種疾病的早期診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[8]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中存在異常過表達(dá)或低表達(dá)的lncRNA，與肺癌患者的病理分期、化療敏感性、放療敏感性等密切相關(guān)[9-11]。Feng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PGM5P4-AS1在肺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，其過表達(dá)在體外抑制了肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)抑制了裸鼠肺癌腫瘤的生長。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA AC079630.4在肺癌組織中顯著下調(diào)，其低表達(dá)的樣本比高表達(dá)的樣本具有更晚期的病理分期和更差的預(yù)后。Cheng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PSMA3-AS1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于人支氣管正常上皮細(xì)胞，敲低lncRNA PSMA3-AS1通過競爭性結(jié)合miR-17-5p，顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。RP11-680F8.1是一種罕見報道的lncRNA，其在肺癌中的表達(dá)和功能尚未被探討。

本研究首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RP11-680F8.1表達(dá)水平與肺癌患者總生存期和無病生存期的關(guān)系，證明RP11-680F8.1低表達(dá)患者的總生存期和無病生存期均較長，提示RP11-680F8.1可能是促癌lncRNA。本研究進(jìn)一步顯示，RP11-680F8.1在人肺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，敲減RP11-680F8.1表達(dá)能夠抑制體外肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，證實RP11-680F8.1是一種癌基因，其可能作為肺癌治療的靶點(diǎn)。先前研究顯示，lncRNA通過競爭性結(jié)合微小RNA，促進(jìn)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)[14-16]。本研究使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫LncBase Predicted v.2分析顯示，miR-195-5p可能與RP11-680F8.1相互作用。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實RP11-680F8.1能夠靶向結(jié)合miR-195-5p。

研究表明，miR-195-5p在前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，其表達(dá)與患者腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均呈負(fù)相關(guān)[17-20]。值得注意的是，Long等[21]發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中下調(diào)，過表達(dá)miR-195-5p通過下調(diào)FOXK1基因表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究中，敲減RP11-680F8.1表達(dá)后，miR-195-5p表達(dá)明顯增加，F(xiàn)OXK1 mRNA表達(dá)明顯降低，證實RP11-680F8.1通過調(diào)節(jié)miR-195-5p和FOXK1表達(dá)發(fā)揮作用。FOXK1基因通過活化PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[22-23]。本研究中，敲減RP11-680F8.1表達(dá)后，PI3K/Akt/mTOR信號通路活化被抑制，間接提示RP11-680F8.1發(fā)揮作用依賴于miR-195-5p/FOXK1信號通路。

綜上所述，本研究證實RP11-680F8.1是肺癌中的癌基因，與肺癌患者的總生存期和無病生存期密切相關(guān)。敲減RP11-680F8.1通過上調(diào)miR-195-5p表達(dá)，下調(diào)FOXK1 mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌HCC1588細(xì)胞的增殖和侵襲。RP11-680F8.1可能為肺癌的治療和預(yù)后監(jiān)測提供了有效的分子靶點(diǎn)。