甘草黃酮合酶Ⅱ催化甘草素特異性合成7，4′-二羥基黃酮

孫甲琛，孫文濤，孫慧，呂波，李春，，

（1 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠色化工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003； 2 清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所/工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084； 3 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院生物化工研究所/醫(yī)藥分子科學(xué)與制劑工信部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

引 言

黃酮類化合物是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要種類之一，包括9000 多種結(jié)構(gòu)[1]，分別屬于黃酮、黃烷酮、異黃酮、查爾酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、黃烷醇、花青素以及他們的衍生物。其中黃酮是指具有2-苯基苯并γ 吡喃酮分子結(jié)構(gòu)且在2 號(hào)和3 號(hào)碳原子之間具有碳碳雙鍵的一類化合物（圖1），因具有抗氧化[2]、抗炎、抗癌[3-5]、防治心腦血管疾病[6]、預(yù)防肥胖和糖尿病[1]、抗凝血[7]等眾多藥理作用而受到人們的廣泛關(guān)注。例如，7,4′-二羥基黃酮（DHF）（圖1）是一種存在于甘草中的黃酮化合物[8]，具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛抗炎[9]、抗氧化[10]、抗真菌[11]、抑制嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生[11]、抑制MUC5A 基因表達(dá)和黏液產(chǎn)生[10]等生理和藥理活性，在臨床治療和醫(yī)療保健領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 黃酮的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of flavone

當(dāng)前制備黃酮類化合物的方法主要有植物提取法[12]、化學(xué)合成法[13]以及生物合成法[14-15]等，尤其是近年來利用微生物細(xì)胞工廠合成了諸多植物天然產(chǎn)物[16-18]。其中，在合成7,4′-二羥基黃酮的方法中以生物催化為代表的生物法因其具有操作簡(jiǎn)便、成本低、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[19-20]備受青睞。7,4′-二羥基黃酮（DHF）的生物催化合成中主要涉及兩種類型的酶，黃酮合酶(FNS)Ⅰ和Ⅱ可催化甘草素合成7,4′-二羥基黃酮（圖2）[21]。其中，F(xiàn)NS Ⅰ是一種依賴于α-酮戊二酸的雙加氧酶，主要存在于歐芹、圓葉當(dāng)歸、小茴香等傘形科植物中[22-23]；FNS Ⅱ是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的單加氧酶（表1，圖2），廣泛存在于大豆、苜蓿、丹參等豆科植物中[31]。例如，大豆來源的FNS Ⅱ（CYP93B16）被挖掘且被證明可以催化甘草素、柚皮素、圣草酚合成相應(yīng)的黃酮化合物（圖2）[21]。然而，富含7,4′-二羥基黃酮的豆科植物甘草[8]的FNS Ⅱ仍未見報(bào)道。因此，本研究擬基于甘草的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、氨基酸序列比對(duì)以及分子進(jìn)化樹分析從甘草中挖掘新的FNS Ⅱ并表征其催化功能；利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子對(duì)接和分子動(dòng)學(xué)模擬探究其催化機(jī)制；最后，采用條件優(yōu)化和過程強(qiáng)化的方式構(gòu)建其最佳細(xì)胞催化工藝。

圖2 黃酮合酶催化黃烷酮合成黃酮Fig.2 Flavonoid synthase catalyzes flavanone to synthesize flavone

表1 不同F(xiàn)NS Ⅰ和FNS Ⅱ的對(duì)比Table 1 Comparison of different FNS Ⅰand FNS Ⅱ

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌株：克隆宿主大腸桿菌（Escherichia coliDH5α）和克隆載體（pUC19）以及表達(dá)宿主酵母細(xì)胞Saccharomyces cerevisiaeBY4742均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

(2)酶制劑：限制性內(nèi)切酶(BamHI,SalI)購(gòu)買自NEB 公司；高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶等均購(gòu)買自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

(3)生化學(xué)試劑：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；氨芐青霉素、遺傳霉素、鮭魚精DNA 均購(gòu)買自索萊寶生物科技有限公司；聚乙二醇3350(PEG3350)、無水醋酸鋰、甘草素，7,4′-二羥基黃酮、氨基酸粉末、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等均購(gòu)買自北京伊諾凱科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨購(gòu)買自英國(guó)OXOID公司。

(4)試劑盒：膠回收試劑盒購(gòu)買自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)買自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

(5)所構(gòu)建的釀酒酵母菌株及基因型如表2所示。

表2 酵母菌株及其基因型Table 2 Strains and their genotypes

1.2 菌株培養(yǎng)

(1)大腸桿菌培養(yǎng)：挑取重組大腸桿菌單菌落，接種到含有適宜抗生素（100 mg/L 氨芐青霉素）的固體培養(yǎng)基上；過夜培養(yǎng)后挑取菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證；驗(yàn)證成功后挑取菌落接種到含有適宜抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證和擴(kuò)增目的基因表達(dá)盒。

(2)釀酒酵母培養(yǎng)：挑取重組釀酒酵母單菌落，接種到含有適宜抗生素和營(yíng)養(yǎng)缺陷型的固體培養(yǎng)基中；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d 挑取菌落裂解后進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證；驗(yàn)證成功后挑取正確單菌落接種到含有適宜抗生素和營(yíng)養(yǎng)缺陷型的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，按照10%比例接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，添加底物進(jìn)行催化反應(yīng)。

1.3 細(xì)胞催化反應(yīng)與活性檢測(cè)

將表達(dá)目的蛋白的釀酒酵母接種至3 ml YPD液體培養(yǎng)基中30℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h 得到種子液，按照10%的接種比例接種至30 ml YPD 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h加入終濃度為1 mmol/L 的底物，在30℃、250 r/min 的條件下反應(yīng)48 h 后，萃取產(chǎn)物，測(cè)定細(xì)胞干重和產(chǎn)物濃度。細(xì)胞催化活性以1 g/L 的細(xì)胞干重（CDW）合成的7,4′-二羥基黃酮的濃度為衡量指標(biāo)，細(xì)胞催化效率以底物甘草素轉(zhuǎn)化率為衡量指標(biāo)。

1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分子動(dòng)力學(xué)模擬

利用AlphaFold2[32]進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，AutoDock Vina[33]進(jìn)行分子對(duì)接（配體結(jié)構(gòu)下載于PubChem 網(wǎng)站）；利用CHARMM-GUI 網(wǎng)站（https://www.charmm-gui.org/）進(jìn)行拓?fù)湮募臉?gòu)建，最后采用Gromacs 的CHARMM36（C36）力場(chǎng)進(jìn)行100 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬，最終系統(tǒng)處于一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)。

1.5 催化工藝優(yōu)化與強(qiáng)化

(1)目的基因過表達(dá)：使用不同釀酒酵母拷貝數(shù)位點(diǎn)（單拷貝位點(diǎn)YPRCtau3，多拷貝位點(diǎn)rDNA以及兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)整合）進(jìn)行外源基因整合構(gòu)建表2 所示的工程菌，分別在酵母培養(yǎng)時(shí)間為12 h 時(shí)添加終濃度為1 mmol/L 的甘草素底物，在30℃、250 r/min的條件下反應(yīng)48 h，考察目的基因Gur.gene26505 過表達(dá)對(duì)甘草素轉(zhuǎn)化率的影響。

(2)底物添加時(shí)間優(yōu)化：分別在酵母接種后的0～84 h 時(shí)添加終濃度為1 mmol/L 的甘草素底物，在30℃、250 r/min 的條件下反應(yīng)48 h，考察不同底物添加時(shí)間對(duì)甘草素轉(zhuǎn)化率的影響。

(3)催化時(shí)間優(yōu)化：將酵母培養(yǎng)最優(yōu)時(shí)間，添加終濃度為1 mmol/L的甘草素底物，在30℃、250 r/min的條件下反應(yīng)12～96 h，考察不同催化時(shí)間對(duì)甘草素轉(zhuǎn)化率的影響，確定最佳催化時(shí)間。

(4)過程強(qiáng)化：在以上最佳工藝下，每隔12 h 分別補(bǔ)加終濃度分別為初始培養(yǎng)基濃度的酵母粉、蛋白胨、葡萄糖，考察培養(yǎng)基成分強(qiáng)化對(duì)催化過程中甘草素轉(zhuǎn)化率的影響。

1.6 HPLC和LC-MS分析檢測(cè)

取1 ml 反應(yīng)液加入2 倍體積乙酸乙酯混勻萃取，吸取1 ml 萃取液，蒸干，加入1 ml 甲醇重新溶解，用0.22 μm 的有機(jī)濾頭過濾到進(jìn)樣瓶中，采用Agilent 1260高效液相色譜測(cè)定濃度。檢測(cè)條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2.7 μm，3.0×100 mm)；流動(dòng)相A為0.1%(體積)的甲酸水溶液；流動(dòng)相B 為乙腈；梯度洗脫，1～20 min：(20%B～100%B(體積))，20～25 min：(100%B(體積))，25～26 min:(100%B～20%B(體積))，26～30 min：(20%B(體積))；流速為0.5 ml/min；柱溫35℃；紫外吸收檢測(cè)器波長(zhǎng)為325 nm。

質(zhì)譜檢測(cè)采用島津液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS-8040），液相條件與HPLC相同，質(zhì)譜條件：霧化氣流速N23.0 L/min，電噴霧離子源（ESI），加熱塊溫度400℃，Q3 正離子掃描模式，m/z測(cè)定范圍100～400，測(cè)定時(shí)間0～30 min，掃描速度909 u/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于轉(zhuǎn)錄組分析的甘草黃酮合酶挖掘

由于脹果甘草的基因組尚未解析，為了獲得甘草的FNS Ⅱ建立了脹果甘草的轉(zhuǎn)錄組分析方案。以已報(bào)道的大豆來源的FNS Ⅱ(CYP93B16)[21]為模板對(duì)脹果甘草轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行氨基酸序列同源比對(duì)分析共獲得214條候選序列。序列同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)只有四條基因：Gur.gene26505、Gur.gene26116、Gur.gene26926、Gur.gene26365 與CYP93B16[21]的氨基酸序列相似度在45%以上（表3），且將214 條候選序列與已知功能的甘草[34]、大丁草[35]、苜蓿[36]等來源的CYP93B 家族的細(xì)胞色素P450（表4）構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖3）表明這四條基因均屬于CYP93B 家族的細(xì)胞色素P450。因此，Gur.gene26505、Gur.gene26116、Gur.gene26926 和Gur.gene26365 被確定為具有潛在功能的黃酮合酶。同時(shí)，分子進(jìn)化樹也表明Gur.gene26505 屬于黃酮合酶Ⅱ分支可催化黃烷酮只生成黃酮[21]，而Gur.gene26116、Gur.gene26926 和Gur.gene26365 屬于黃酮2 位羥化酶（F2H）分支催化黃烷酮生成黃酮和2-羥基黃烷酮[34]（圖4）。

圖3 進(jìn)化樹分析Fig.3 Evolutionary tree analysis

圖4 黃酮合酶Ⅱ和黃酮2位羥化酶功能比較Fig.4 Comparison of flavonoid synthase Ⅱand flavonoid 2-hydroxylase

表3 候選基因信息Table 3 Candidate genes information

表4 不同來源CYP93B家族的基因Table 4 CYP93B family of genes from different plants

2.2 候選黃酮合酶的催化功能表征

為了表征4 個(gè)候選基因的功能，通過對(duì)甘草根的總RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建其cDNA 文庫(kù)。以cDNA 文庫(kù)為模板，成功擴(kuò)增了Gur.gene26505 和Gur.gene26116 基因并測(cè)序驗(yàn)證序列正確。構(gòu)建其釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，分別命名為Yeast-F01 和Yeast-F02。通過外源添加甘草素的方式進(jìn)行細(xì)胞催化反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示，結(jié)果表明重組菌Yeast-F01在外源添加了底物甘草素之后，以甘草素為底物特異性生成了7,4′-二羥基黃酮，而Yeast-F02的產(chǎn)物峰除7,4′-二羥基黃酮之外還有兩個(gè)產(chǎn)物峰（2-羥基甘草素及其互變異構(gòu)體）[34]（圖5）。表明Gur.gene26505 可催化甘草素特異性合成7,4′-二羥基黃酮，屬于新的甘草黃酮合酶Ⅱ，而Gur.gene26116的產(chǎn)物較多、特異性較差，屬于黃酮2位羥化酶。

圖5 甘草黃酮合酶Ⅱ候選基因的功能表征Fig.5 Functional characterization of candidate genes of flavone synthase Ⅱ

為了表征2 個(gè)工程菌（Yeast-F01 和Yeast-F02）合成7,4′-二羥基黃酮的能力，分別添加相同濃度（1 mmol/L）的甘草素反應(yīng)48 h 測(cè)定7,4′-二羥基黃酮的產(chǎn)量。以1 g的干細(xì)胞合成的7,4′-二羥基黃酮質(zhì)量（mg）為衡量指標(biāo)對(duì)2個(gè)工程菌株的合成能力進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果如圖6 所示，表達(dá)Gur.gene26505 的工程菌Yeast-F01 底物轉(zhuǎn)化率達(dá)17.44%，同時(shí)其細(xì)胞催化活性達(dá)3.4 mg/g，是Yeast-F02 細(xì)胞催化活性的2 倍。因此，表達(dá)Gur.gene26505 的工程菌Yeast-F01 除了具有產(chǎn)物特異性的優(yōu)點(diǎn)之外其催化活性也高，但是其底物轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低。

圖6 工程菌合成7,4′-二羥基黃酮能力評(píng)估(細(xì)胞催化活性(mg/g)=7,4′-二羥基黃酮的濃度(mg/L)/細(xì)胞干重(g/L)；甘草素轉(zhuǎn)化率(%)=7,4′-二羥基黃酮的濃度(mmol/L)/甘草素初始添加量(mmol/L)）Fig.6 Evaluation of the ability of engineering bacteria to synthesize 7,4′-dihydroxyflavone

2.3 黃酮合酶Ⅱ（Gur.gene26505）特異性催化機(jī)理探究

為了探究Gur.gene26505 和Gur.gene26116 催化甘草素產(chǎn)物差異的原因，利用AlphaFold2 對(duì)Gur.gene26505 和Gur.26116 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并將中間羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素與其進(jìn)行分子對(duì)接和100 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬（圖7），發(fā)現(xiàn)Gur.gene26505 的蛋白結(jié)構(gòu)中312 位天冬氨酸的氧原子與2-羥基甘草素3號(hào)位的氫原子形成了氫鍵相互作用可將其奪走，并且315 位蘇氨酸的氫原子與2-羥基甘草素2號(hào)位的羥基氧原子形成了氫鍵相互作用[圖8(a)]，使其容易離去從而生成碳碳雙鍵得到最終產(chǎn)物7,4′-二羥基黃酮；Gur.gene26116 結(jié)構(gòu)中同樣具有300 位天冬氨酸和303 位蘇氨酸的脫水活性中心，使其具有合成7,4′-二羥基黃酮的能力，但是其117 位的大位阻苯丙氨酸殘基處在一個(gè)柔性loop 結(jié)構(gòu)上[圖8(d)]，由于柔性loop 往里收縮導(dǎo)致117 位的苯丙氨酸靠近羥化中心阻礙了羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素的位置轉(zhuǎn)變[圖8(b)]，從而使部分羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素?zé)o法進(jìn)入脫水中心導(dǎo)致Gur.gene26116 產(chǎn)物復(fù)雜。相反，Gur.gene26505 活性口袋附近特有的剛性結(jié)構(gòu)β 片層[圖8(c)]使大位阻苯丙氨酸殘基翻轉(zhuǎn)至羥化中心下方，消除了羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素進(jìn)入脫水中心的阻力，進(jìn)而發(fā)生C2-C3位的脫水反應(yīng)特異性生成7,4′-二羥基黃酮[圖8(a)]。

圖7 Gur.gene26505和Gur.gene26116分子動(dòng)力學(xué)模擬的均方根偏差數(shù)據(jù)Fig.7 The root mean square deviation data for molecular dynamics simulations of Gur.gene26505 and Gur.gene26116

圖8 Gur.gene26505特異性催化機(jī)理Fig.8 Specific catalytic mechanism of Gur.gene26505

2.4 高效合成7，4′-二羥基黃酮的細(xì)胞催化工藝

為了實(shí)現(xiàn)7,4′-二羥基黃酮的高效合成，采取了目的基因Gur.gene26505過表達(dá)，優(yōu)化甘草素添加時(shí)間、催化時(shí)間以及強(qiáng)化細(xì)胞生長(zhǎng)過程的策略。首先選擇可催化甘草素特異性合成7,4′-二羥基黃酮的Gur.gene26505 分別構(gòu)建了其在釀酒酵母的單拷貝、多拷貝位以及單拷貝和多拷貝位點(diǎn)同時(shí)整合的重組菌Yeast-F01、Yeast-F03 和Yeast-F04，外源添加相同濃度（1 mmol/L）的甘草素反應(yīng)48 h測(cè)定甘草素的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖9(a)所示，隨著Gur.gene26505整合位點(diǎn)拷貝數(shù)的增加，底物轉(zhuǎn)化率逐漸升高，Gur.gene26505 過表達(dá)的重組菌株Yeast-F04 轉(zhuǎn)化率上升至29.40 %，是重組菌Yeast-F03 和Yeast-F01 的1.5 倍和1.7 倍，表明過表達(dá)Gur.gene26505 可以一定程度提高底物轉(zhuǎn)化率。

其次，考察了不同底物添加時(shí)間、催化時(shí)間對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明隨著底物添加時(shí)間點(diǎn)的延后，底物轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在0～36 h 之內(nèi)添加底物時(shí)底物轉(zhuǎn)化率維持在25%以上，其中在6 h時(shí)底物轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到33.57%[圖9(b)]。另外發(fā)現(xiàn)隨著催化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底物甘草素的轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，最高達(dá)50.20%[圖9(c)]，但是后期84～96 h 幾乎趨于平穩(wěn)并且細(xì)胞干重在60 h 之后不再增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和生物量限制了底物轉(zhuǎn)化率的進(jìn)一步上升。

圖9 條件優(yōu)化提高底物轉(zhuǎn)化率Fig.9 Conditional optimization to improve substrate conversion

因此，基于酵母細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的影響，為了使得整個(gè)催化過程酵母全細(xì)胞具有高的生物量進(jìn)一步提高底物轉(zhuǎn)化率，對(duì)培養(yǎng)基成分酵母粉、蛋白胨、葡萄糖進(jìn)行過程添加強(qiáng)化菌體生長(zhǎng)，從接種開始每隔12 h 分別添加培養(yǎng)基成分至其初始濃度，結(jié)果[圖9(d)]表明酵母粉的過程添加會(huì)促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)使底物的轉(zhuǎn)化率提高，最高轉(zhuǎn)化率在84 h 可以達(dá)到76.67%，并且縮短了催化的時(shí)間，提高了催化工藝的效率。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，0～36 h 內(nèi)添加底物以及通過強(qiáng)化菌體生長(zhǎng)都可提高底物轉(zhuǎn)化率的原因在于，這些策略可以使細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而為Gur.gene26505催化的反應(yīng)（圖2）提供充足的輔因子NADPH 的供應(yīng)，從而提高底物轉(zhuǎn)化率。同時(shí)，過表達(dá)Gur.gene26505 和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間也為催化過程提供了充足的催化劑和底物識(shí)別反應(yīng)的時(shí)間。因此最佳催化工藝的建立和酶的催化特性息息相關(guān)。

綜上所述，結(jié)合酶的催化特性選用過表達(dá)Gur.gene26505 的工程菌Yeast-F04 在接種后6 h 添加1 mmol/L 的甘草素作為底物，反應(yīng)84 h，期間每隔12 h 補(bǔ)加終濃度為1%的酵母粉，最終底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)到76.67%。

3 結(jié) 論

（1）利用氨基酸序列同源比對(duì)以及分子進(jìn)化樹分析成功從脹果甘草中挖掘并克隆到2 個(gè)黃酮合酶：Gur.gene26505和Gur.gene26116。

（2）利用細(xì)胞催化的方式成功實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母細(xì)胞催化甘草素合成7,4′-二羥基黃酮。構(gòu)建了Gur.gene26505 和Gur.gene26116 的釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合分子進(jìn)化樹分析通過外源添加甘草素表征發(fā)現(xiàn)Gur.gene26505屬于黃酮合酶Ⅱ，Gur.gene26116屬于黃酮2位羥化酶。

（3）探究了Gur.gene26505 和Gur.gene26116 催化產(chǎn)物不同的原因。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子對(duì)接以及分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，Gur.gene26505 催化產(chǎn)物單一的原因是活性口袋附近特有的剛性結(jié)構(gòu)β片層使大位阻苯丙氨酸殘基翻轉(zhuǎn)至羥化中心下方，消除了羥化產(chǎn)物2-羥基甘草素進(jìn)入脫水中心的阻力，進(jìn)而發(fā)生C2-C3位的脫水反應(yīng)特異性生成7,4′-二羥基黃酮。

（4）通過細(xì)胞催化體系條件優(yōu)化和細(xì)胞生長(zhǎng)強(qiáng)化，構(gòu)建了高效合成7,4′-二羥基黃酮的細(xì)胞催化工藝。以單倍體釀酒酵母（BY4742）作為宿主菌，過表達(dá)甘草源黃酮合酶Ⅱ，在接種6 h 后添加1 mmol/L的底物甘草素，并且通過強(qiáng)化菌體生長(zhǎng)，反應(yīng)84 h后，甘草素的轉(zhuǎn)化率可達(dá)76.67%。本研究為7,4′-二羥基黃酮及其他黃酮類化合物的綠色生物制造提供了新的選擇和理論指導(dǎo)。