丁酸鈣對蛋雞脂質(zhì)代謝及其相關(guān)基因表達的影響

劉洋,周振雷

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

脂質(zhì)是人和動物的重要營養(yǎng)素之一,為機體提供能量和必需脂肪酸。與哺乳動物脂肪組織作為脂質(zhì)代謝的主要部位不同,肝臟是禽類脂肪代謝的主要器官,而脂肪組織主要用于脂肪酸的儲存[1-2]。肝臟通過分解膽固醇產(chǎn)生膽汁酸,有助于脂質(zhì)消化吸收[3]。對蛋雞來說,雞蛋內(nèi)的脂類物質(zhì)主要由機體自身內(nèi)源性合成,產(chǎn)蛋時脂質(zhì)代謝途徑頻繁周轉(zhuǎn),肝臟脂肪生成提高[4-5]。隨著日齡的增長,經(jīng)密集產(chǎn)蛋后肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,易導(dǎo)致脂肪在肝臟中過度沉積,從而影響家禽的健康和生產(chǎn)性能[6-7]。例如籠養(yǎng)蛋雞肝臟脂質(zhì)的沉積是脂肪肝出血綜合征的誘因,導(dǎo)致產(chǎn)蛋率急劇下降,蛋雞死亡率升高[8]。此外,腹部脂肪的沉積與飼料效率呈負相關(guān)[9]。因此,調(diào)節(jié)蛋雞脂質(zhì)代謝有利于提高蛋雞養(yǎng)殖經(jīng)濟效益和改善動物福利。

丁酸是后腸微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的一種四碳短鏈脂肪酸,通過影響腸道及鄰近組織發(fā)揮作用。作為一種安全的飼料添加劑,丁酸具有調(diào)節(jié)動物能量代謝,改善腸道健康,提高免疫力,改善動物的生產(chǎn)性能和健康的功能,已經(jīng)在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用了幾十年。在蛋雞日糧中添加丁酸或其鹽還可提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用,改善蛋品質(zhì)[10-12]。與此同時,丁酸在脂質(zhì)代謝的調(diào)控中有較好的應(yīng)用前景。有研究表明,日糧中添加丁酸鈉能提高肉仔雞屠宰率,降低腹部脂肪含量[13]。此外,已有研究表明,禁食后復(fù)喂丁酸鈉可降低脂肪合成相關(guān)基因的表達,降低肝臟甘油三酯的含量[14]。然而,關(guān)于丁酸對蛋雞脂質(zhì)代謝的調(diào)控尚缺乏系統(tǒng)的研究與報道。丁酸鈣是丁酸的鈣鹽,有報道稱丁酸鈣可以提高肉仔雞脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的消化率[15],但目前尚無丁酸鈣對蛋雞脂質(zhì)代謝影響的研究報道。因此,本研究旨在研究基礎(chǔ)日糧中添加丁酸鈣對蛋雞脂質(zhì)沉積的影響并探討其機制,為其生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸鈣(純度90%)購于廣州英賽特生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯、蘇木精伊紅(HE)染色液購于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗材料供應(yīng)中心;TRIzol試劑購于南京奧青生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗選取480只42周齡的海蘭褐蛋雞,隨機分為4組,分別在基礎(chǔ)日糧(表1)中添加0、500、1 000和1 500 mg·kg-1的丁酸鈣。預(yù)飼期1周,試驗期為8周。每組8個重復(fù),每個重復(fù)15只蛋雞(每籠5只)。每日光照16 h。所有蛋雞自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Ingredient composition and nutrient contents of basal diet

1.3 樣品采集

在第8周末,每個重復(fù)隨機選取體重相近的一只雞稱重,翅靜脈采血后通過頸椎脫位處死。分離肝臟和腹部脂肪并稱重,以計算與體重的比值,分別稱為肝臟指數(shù)和腹脂率。采集同一部位的肝臟,生理鹽水沖洗后,一部分組織置于4%的多聚甲醛中,另一部分組織用液氮速凍后-80 ℃保存。

1.4 檢測指標(biāo)和方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)檢測血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)采用自動生化分析儀(BX-4000,Sysmex)檢測。

1.4.2 組織內(nèi)TC、TG含量的測定準(zhǔn)確稱量肝臟和蛋黃組織30 mg,加入270 μL無水乙醇進行勻漿,2 500 r·min-1離心10 min,取上清液用比色法測定蛋黃TC和肝臟TC、TG的含量。

1.4.3 肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)將固定的組織進行石蠟包埋,將包埋蠟塊切成5 μm厚切片,蘇木精伊紅(HE)染色后,倒置顯微鏡(CKX53,Olympus,日本)下觀察并拍照。

1.4.4 肝臟RNA提取和Real-time PCR使用Trizol試劑按照說明書提取肝臟總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計在D260/D280處測定RNA濃度,并將所有樣品稀釋至500 ng·μL-1,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。使用SYBR qPCR Master Mix試劑盒在ABI PRISM 7300 HT序列檢測系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR。目的基因的引物序列如表2所示。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT計算基因mRNA的相對表達量。

表2 熒光定量PCR的引物序列Table 2 Sequence used for real-time PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),各組間差異用Tukey法進行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸鈣對蛋雞肝臟指數(shù)和腹脂率的影響

從圖1可見:與對照組相比,基礎(chǔ)日糧中分別添加500和1 000 mg·kg-1丁酸鈣的蛋雞肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05),1 000和1 500 mg·kg-1丁酸鈣處理的蛋雞腹脂率顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 丁酸鈣對蛋雞肝臟指數(shù)和腹脂率的影響Fig.1 Effects of calcium butyrate on liver index and abdominal fat percentage of laying hens各組間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05). The same below.

2.2 丁酸鈣對蛋雞血清脂質(zhì)含量的影響

如表3所示:添加1 500 mg·kg-1丁酸鈣有降低TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的趨勢,但與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 丁酸鈣對蛋雞血清脂質(zhì)含量的影響Table 3 Effects of calcium butyrate on serum lipid content of laying hens

2.3 丁酸鈣對蛋雞肝臟和蛋黃脂質(zhì)含量的影響

如圖2所示:與對照組相比,添加500 mg·kg-1丁酸鈣顯著降低肝臟TG的含量(P<0.05)。添加500和1 000 mg·kg-1丁酸鈣的蛋雞蛋黃的TC含量顯著低于對照組(P<0.05),而添加丁酸鈣對肝臟TC含量無顯著影響(P>0.05)。

圖2 丁酸鈣對蛋雞肝臟和蛋黃甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)含量的影響Fig.2 Effects of calcium butyrate on triglyceride(TG)and cholesterol(TC)contents in liver and yolk of laying hens

2.4 丁酸鈣對蛋雞肝臟組織形態(tài)的影響

如圖3所示:對照組肝細胞內(nèi)有大小不一的脂滴(箭頭所示),添加丁酸鈣后脂滴的沉積明顯減少。

圖3 丁酸鈣對蛋雞肝臟組織形態(tài)的影響Fig.3 Effects of calcium butyrate on liver histomorphology of laying hens

圖4 丁酸鈣對蛋雞脂質(zhì)合成(A)、分解與利用(B)相關(guān)基因表達量的影響Fig.4 Effects of calcium butyrate on expression levels of genes related to lipid synthesis(A) and lipid decomposition and utilization(B)of laying hens

2.5 丁酸鈣對蛋雞脂代謝相關(guān)基因表達量的影響

如圖4所示:與對照組相比,添加1 000和1 500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的SREBP-1c和ACCmRNA表達量顯著降低(P<0.05),添加500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的ACCmRNA表達量顯著升高(P<0.05)。與對照組相比,添加500和1 500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的CPT1αmRNA表達量顯著升高(P<0.05)。添加不同濃度丁酸鈣蛋雞的CYP8B1mRNA表達量顯著低于對照組(P<0.05)。

3 討論

丁酸作為一種酸化劑可以降低胃腸道內(nèi)的酸堿度,提高產(chǎn)蛋后期蛋雞乳桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量,降低沙門氏菌、大腸桿菌等有害菌的數(shù)量,增加腸道絨毛高度與隱窩深度的比值,改善消化酶活性[10,16]。此外丁酸還能提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、蛋質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率,促進腸道營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白的表達,降低飼料成本,提高生產(chǎn)利潤[12,17]。目前有關(guān)丁酸對蛋雞脂質(zhì)代謝影響的研究較少。

蛋雞腹部脂肪的過度沉積影響蛋雞的生產(chǎn)性能[18]。本研究結(jié)果顯示,隨著日糧中丁酸鈣添加量的增加,腹脂率呈劑量依賴性下降,表明飼喂丁酸鈣可降低蛋雞脂肪沉積。這與之前肉仔雞的研究結(jié)果一致[19]。肝臟是家禽脂質(zhì)代謝(如脂質(zhì)合成、分解和轉(zhuǎn)運)的主要器官。日糧中添加0.1%丁酸鈉可以使21日齡肉雞的肝臟指數(shù)降低[20],本研究結(jié)果與之相似,添加500或1 000 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的肝臟指數(shù)均降低。產(chǎn)蛋可促進肝臟合成脂肪,TG作為能量的供體[21],其在肝臟中的積累程度是脂質(zhì)代謝紊亂的指標(biāo)。先前有研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可降低高脂日糧小鼠肝臟的TG水平[22],也有研究表明包被丁酸鈉可降低蛋雞血清中TG水平[10],本研究結(jié)果表明飼喂500 mg·kg-1丁酸鈣可降低肝臟TG含量,但血清脂質(zhì)含量沒有發(fā)生顯著變化。添加丁酸鈣還緩解了肝臟中的脂滴沉積。以上結(jié)果表明添加丁酸鈣可能通過降低蛋雞肝臟脂質(zhì)沉積,改善脂質(zhì)代謝紊亂的狀況。

雞蛋富含多種營養(yǎng)素,但其高膽固醇含量導(dǎo)致的健康問題已引起社會的廣泛關(guān)注[23]。最近有研究表明有機酸和絲蘭提取物能降低血清和蛋黃膽固醇水平[24],本研究結(jié)果與之相似,日糧中添加500或1 000 mg·kg-1丁酸鈣蛋黃的膽固醇含量均降低,這可能與膽固醇吸收與合成減少、糞便膽固醇排泄增加有關(guān)。

為了進一步揭示丁酸鈣降脂作用的機制,本研究檢測了脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達。ACC是第1個脂肪酸合成過程中的限速酶,FAS位于胞質(zhì)中,能催化脂肪酸碳鏈伸長,在脂肪生成過程中起到重要作用[25-26]。SREBP-1c是調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子,可激活FAS和ACC調(diào)控脂肪酸生成[27-28]。PPARγ是脂肪細胞分化和生成的關(guān)鍵調(diào)控因子,調(diào)控成脂基因的表達[21]。在本研究中,日糧添加1 000或1 500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞肝臟的ACC和SREBP-1cmRNA表達量降低,可能導(dǎo)致脂肪酸合成能力的減弱。這與之前的研究類似,其機制可能是丁酸鈣通過激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)調(diào)控這些基因的表達來抑制脂質(zhì)生成[14,29]。本研究中,各組肝臟FAS和PPARγmRNA表達無顯著差異,而有研究表明,日糧中添加丁酸鈉可提高仙居雞肝臟中PPARγ的表達[30],結(jié)果不一致的原因可能與添加丁酸的種類和劑量不同有關(guān)。CPT1和ACOX是脂肪酸β氧化中的限速酶[31]。FXR是膽汁酸的受體,在調(diào)節(jié)腸肝循環(huán)和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用[32]。本研究中,日糧中添加500或1 500 mg·kg-1丁酸鈣均上調(diào)了CPT1αmRNA的表達,說明蛋雞脂肪酸分解能力可能增強,這與之前在斷奶仔豬上的研究結(jié)果相似[33]。在本研究中,各組間肝臟FXR和ACOXmRNA表達無顯著差異,提示丁酸鈣并非通過FXR-ACOX途徑調(diào)控脂質(zhì)分解。CYP7A1是膽汁酸合成過程中經(jīng)典途徑的第1個限速酶,主要生成膽酸和鵝去氧膽酸,而CYP8B1調(diào)控膽酸和鵝去氧膽酸的比值[34-35]。有趣的是,添加丁酸鈣組肝臟CYP8B1mRNA的表達量降低,提示膽固醇分解能力減弱,原因可能為腸道中的膽固醇吸收減少或排泄增加維持了膽固醇的動態(tài)平衡[36]。

綜上,日糧中添加丁酸鈣減少肝臟、蛋黃和腹部脂肪沉積,這可能與丁酸鈣上調(diào)肝臟CPT1αmRNA的表達,下調(diào)肝臟SREBP-1c、ACC和CYP8B1mRNA的表達有關(guān),其中1 000 mg·kg-1丁酸鈣添加效果最佳。