楓香變紅過程中葉片組織結(jié)構(gòu)、光合特性及色素含量變化研究

尹國(guó)平， 劉雄盛， 蔣 燚*， 王 勇， 楊繼生， 肖玉菲， 黃榮林， 姜 英

( 1. 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院， 廣西優(yōu)質(zhì)用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530002； 2. 廣西大學(xué)， 南寧 530004 )

隨著人們對(duì)優(yōu)美生態(tài)環(huán)境需求日益增加，在森林景觀營(yíng)造和城鄉(xiāng)綠化美化中，彩葉樹種越來越受到青睞。彩葉樹種因其亮麗豐富的色彩和較高的觀賞價(jià)值而在現(xiàn)代化城市園林景觀建設(shè)中發(fā)揮著越來越重要的作用，從而備受人們關(guān)注(Sheue et al., 2012；李衛(wèi)星等，2017)。隨著研究者對(duì)彩葉植物的不斷研究，將彩葉分為色素型和結(jié)構(gòu)型2大類。其中，色素型分為葉綠素虧缺型(葉綠體發(fā)生變化，葉綠素合成受阻)和其他色素型(如葉黃素或花色苷大量積累使葉片呈黃色或紅色)，而結(jié)構(gòu)類彩葉則主要有表皮型和空隙型。表皮型表現(xiàn)為表皮細(xì)胞變異(乳狀凸起、不規(guī)則形狀等)和表皮細(xì)胞上附著其他物質(zhì)(蠟質(zhì)、絨毛等)使光線發(fā)生折射、衍射以及干涉而呈色，而空隙型葉片表皮細(xì)胞與柵欄組織細(xì)胞間存在較大氣室，入射光在氣室間形成漫反射，致使葉片呈現(xiàn)其他顏色(Sheue et al., 2012；王振興等，2016；杜文文等，2019；梁玲等，2020)。目前，對(duì)彩葉樹種葉片變化成因的研究多集中在色素的種類、含量及分布等方面(Rocca et al., 2011；馮露等，2017；李衛(wèi)星等，2017)，而對(duì)葉片組織結(jié)構(gòu)與葉片呈色的關(guān)系研究相對(duì)較少。

楓香()為金縷梅科(Hamamelidaceae)楓香樹屬()落葉喬木，分布廣泛(主要分布于我國(guó)秦嶺及淮河以南各省，北起河南、山東，東至臺(tái)灣，西至四川、云南及西藏，南至廣東)，適應(yīng)性和耐火力強(qiáng)，天然易更新，入秋后，其葉片逐漸由綠色變?yōu)榧t色、紫色、橙黃等顏色(主要以變紅為主)，極具觀賞價(jià)值，是優(yōu)良的景觀生態(tài)樹種(王冬雪等，2017)。目前，王冬雪等(2019)描述了不同光質(zhì)處理下楓香葉色變化過程中色素含量的變化；劉儒等(2017)描述了楓香葉色變化與色素的關(guān)系；羅紫東等(2016)研究指出隨著楓香葉片逐漸變黃和變紅，其凈光合速率的光響應(yīng)能力逐漸降低。然而，這些報(bào)道中并沒有楓香葉色變化過程中組織結(jié)構(gòu)變化的研究。因此，對(duì)于楓香葉色變色是由色素引起還是色素和結(jié)構(gòu)兩種兼而有之，尚未得出明確的結(jié)論。為此，本文以楓香變紅植株為研究對(duì)象，通過連續(xù)監(jiān)測(cè)自然條件下楓香葉片變紅過程中葉片的組織結(jié)構(gòu)、光合特性以及色素含量的變化，分析葉色變化過程中組織結(jié)構(gòu)與光合特性以及色素的關(guān)系，旨在探討葉片結(jié)構(gòu)與楓香葉色變紅的關(guān)系，為深入研究楓香呈色機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料來源于廣西德?？h紅葉森林公園楓香天然林(106°39′5″ E、23°21′19″ N)。紅葉森林公園地處北回歸線以南，屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候，以棕壤為主，占地總面積7.29 km，楓香林面積2.44 km。

采用平均木法，選取5株秋季葉片變紅、生長(zhǎng)健壯的成年楓香植株。從2018年9月底開始，在每株楓香樹上選取東、南、西、北四個(gè)方向的枝條做好標(biāo)記，每15～20 d觀測(cè)和采集樣品1次，自試驗(yàn)開始至結(jié)束共進(jìn)行5次葉片觀測(cè)和樣品采樣，分別標(biāo)記為S1(2018-09-29)、S2(2018-10-13)、S3(2018-11-2)、S4(2018-11-22)、S5(2018-12-12)，如圖1所示。

S1. 全綠; S2. 變紅面積<1/3; S3. 1/3<變紅面積<2/3; S4. 變紅面積>2/3; S5. 全紅。下同。S1. All-green; S2. Reddened area < 1/3; S3. 1/3 < Some reddened area < 2/3; S4. Totally red area > 2/3; S5. All-red. The same below.圖 1 不同變色時(shí)期楓香的葉片顏色Fig. 1 Leaf color of Liquidambar formosana at different discoloration stages

1.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)測(cè)定

在楓香變色的5個(gè)時(shí)期，分別對(duì)每株楓香取6片典型葉片，對(duì)每片葉片從葉基部以上1/3處(保留主脈)用單面刀片將葉片切成0.5 cm × 0.5 cm的小塊，放入FAA固定液(體積比為70 %乙醇∶甲醛∶冰醋酸=90∶5∶5)，固定24 h后，用于石蠟切片的制作。在每片葉片中部葉脈與葉片邊緣之間切取 1.0 mm × 0.5 cm的小塊，用2.5%戊二醛固定24 h后，先經(jīng)磷酸緩沖液清洗，再用1%的鋨酸固定2 h，用于葉片氣孔超微結(jié)構(gòu)觀測(cè)。

采用常規(guī)石蠟切片法(劉雄盛等，2020)，對(duì)處理后的葉片進(jìn)行切片，對(duì)每個(gè)變色時(shí)期每株楓香選取3塊組織，用每塊組織制作3張切片，切片厚度為8 μm，用番紅-固綠對(duì)切片進(jìn)行雙重對(duì)染，中性樹膠封片，于Motic BA410型光學(xué)顯微鏡下觀察。每張切片在葉脈和葉肉組織分別觀察5個(gè)視野，并拍照，之后用Digmizer軟件測(cè)定葉片柵欄組織、海綿組織以及上、下表皮等組織的厚度。各組織測(cè)量10個(gè)數(shù)值。

氣孔超微結(jié)構(gòu)觀測(cè)參照齊紅巖等(2009)的方法，對(duì)每個(gè)變色時(shí)期每株楓香選取3塊組織，按常規(guī)系列乙醇丙酮脫水，醋酸異戊脂置換，在液態(tài)CO中干燥后進(jìn)行樣品粘臺(tái), 對(duì)其進(jìn)行噴金處理，在S-450型掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。用Digmizer軟件測(cè)量氣孔長(zhǎng)()、氣孔寬()、氣孔器長(zhǎng)度()、氣孔器寬度()，并計(jì)算氣孔開度()、單個(gè)氣孔器面積()。其中，=π ××，=π ××/4(π = 3.14)。每個(gè)處理觀察10個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野隨機(jī)選取30個(gè)氣孔器進(jìn)行測(cè)量。

1.3 光合作用日變化測(cè)定

光合特性的測(cè)定參照郭連金等(2017)的方法。在楓香變色5個(gè)時(shí)期，選擇在連續(xù)3 d晴朗無風(fēng)天氣，采用LI-6400便捷式光合儀測(cè)定楓香植株葉片光合參數(shù)的日變化。測(cè)定時(shí)在每株楓香四個(gè)方向枝條上分別選取健康無病蟲害的3個(gè)葉片作為測(cè)定葉。測(cè)定時(shí)間為7:00—17:00，每2 h測(cè)1次。采用自然光源，標(biāo)準(zhǔn)葉室(2 cm × 3 cm)，測(cè)定指標(biāo)有凈光合速率()、蒸騰速率()、胞間二氧化碳濃度()、氣孔導(dǎo)度()等。

1.4 葉片色素含量測(cè)定

在楓香變色的5個(gè)時(shí)期，在每株楓香東、南、西、北四個(gè)方向的枝條上分別隨機(jī)選取健康完整的5片葉片，混合后用錫箔紙包裹住，放入液氮灌中短暫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行色素含量的測(cè)定。葉綠素和類胡蘿卜素含量測(cè)定參照李合生(2000)的方法，稱取0.2 g新鮮葉片粉末，加入5 mL 80%丙酮，置于4 ℃冰箱中避光浸提24 h，取上清液過濾后，利用UV-4802雙光束分光光度計(jì)，分別測(cè)定445、645、663 nm處的吸光值，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量及類胡蘿卜素含量。

花色苷含量測(cè)定參照Kytridis和Manetas(2006)的方法，稱取新鮮葉片粉末1.0 g，加入10 mL 1%鹽酸甲醇溶液，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸提5 h，過濾，將濾液稀釋5倍。利用雙光束分光光度計(jì)測(cè)定530 nm和657 nm處的吸光值，計(jì)算花色苷含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用 Excel 2016軟件對(duì)葉片結(jié)構(gòu)和光合作用參數(shù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計(jì)和作圖。運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)不同變色時(shí)期葉片結(jié)構(gòu)和光合作用參數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較(采用鄧肯氏新復(fù)極差法)，并進(jìn)行葉片結(jié)構(gòu)與光合作用參數(shù)的相關(guān)性分析。所有分析顯著性水平均設(shè)定為=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 楓香葉色變化過程中葉片結(jié)構(gòu)特征的變化

楓香葉片為闊卵形、薄革質(zhì)、掌狀3裂，是典型的異面葉。橫切面觀：楓香葉片的葉肉由柵欄組織和海綿組織組成，柵欄組織由2層排列整齊、緊密的柱狀細(xì)胞組成，海綿組織由3～4層形狀不規(guī)則細(xì)胞組成，細(xì)胞大小不等，間隙大，排列疏松；楓香葉片的表皮由上表皮和下表皮組成，上表皮由1層橢圓形細(xì)胞緊密排列組成，下表皮由1層長(zhǎng)條形或橢圓形細(xì)胞緊密排列組成(圖2)。

Uep. 上表皮; Lep. 下表皮; Pt. 柵欄組織; St. 海綿組織; Va. 液泡。Uep. Upper epidermis; Lep. Lower epidermis; Pt. Palisade tissue; St. Spongy tissue; Va. Vacuole.圖 2 不同變色時(shí)期楓香葉片的葉肉解剖結(jié)構(gòu) Fig. 2 Anatomical structure of mesophyll of Liquidambar formosana leaves at different discoloration stages

不同變色期楓香的葉片厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度以及海綿組織的厚度均差異顯著(<0.01)，下表皮厚度和柵海比差異不顯著(>0.05)(圖3)。隨著葉片逐漸由綠變紅，葉片厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度以及海綿組織厚度均逐漸減小，下表皮厚度和柵海比呈波動(dòng)性增減。S1時(shí)期時(shí)，葉片厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度以及柵海比分別為170.53、14.58、82.18、62.70、10.60 μm、1.32，S5時(shí)期時(shí)，分別為122.23、12.76、53.01、45.59、9.23 μm、1.17，較S1時(shí)期分別減小28.3%、12.5%、35.5%、27.3%、12.9%、11.4%。

同一顏色柱子上不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。下同。Different lowercase letters on the same color column indicate significant differences (P<0.05). The same below.圖 3 不同變色期葉片的橫切面結(jié)構(gòu)特征參數(shù)Fig. 3 Changes of leaf anatomical structure in different discoloration stages

通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，楓香葉片氣孔僅分布于下表皮，氣孔器形狀呈近圓形或橢圓形、外凸，排列方式不規(guī)則(圖4)。由圖5可知，不同變色時(shí)期楓香葉片氣孔開度、氣孔器長(zhǎng)、氣孔器寬、單個(gè)氣孔器面積均差異顯著(<0.05)。其中，隨著葉片逐漸變紅，氣孔開度逐漸減小，S1時(shí)期最大(為28.33 μm)，至S5時(shí)期減小(為15.12 μm)；氣孔器長(zhǎng)、單個(gè)氣孔器面積逐漸增大，均在S1時(shí)期最小，分別為18.54 μm、259.21 μm，至S5時(shí)期增大(分別為21.90 μm、377.97 μm)；氣孔器寬呈波動(dòng)性增減，在S5時(shí)期最大(為21.99 μm)，S1時(shí)期最小(為17.77 μm)。

Sa. 氣孔器。Sa. Stomatal apparatus.圖 4 不同變色期楓香葉片的氣孔分布特征Fig. 4 Stomatal distribution characteristics of Liquidambar formosana leaves at different discoloration stages

圖 5 不同變色期楓香葉片的氣孔特征Fig. 5 Stomatal characteristics of Liquidambar formosana leaves under different discoloration stages

2.2 楓香葉色變化過程中光合作用的日變化

由圖6可知，楓香葉色變化過程中，各時(shí)期葉片凈光合速率()日變化差異明顯。其中，S1和S2時(shí)期葉片日變化趨勢(shì)一致，均為雙峰型，均在11:00時(shí)和15:00時(shí)達(dá)到高峰，13:00時(shí)出現(xiàn)光合“午休”現(xiàn)象；S3、S4、S5時(shí)期葉片日變化趨勢(shì)一致，均為單峰型，S3時(shí)期在11:00時(shí)達(dá)到高峰，S4和S5時(shí)期均在13:00時(shí)達(dá)到高峰。各時(shí)期葉片胞間CO濃度()日變化趨勢(shì)基本一致，均先降低后升高。其中，S1、S2、S4、S5時(shí)期葉片均在13:00時(shí)到達(dá)最小值，S3在11:00時(shí)到達(dá)最小值。各時(shí)期葉片氣孔導(dǎo)度()日變化均呈先升高后降低趨勢(shì)。其中，S1、S2、S3時(shí)期在11:00時(shí)達(dá)最大值，S4和S5時(shí)期在15:00時(shí)達(dá)最大值。各時(shí)期葉片蒸騰速率()日變化趨勢(shì)不一。其中，S1和S2時(shí)期日變化呈波動(dòng)性升降，均在11:00時(shí)達(dá)最大值，S3、S4、S5時(shí)期日變化均呈先升高后降低趨勢(shì)，均在11:00時(shí)達(dá)最大值。

圖 6 不同變色期楓香凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)的日變化Fig. 6 Diurnal variation of net photosynthesis rate (Pn), intercellular CO2 concentration (Ci), stomatal conductance (Gs) and transpiration rate (Tr) of Liquidambar formosana under different discoloration stages

就光合作用參數(shù)的日均值比較，葉片大小排序?yàn)镾1>S2>S3>S4>S5，大小排序?yàn)镾5>S4>S3>S2>S1，大小排序?yàn)镾1>S2>S3>S4>S5，大小排序?yàn)镾1>S2>S3>S4>S5。方差分析結(jié)果表明，不同變色時(shí)期楓香葉片、、、日均值差異均顯著(<0.05)(表1)。

表 1 不同變色期楓香葉片光合作用參數(shù)的日均值Table 1 Daily mean values of photosynthesis parameters of Liquidambar formosana leaves under different discoloration stages

2.3 楓香葉色變化過程中葉片色素含量的變化

由圖7可知，不同變色期楓香葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、花色苷含量均差異顯著(<0.05)。隨著葉色逐漸變紅，葉綠素a、葉綠素b含量均表現(xiàn)出持續(xù)減少的趨勢(shì)，花色苷則持續(xù)增加，類胡蘿卜素?zé)o明顯變化規(guī)律。S1時(shí)期，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、花色苷含量分別為0.469、0.319、0.973、0.155 mg·g；S5時(shí)期，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、花色苷含量分別為0.189、0.086、2.348、0.113 mg·g，較S1時(shí)期葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量分別減小59.6%、73.0%、14.5%，花色苷含量增加41.3%。隨著葉片逐漸變紅，各色素含量百分比變化明顯，其中葉綠素a、葉綠素b百分比逐漸減小，至S5時(shí)期僅占總色素的9.8%、4.4%；類胡蘿卜素百分比先增后減，在S2時(shí)期占比最大(為9.8%)，至S5時(shí)期僅占5.8%；花色苷百分比逐漸增加，至S5時(shí)期占總色素的50.8%。

圖 7 不同變色時(shí)期楓香葉片的色素含量Fig. 7 Pigment content of Liquidambar formosana leaves at different discoloration stages

3 討論與結(jié)論

楓香葉片變色過程中，表皮細(xì)胞均為橢圓形，緊密排列，未觀察到明顯的細(xì)胞變異，也未發(fā)現(xiàn)絨毛和蠟質(zhì)等明顯的附著物，且上表皮細(xì)胞與柵欄組織細(xì)胞間排列緊密，未出現(xiàn)較大的氣室。因此，楓香葉片變紅與其表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞排列方式無關(guān)， 與蘇佳露等 (2020)對(duì)6個(gè)彩葉竹種葉片解剖結(jié)構(gòu)研究和孫旺旺等(2020)對(duì)金葉連翹(‘Sun Gold’)不同葉色解剖結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。除表皮型和空隙型2種結(jié)構(gòu)類彩葉外，一些植物彩葉的結(jié)構(gòu)與正常綠色葉片相比差異顯著。本研究中，楓香葉片不同變色期結(jié)構(gòu)差異顯著，葉片變色過程中其厚度、柵欄組織厚度和海綿組織逐漸減小，與金葉連翹葉片由綠轉(zhuǎn)黃過程中葉片結(jié)構(gòu)變化類似(孫旺旺等，2020)，而與梁玲等(2020)對(duì)不同色彩珙桐()葉片解剖結(jié)構(gòu)研究結(jié)果卻相反，可能是因?yàn)殓钔殛幮詷浞N(梁玲等，2020)，而楓香為陽(yáng)性樹種，二者對(duì)環(huán)境的適應(yīng)策略不同。落葉樹種在葉片衰老、變色過程中，大部分可溶性糖、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素會(huì)被回收、轉(zhuǎn)移至線粒體，為葉片脫落或失去光合能力后，通過線粒體呼吸維持冬季正常生理代謝提供能量(Keskitalo et al., 2005; Zhang et al., 2013)。因此，楓香葉片變色過程中葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度逐漸減小可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被回收、轉(zhuǎn)移所致。

柵欄組織和海綿組織是葉綠體的主要合成部位，柵欄組織和海綿組織厚度減小勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致葉綠體數(shù)量和葉綠素含量減少，葉片光合能力降低，在秋冬季節(jié)低溫和強(qiáng)光條件下，最終導(dǎo)致光能的過剩，產(chǎn)生大量活性氧自由基，破壞植物葉片的光合機(jī)構(gòu)，造成光抑制甚至光破壞，而花色苷能夠吸收綠光和紫外光，反射紅光和藍(lán)光，從而起到濾光和消除活性氧、防止強(qiáng)光氧化脅迫和降低光抑制的作用(Zhang et al., 2011; Junker & Ensminger, 2016)。本研究結(jié)果表明，隨著葉片逐漸變紅，柵欄組織和海綿組的厚度逐漸減小，細(xì)胞排列逐漸松散，葉綠素含量減少，凈光合速率隨之逐漸降低，花色苷含量逐漸增加，至S4和S5時(shí)期，第二層?xùn)艡诮M織明顯退化，此時(shí)葉片葉綠素含量和凈光合速率大幅下降，花色苷含量迅速升高，且柵欄組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡，Lee等(2003)研究指出紅色葉片花色苷僅分布在柵欄組織柱狀薄壁細(xì)胞的液泡中。這說明在葉片變色后期(S4～S5)，可能出現(xiàn)光抑制甚至光破壞，致使葉片在柵欄組織細(xì)胞的液泡中合成大量花色苷以降低光抑制和光破壞，而大量花色苷的積累直接致使葉片變紅。因此，葉綠素含量降低，花色素苷大量積累是導(dǎo)致楓香葉片變紅的直接原因，楓香紅色葉片屬于色素型彩葉。

氣孔是植物葉片與外界環(huán)境進(jìn)行HO和CO等氣體交換的門戶，氣孔開度和氣孔器大小直接影響植物水分狀況及CO同化(Hetherington & Woodward, 2003)。氣孔控制水分和CO的進(jìn)出，是調(diào)節(jié)光合作用和蒸騰作用的關(guān)鍵所在，氣孔開度減小，能減少蒸騰損失，但氣孔阻力增加，CO進(jìn)入葉片受阻，導(dǎo)致光合速率下降(Peeva & Cornic, 2009; 可靜等，2017)。本研究中，楓香葉片變色過程中，氣孔開度逐漸減小，而胞間CO濃度逐漸增加，說明楓香葉片氣孔開度減小，雖然減少了CO進(jìn)入葉片的量，但葉片內(nèi)被光合作用轉(zhuǎn)化的CO量少于進(jìn)入葉片CO的量，進(jìn)而致使葉片內(nèi)CO濃度逐漸增加(Zhang et al., 2013)。因此楓香葉片光合速率減小，并不是氣孔開度減小，進(jìn)入葉片的CO受阻所引起，而是由于秋冬季節(jié)干燥少雨，楓香通過減小氣孔開度來增加氣孔阻力以減少葉片水分散失，阻礙水分虧缺(文志等，2014)。Casson和Gray(2008)認(rèn)為氣孔大小主要受溫度影響，溫度降低氣孔器長(zhǎng)寬指數(shù)則增大；費(fèi)松林等(1999)認(rèn)為氣孔器大小與最冷月溫度有關(guān)，溫度越低氣孔器越大，楓香葉片變色過程中氣孔器增大可能是為了適應(yīng)外界低溫環(huán)境。因此楓香葉片變色過程中氣孔器形態(tài)特征變化是為了適應(yīng)環(huán)境，與其葉色變化無明顯的直接關(guān)系，是否存在其他或更深層次的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，由于楓香葉片變紅過程中表皮細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的變異以及絨毛和蠟質(zhì)等附著物，且上表皮細(xì)胞與柵欄組織細(xì)胞間排列緊密，沒有出現(xiàn)較大的氣室，因此楓香不屬于結(jié)構(gòu)類彩葉。楓香葉片變紅是由于楓香為回收、轉(zhuǎn)移營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，葉片厚度和柵欄組織、海綿組織的厚度減小導(dǎo)致葉綠體數(shù)量和葉綠素含量減少，光合能力下降，在受到光抑制和光破壞時(shí)，合成大量花色苷來自我保護(hù)所引起，屬于色素型彩葉。因此，楓香葉片變紅是其一系列生理結(jié)構(gòu)特征綜合作用的結(jié)果，這些“特征綜合體”反映了楓香對(duì)環(huán)境的適應(yīng)以及資源利用策略。