雙孢蘑菇出菇的氣體自抑物質(zhì)研究進(jìn)展

張君 齊曼 郭家穩(wěn) 張朝輝 邱立友*

雙孢蘑菇出菇的氣體自抑物質(zhì)研究進(jìn)展

張君1, 2齊曼1郭家穩(wěn)1張朝輝3邱立友1*

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 河南省三門峽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物研究所，河南 三門峽 472000；3. 河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

雙孢蘑菇覆土出菇的機(jī)理尚不明晰。用無(wú)菌活性炭或通以無(wú)菌空氣可以誘導(dǎo)雙孢蘑菇出菇，表明雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)過程中有抑制原基形成的氣體自抑物質(zhì)產(chǎn)生。目前，一種觀點(diǎn)認(rèn)為雙孢蘑菇菌絲合成的氣體自抑物質(zhì)是乙烯，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為是1-辛烯-3-醇。通過查閱相關(guān)研究文獻(xiàn)，評(píng)述近年來有關(guān)這兩種氣體自抑物質(zhì)的合成途徑、功能及其抑制雙孢蘑菇出菇的機(jī)理，提出雙孢蘑菇出菇的氣體自抑物質(zhì)需滿足以下特征：在原基形成前后合成量劇增，抑制原基形成，能夠被特定細(xì)菌類群所利用。根據(jù)這些特征，認(rèn)為雙孢蘑菇菌絲合成的氣體自抑物質(zhì)是乙烯，而非1-辛烯-3-醇。

雙孢蘑菇；覆土；氣體自抑物質(zhì)；原基；乙烯；1-辛烯-3-醇；活性氧

盡管食用菌產(chǎn)業(yè)取得了巨大發(fā)展，但食用菌界仍有許多未解之謎。如：食用菌細(xì)胞中的兩個(gè)單核為什么沒有融合？?jī)蓚€(gè)核中的基因是如何協(xié)調(diào)表達(dá)調(diào)控菌絲生長(zhǎng)和發(fā)育的？為什么食用菌的配子體（單核菌株）和孢子體（雙核菌株）都能獨(dú)立生活？從菌絲發(fā)育成多細(xì)胞的子實(shí)體的調(diào)控機(jī)制是什么？為什么有些食用菌能夠馴化栽培，而有些則很難馴化？為什么一些食用菌必須覆土才能出菇？等等。解開雙孢蘑菇（）等食用菌必須覆土才能出菇的機(jī)理，既有利于破解其子實(shí)體形成之謎，也有利于后續(xù)同類食用菌的馴化和現(xiàn)有栽培效益的提高。

雙孢蘑菇人工栽培之初，人們就發(fā)現(xiàn)栽培該菌時(shí)必須覆土，否則很少或不能出菇[1]。此外，姬松茸（）[2]、印度麗蘑（）[3]、雞腿菇（）[4]、竹蓀（）、巨大口蘑（）、羊肚菌（）、暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（）和大球蓋菇（）等食用菌栽培時(shí)也需要覆土才能出菇。食用菌覆土出菇機(jī)理研究最早、最深入的是雙孢蘑菇。在雙孢蘑菇覆土出菇機(jī)理研究中，受到普遍肯定的是由于雙孢蘑菇菌絲產(chǎn)生的氣體自抑物質(zhì)抑制了原基的形成，覆土中的有益細(xì)菌，主要是假單胞菌，能夠利用這些氣體自抑物質(zhì)，從而解除了其抑制作用。關(guān)于雙孢蘑菇菌絲合成的氣體自抑物質(zhì)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為是乙烯，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為是1-辛烯-3-醇。本文評(píng)述這兩種氣體自抑物質(zhì)的相關(guān)研究進(jìn)展，以期為食用菌高效栽培和出菇機(jī)理研究提供參考。

1 抑制雙孢蘑菇出菇的自抑物質(zhì)是氣體

Stoller（1952）最早對(duì)雙孢蘑菇覆土出菇機(jī)理進(jìn)行研究，認(rèn)為覆土能夠使雙孢蘑菇產(chǎn)生的抑制物降低至非抑制濃度[5]。其他研究者則認(rèn)為覆土為雙孢蘑菇出菇提供了必要的環(huán)境條件，包括孔隙度、持水能力、滲透性和氣體交換量等[6,7]。然而，滅過菌的覆土不能誘導(dǎo)雙孢蘑菇形成原基[8,9]，說明誘導(dǎo)出菇的是覆土中的微生物。隨后大量研究表明，覆土中的細(xì)菌，主要為惡臭假單胞菌（），能夠誘導(dǎo)雙孢蘑菇原基形成[10-13]。用無(wú)菌活性炭[8,10,14]或通以無(wú)菌空氣[15,16]同樣可代替覆土刺激雙孢蘑菇形成子實(shí)體。所以，雙孢蘑菇菌絲產(chǎn)生的自抑物質(zhì)是揮發(fā)性物質(zhì)，覆土中細(xì)菌的作用則是去除氣體自抑物質(zhì)。

2 栽培過程中雙孢蘑菇合成的氣體物質(zhì)

常規(guī)栽培或使用滅菌培養(yǎng)料常規(guī)覆土栽培雙孢蘑菇，均可檢測(cè)出乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、丁烷和異丁烷，以及一氯甲烷、氧硫化碳和二硫化碳。然而，在原基形成后只有乙烯急劇增加，與菌絲生長(zhǎng)階段相比增加6倍，當(dāng)子實(shí)體膨大至適當(dāng)大小時(shí)，乙烯濃度開始降低并至較低的水平。產(chǎn)生的乙烯來自培養(yǎng)料中的雙孢蘑菇菌絲體，而非來自子實(shí)體和覆土中的微生物[17]。產(chǎn)生子實(shí)體的培養(yǎng)料合成的乙烯量比未產(chǎn)生子實(shí)體的培養(yǎng)料高近10倍，而產(chǎn)生子實(shí)體的覆土層與未產(chǎn)生子實(shí)體的覆土層合成的乙烯量則沒有差異[18]。與之類似，香菇（）也可產(chǎn)生乙烯，所不同的是，香菇原基形成后產(chǎn)生的乙烯僅比菌絲生長(zhǎng)階段增加2倍[19]。

1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮和3-辛醇也是雙孢蘑菇生長(zhǎng)發(fā)育過程中合成的主要?dú)怏w物質(zhì)[20,21]，但1-辛烯-3-醇的合成量很低。播種后8～9天，培養(yǎng)室空氣中檢測(cè)不到1-辛烯-3-醇；播種后12～13天，有時(shí)可檢測(cè)到少量的3-辛酮及1-辛烯-3-醇；將發(fā)菌的培養(yǎng)料與土混合進(jìn)行覆土后，可檢測(cè)到大量的3-辛酮和少量的1-辛烯-3-醇；覆土5～6天后，3-辛酮的含量迅速降低，檢測(cè)不到1-辛烯-3-醇。將發(fā)滿菌的培養(yǎng)料破碎后裝入塑料袋中，1-辛烯-3-醇的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未破碎的培養(yǎng)料。培養(yǎng)料破碎后覆土，1-辛烯-3-醇的產(chǎn)量則顯著降低[21]。

3 雙孢蘑菇乙烯合成的途徑及其功能

3.1 雙孢蘑菇乙烯合成的途徑

乙烯是植物的一種重要激素，其合成途徑為1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）途徑，合成途徑的關(guān)鍵酶是ACC合酶（ACC synthase，ACS）和ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）（圖1）。許多真菌能夠合成乙烯，Ilag等[22]測(cè)定的228種真菌中，有58種（占25.6%）能合成乙烯；El-Sharouny[23]從植物病根中分離的81種真菌中有31%的種類能合成乙烯。Arshad等[24]綜述了88種酵母菌和霉菌可合成乙烯，其中霉菌分布于真菌的所有門中。已報(bào)道的食、藥用菌中，能合成乙烯的有牛舌菌（）、硫磺菌（）[25]、金針菇（）、裂褶菌（）[22]、雙孢蘑菇[26]、香菇[19]、糙皮側(cè)耳（）[27]和草菇（）[28]等。應(yīng)用乙烯抑制劑1-MCP處理能夠提高杏鮑菇（）[29]、廣葉繡球菌（）[30]和雞樅菌（）[31]等的保質(zhì)期，表明這些食用菌或許也能夠合成乙烯。

圖1 高等植物和微生物中的乙烯合成途徑（修改自文獻(xiàn)[32]）

注：①乙烯形成酶（Ethylene-forming enzyme）途徑；②2-酮-4-甲基硫代丁酸途徑；③ACC途徑。ACC，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸；ACS，ACC合成酶；ACO，ACC氧化酶；AOA，氨氧乙酸；AVG，氨基乙氧基乙烯甘氨酸；KMBA，2-酮-4-甲基硫代丁酸；MTA，5’-甲硫腺苷；MTR，5’-甲硫基核糖（5’-Methylthioribose，MTR）；MTR-1P，5-甲硫核糖1-磷酸；SAM，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）；SAMS，S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-Adenosylmethionine synthetase，SAMS）。

真菌合成乙烯的途徑已鑒定的有乙烯形成酶（EFE）途徑、2-酮-4-甲基硫代丁酸（KMBA）途徑和ACC途徑[32]（圖1）。如：尖孢鐮刀菌（）[33]、圓弧青霉（）[34]和指狀青霉菌（）[35]等可通過EFE途徑合成乙烯；土曲霉（）[36]和灰葡萄孢菌（）[37]為KMBA途徑，尖孢鐮刀菌[38]也有KMBA途徑；雙孢蘑菇[39]、糙皮側(cè)耳[27]、草菇[40,41]和粘菌中的毛霉?fàn)罹W(wǎng)柄菌（）[42]等則是ACC途徑。

3.2 乙烯對(duì)雙孢蘑菇生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用

乙烯是植物的逆境激素之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段都會(huì)合成，尤其在生物和非生物脅迫條件下，乙烯合成量增加。在逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧積累，誘導(dǎo)乙烯的合成。乙烯通過乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠促進(jìn)還原酶和非酶抗氧化物質(zhì)的合成，從而清除活性氧，維持機(jī)體內(nèi)活性氧的平衡，避免了活性氧過量造成的毒害損傷[43]。關(guān)于真菌的乙烯合成調(diào)控機(jī)制研究得還很少。高溫和高氨條件能夠誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳基因的高表達(dá)和高的乙烯合成量[44]。在雙孢蘑菇子實(shí)體形成過程中，其菌絲的乙烯合成量大幅增加[17,45,46]。雙孢蘑菇和草菇采后子實(shí)體中活性氧含量和乙烯合成量均增加，乙烯利能夠誘導(dǎo)乙烯合成高峰提前[41,47]。

乙烯對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重大的調(diào)節(jié)作用，包括種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、器官成熟和脫落及脅迫響應(yīng)等。同樣的，乙烯對(duì)真菌的生長(zhǎng)發(fā)育、致病性、代謝，以及與植物的共生性也有影響[48]。乙烯抑制雙孢蘑菇和糙皮側(cè)耳菌絲的生長(zhǎng)[27,39,44]。雙孢蘑菇基因的反義轉(zhuǎn)化子的ACO酶活力和乙烯合成量比出發(fā)菌株降低，菌絲中的ACC含量增加，滅菌培養(yǎng)料中的菌絲生長(zhǎng)速度快于出發(fā)菌株，在未滅菌的覆土中出菇比出發(fā)菌株早，在滅菌的覆土材料中能夠出菇，而出發(fā)菌株則不能出菇[39]，表明乙烯對(duì)雙孢蘑菇出菇有抑制作用。乙烯還能誘導(dǎo)雙孢蘑菇采后子實(shí)體的成熟和衰老，縮短貨架期[49]。

3.3 覆土中的細(xì)菌能夠消除乙烯對(duì)雙孢蘑菇出菇的抑制作用

在動(dòng)物飼料中添加益生菌的營(yíng)養(yǎng)和健康作用機(jī)制有：抑制病原菌的粘附，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性地消除病原菌，增強(qiáng)屏障作用，降低腸腔的pH和提高免疫功能等。常用的動(dòng)物益生菌有乳酸桿菌（）、雙歧桿菌（）、乳球菌（）、芽孢桿菌（）、鏈球菌（）和酵母菌等。土壤中的植物有益細(xì)菌趨化和利用根系分泌物到達(dá)根際并定殖，與植物形成互惠關(guān)系，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，被稱為植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）。PGPR促進(jìn)植物生長(zhǎng)的直接機(jī)制有產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素、固氮、產(chǎn)生酶和鐵載體、促進(jìn)鐵和磷等礦物質(zhì)的溶解和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等；間接機(jī)制有生物防治、合成抗生素、螯合根際有效性鐵、分泌水解酶和競(jìng)爭(zhēng)根際生態(tài)位等。尤其是一些可合成ACC脫氨酶的細(xì)菌，其產(chǎn)生的ACC脫氨酶能夠水解乙烯前體物ACC，降低植物的乙烯合成量，解除乙烯對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用，提高植物對(duì)逆境的耐受性[50]。因此，在動(dòng)植物益生菌中僅發(fā)現(xiàn)ACC脫氨酶產(chǎn)生菌能消除植物合成的自抑氣體物質(zhì)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

PGPR中有多種細(xì)菌能夠合成ACC脫氨酶，包括根瘤菌科的根瘤菌屬（）、中華根瘤菌屬（）和農(nóng)桿菌屬（），葉桿菌科的葉桿菌屬（）、中慢生根瘤菌屬（）和固氮螺菌屬（），以及解硫胺素芽孢桿菌屬（）、節(jié)桿菌屬（）、無(wú)色桿菌屬（）、芽孢桿菌屬、短桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、檸檬酸桿菌屬（）、腸桿菌屬（）、萊克勒氏菌屬（）、微球菌屬（）、黃桿菌屬（）、副鏈球菌屬（）、假單胞菌屬、雷氏桿菌屬（）和沙雷氏菌屬（）等。ACC脫氨酶可劈開ACC，生成氨和α-丁酮酸，因此這些具有ACC脫氨酶活性的細(xì)菌能夠以ACC為唯一氮源和碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，且以ACC為代謝依賴型趨化物趨化到達(dá)根際并定殖形成菌膜，與根系形成互惠關(guān)系，以多種機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)。另有大量其他細(xì)菌、酵母菌和真菌也能合成ACC脫氨酶，或具有特定的ACC脫氨酶基因，如酵母菌和真菌中的土星形塞伯林德納氏酵母（）桔青霉（）和棘孢木霉（）[51]假單胞菌是土壤中主要的ACC脫氨酶產(chǎn)生菌，在已測(cè)序的2 591個(gè)假單胞菌菌株的基因組中檢索有ACC脫氨酶的基因，結(jié)果在38個(gè)種的菌株中可檢測(cè)到ACC脫氨酶活性[52]。

在雙孢蘑菇培養(yǎng)料和覆土中存在著豐富的微生物菌群。在培養(yǎng)料第一次發(fā)酵和第二次發(fā)酵時(shí)期，培養(yǎng)料中的微生物通過轉(zhuǎn)化易利用的物質(zhì)如糖分、氨基酸及纖維素、半纖維素等生成微生物生物量[53]。至第二次發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)料中的纖維素和木聚糖50%～60%被降解，而木質(zhì)素則幾乎沒有被降解[54]。培養(yǎng)料第一、二次發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)真菌均為子囊菌，第一次發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌群主要有赤霉菌屬（）、鏈格菌屬（）、微菌屬（）、毛殼屬（）、節(jié)水霉（）和木霉屬；在第二次發(fā)酵階段，則以微菌屬、毛殼屬、嗜熱霉菌屬（）和節(jié)水霉為優(yōu)勢(shì)菌群[55,56]；在發(fā)菌階段，培養(yǎng)料中的雙孢蘑菇替代子囊菌成為優(yōu)勢(shì)菌群[57]。培養(yǎng)料第一次發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群主要有厚壁菌門的芽孢桿菌、瘤胃梭菌（）和嗜熱芽孢桿菌（）等；第二次發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群則以放線菌門的嗜熱多孢菌屬（）、嗜熱雙歧菌屬（）和嗜熱雙孢菌屬（）為主；發(fā)菌階段，培養(yǎng)料中細(xì)菌的多樣性降低，變形菌門細(xì)菌占到細(xì)菌群體的50%，優(yōu)勢(shì)屬是螯臺(tái)球菌屬（），還有屬（未知門）和棲熱菌屬（，隸屬異常球菌-棲熱菌門）[58]。雙孢蘑菇發(fā)菌時(shí)期，培養(yǎng)料中的木質(zhì)素被降解50%，而木聚糖和纖維素僅被降解15%和10%[54]，培養(yǎng)料中的細(xì)菌生物量降低了73%，主要為革蘭氏陰性菌的生物量降低[58,59]。相應(yīng)地，雙孢蘑菇發(fā)菌期培養(yǎng)料中的纖維素酶和木聚糖酶活性幾乎沒有變化或變化較小，而漆酶和錳過氧化物酶活力則急劇增加[60,61]。因此，發(fā)菌期雙孢蘑菇與細(xì)菌的關(guān)系被認(rèn)為是：雙孢蘑菇通過降解木質(zhì)纖維素為細(xì)菌提供糖分，而細(xì)菌則利用糖分合成維生素，為雙孢蘑菇提供其自身無(wú)法合成的維生素營(yíng)養(yǎng)[59]。

覆土中的主要真菌是子囊菌門、球囊菌門和接合菌門，隨著雙孢蘑菇在覆土中的定殖，逐漸被擔(dān)子菌門所取代。覆土中主要的細(xì)菌門有變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和酸桿菌門，隨著雙孢蘑菇在覆土中的定殖，細(xì)菌中變形菌門的相對(duì)豐度增加，而放線菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度降低。共有69個(gè)屬的細(xì)菌在覆土層中的組成相對(duì)穩(wěn)定，其中以變形菌門的鞘氨醇桿菌（）和假單胞菌，以及擬桿菌門的黃桿菌（）為主[62, 63]。隨著雙孢蘑菇在覆土中的定殖，覆土中的細(xì)菌生物量迅速降低，但在第一潮菇期間有所增加并維持到第二潮菇采收[58]。然而，覆土中的假單胞菌則不減反增，假單胞菌數(shù)量與細(xì)菌總數(shù)的比值從覆土開始時(shí)的0.1分別增加至原基期的0.66和采收期的0.7[64]。

覆土材料中的木質(zhì)纖維素含量幾乎沒有變化，表明覆土層在雙孢蘑菇生產(chǎn)中所起的營(yíng)養(yǎng)作用很小[58]。但覆土層的高含水量能夠提高菇產(chǎn)量，表明覆土層的供水能力對(duì)雙孢蘑菇生長(zhǎng)發(fā)育非常重要[65]。

在雙孢蘑菇培養(yǎng)料和覆土中可分離到大量能夠合成ACC脫氨酶和以ACC為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)的細(xì)菌，其比例約占可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的9%～31%[66,67]。ACC脫氨酶產(chǎn)生菌能夠趨化雙孢蘑菇菌絲分泌的ACC，在菌絲表面形成菌膜，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，減少乙烯合成[68,69]。將細(xì)菌的ACC脫氨酶基因轉(zhuǎn)入雙孢蘑菇，能夠降低菌絲中的ACC含量，減少乙烯合成，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)和早出菇[68]。研究表明，在滅菌覆土或蛭石替代覆土中添加ACC脫氨酶產(chǎn)生菌，能夠促進(jìn)雙孢蘑菇早出菇，提高產(chǎn)量，ACC脫氨酶產(chǎn)生菌的數(shù)量與雙孢蘑菇產(chǎn)量呈正相關(guān)[67,70]。進(jìn)一步證實(shí)乙烯對(duì)雙孢蘑菇出菇有抑制作用。

但也有相反的報(bào)道。Co2+是ACO抑制劑，在覆土中添加0.8 mM CoCl2而不補(bǔ)充乙烯，會(huì)延遲雙孢蘑菇菌株S-281的出菇并降低產(chǎn)量，但不延遲U3菌株的出菇卻降低其產(chǎn)量[71]；在覆土中添加0.8 mM CoCl2并補(bǔ)充乙烯，既不延遲S-281出菇也不降低產(chǎn)量。因此，認(rèn)為乙烯對(duì)雙孢蘑菇出菇?jīng)]有抑制作用。該研究中的覆土并沒有滅菌，覆土中的細(xì)菌能夠降低雙孢蘑菇合成的乙烯量，消除乙烯對(duì)雙孢蘑菇出菇的影響；補(bǔ)充乙烯可能是降低了氧的分壓強(qiáng)，從而有利于出菇和提高產(chǎn)量，因?yàn)檫^低或過高的二氧化碳濃度都不利于出菇和高產(chǎn)[72]。另外，添加氯化鈷增加了覆土中的鹽分濃度，可能也是導(dǎo)致產(chǎn)量降低的原因[73]。

3.4 乙烯抑制雙孢蘑菇出菇的機(jī)理

盡管蕈菌形成子實(shí)體的機(jī)制還不清楚，但應(yīng)當(dāng)與活性氧有關(guān)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，真核生物的有性繁殖是其適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化脅迫的一種方式。細(xì)胞在代謝過程中積累的活性氧會(huì)損傷DNA并極大提高基因組的突變速率。通過減數(shù)分裂進(jìn)行DNA的配對(duì)和重組，是真核生物維持基因組的穩(wěn)定和清除有害突變的有效方式[74]。敲除主要的活性氧合成酶NADPH氧化酶A基因，構(gòu)巢曲霉不能形成有性生殖閉囊殼[75]。同樣地，下調(diào)表達(dá)NADPH氧化酶A，平菇和靈芝的子實(shí)體形成受到影響[76,77]。因此，食用菌出菇的機(jī)理可能是，在低溫、光照、氧或機(jī)械損傷等誘導(dǎo)下，菌絲中活性氧迸發(fā)，啟動(dòng)有性生殖程序，形成子實(shí)體。然而，乙烯通過其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠上調(diào)抗氧化酶和合成抗氧化物質(zhì)的基因的表達(dá)，從而清除活性氧，消除活性氧對(duì)原基形成的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致不能出菇。

乙烯之所以抑制雙孢蘑菇的出菇，與其在雙孢蘑菇子實(shí)體形成和發(fā)育過程中的大量合成密切相關(guān)。雙孢蘑菇是草腐菌但卻具有白腐菌的特性，能夠合成漆酶和錳過氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）從而利用木質(zhì)素[61]。漆酶是雙孢蘑菇主要的胞外蛋白，與菌絲生物量呈顯著正相關(guān)[78]。常規(guī)栽培雙孢蘑菇，子實(shí)體原基形成和發(fā)育階段漆酶和MnP活力達(dá)到最大，當(dāng)?shù)谝怀惫绞斋@時(shí)酶活性明顯降低[61]，原因可能是，在子實(shí)體發(fā)育過程中，雙孢蘑菇需要在短時(shí)間內(nèi)合成大量的細(xì)胞物質(zhì)供子實(shí)體膨大，因此該時(shí)期許多酶包括漆酶和MnP的活力達(dá)到最大，以提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。漆酶是單電子氧化還原酶，催化氧化酚類和芳香胺類化合物時(shí)會(huì)在細(xì)胞中積累較多的活性氧，MnP在催化過程中同樣有活性氧形成[79]，再加上低溫誘導(dǎo)子實(shí)體形成時(shí)NADPH氧化酶合成的活性氧，菌絲細(xì)胞中活性氧的積累急劇增加，活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞合成乙烯[80]，使乙烯合成量在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增加。當(dāng)子實(shí)體發(fā)育到適當(dāng)大小時(shí)不再繼續(xù)膨大，菌絲不再需要大量合成細(xì)胞物質(zhì)，漆酶和MnP的活力及乙烯合成量隨之降低。

同樣需要覆土才能出菇的姬松茸[81]和雞腿菇[82]，其漆酶和過氧化物酶的活力同樣在子實(shí)體形成期達(dá)到高峰。香菇子實(shí)體形成和發(fā)育過程中乙烯合成量少于雙孢蘑菇，可能與其在此過程中漆酶活力及其基因表達(dá)量迅速下降而纖維素酶活力及其基因表達(dá)量迅速增加有關(guān)[83]。平菇子實(shí)體形成和發(fā)育過程中漆酶和纖維素酶活力的變化與香菇相似[84]。

抑制雙孢蘑菇出菇的乙烯來自培養(yǎng)料中的雙孢蘑菇菌絲，雙孢蘑菇培養(yǎng)料中也生活有ACC脫氨酶產(chǎn)生菌，也能夠降解雙孢蘑菇菌絲合成的ACC，為什么還需要覆土呢？一方面隨著雙孢蘑菇菌絲的生長(zhǎng)，菌絲對(duì)細(xì)菌、尤其是對(duì)革蘭氏陰性菌的降解，導(dǎo)致培養(yǎng)料中的細(xì)菌數(shù)量極大地降低，培養(yǎng)料中假單胞菌的數(shù)量極低。另一方面，隨著雙孢蘑菇菌絲的生長(zhǎng)，培養(yǎng)料中的氧氣越來越缺乏，雙孢蘑菇菌絲可以通過表面菌絲向培養(yǎng)料內(nèi)部的菌絲供氧，但培養(yǎng)料中的細(xì)菌則因缺氧而降低了代謝活性。例如，我們?cè)谠嚬芑蛟耘啻醒b入添加了ACC脫氨酶產(chǎn)生菌的滅菌培養(yǎng)料，開始階段細(xì)菌對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯，之后幾乎沒有促生作用，分析可能與培養(yǎng)料中缺氧有關(guān)。覆土中含水量高，培養(yǎng)料中的菌絲的代謝產(chǎn)物包括ACC和草酸鈣等，能夠通過毛細(xì)作用擴(kuò)散到覆土層，為覆土層中的ACC脫氨酶產(chǎn)生菌提供碳源和氮源，使其中的ACC脫氨酶產(chǎn)生菌數(shù)量大大增加（圖2），這些ACC脫氨酶產(chǎn)生菌水解ACC，降低菌絲合成的乙烯量，解除乙烯對(duì)菌絲形成子實(shí)體的抑制作用。同時(shí)，隨著草酸鈣通過毛細(xì)管擴(kuò)散到覆土層，也解除了草酸鈣對(duì)菌絲的影響。雙孢蘑菇菌絲在培養(yǎng)料中生長(zhǎng)時(shí)，在菌絲表面會(huì)形成草酸鈣結(jié)晶，形成的草酸鈣結(jié)晶越多，表明菌絲活性越強(qiáng)，菇產(chǎn)量就越高。覆土后菌絲表面的草酸鈣結(jié)晶即消失[85,86]。到達(dá)覆土的草酸鈣也是覆土中細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖2 雙孢蘑菇栽培過程中培養(yǎng)料和覆土中細(xì)菌和假單胞菌 16S rRNA V4區(qū)拷貝數(shù)的變化（數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[87]）

注：D0，建堆時(shí)的培養(yǎng)料；PI，第一次發(fā)酵結(jié)束的培養(yǎng)料；PII，第二次發(fā)酵結(jié)束的培養(yǎng)料；PIII，雙孢蘑菇發(fā)菌結(jié)束的培養(yǎng)料；Ca，覆土前的覆土；CaF1，低溫誘導(dǎo)至第一潮菇采收期間的中段時(shí)間的覆土；CaF2，第一潮菇采收后至第二潮菇采收期間的中段時(shí)間的覆土；CoF1，低溫誘導(dǎo)至第一潮菇采收期間的中段時(shí)間的培養(yǎng)料；CoF2，第一潮菇采收后至第二潮菇采收期間的中段時(shí)間的培養(yǎng)料。

4 雙孢蘑菇合成1-辛烯-3-醇的途徑及其功能

4.1 雙孢蘑菇合成1-辛烯-3-醇的途徑

1-辛烯-3-醇是最早在松茸（）中發(fā)現(xiàn)的一種香味物質(zhì)[88]，隨后在多種真菌、動(dòng)植物及其制品中被發(fā)現(xiàn)。在雙孢蘑菇中，1-辛烯-3-醇的合成途徑可能是，不飽和脂肪酸主要是亞油酸，在脂氧合酶或含血紅素雙加氧酶作用下，加上一個(gè)氧分子，生成 (8E,12Z)-10-氫過氧十八碳-8,12-二烯酸，然后被氫過氧化物裂解酶裂解生成等摩爾的1-辛烯-3-醇和10-氧-反-8-葵烯酸（圖3）。當(dāng)雙孢蘑菇菌絲或子實(shí)體受到損傷時(shí)，1-辛烯-3-醇的合成量大幅度增加。如雙孢蘑菇切片后1-辛烯-3-醇的合成量是完整子實(shí)體的10余倍[89]。

圖3 雙孢蘑菇中推測(cè)的1-辛烯-3-醇生物合成途徑（修改自文獻(xiàn)[90]）

4.2 1-辛烯-3-醇的生物學(xué)功能

1-辛烯-3-醇對(duì)細(xì)菌的作用如同抗生素，低濃度促生、高濃度抑制。將分離自雙孢蘑菇覆土中的274 株細(xì)菌置于含有0.05%的1-辛烯-3-醇的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，約97%的菌株能夠生長(zhǎng)[64]。然而，高濃度的1-辛烯-3-醇則能夠抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的最低抑制濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）分別是1.0 mg/mL和4.0 mg/mL；對(duì)革蘭氏陰性菌的MIC和MBC分別是2.0 mg/mL和8.0 mg/mL；對(duì)銅綠假單胞菌（）的最低抑菌濃度是1 000 μg/g和2.0 mg/mL，最低殺菌濃度是8.0 mg/mL[91,92]。1-辛烯-3-醇的抑菌機(jī)理是破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，誘導(dǎo)細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外溢，對(duì)DNA則沒有破壞作用[91]。

1-辛烯-3-醇對(duì)真菌的作用表現(xiàn)為多種機(jī)制。一是真菌的適應(yīng)性因子。當(dāng)濃度為0.1 μM時(shí)可誘導(dǎo)木霉形成分生孢子，但當(dāng)濃度為500? μM時(shí)則抑制分生孢子的形成[93]。低劑量1-辛烯-3-醇處理可提高黃曲霉（）毒素及其前體物的合成[94]。二是真菌毒素作用。高劑量1-辛烯-3-醇處理可抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成[94]。三是群體感應(yīng)分子，自我抑制劑。在展青霉（）分生孢子不同萌發(fā)階段，越早添加1-辛烯-3-醇對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，改變細(xì)胞膜的滲透性，干擾細(xì)胞基本的代謝過程，如分生孢子的吸水膨脹和萌發(fā)，但這個(gè)過程是可逆的[95]。四是真菌的細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)。黃曲霉編碼合成1-辛烯-3-醇的酶的基因突變，增加了菌核數(shù)量，減少了分生孢子數(shù)量[96]。

4.3 1-辛烯-3-醇抑制雙孢蘑菇出菇

1-辛烯-3-醇也是雙孢蘑菇合成的一種氣體物質(zhì)，是生物中普遍存在的氧脂類信號(hào)分子。Wood等于1982年發(fā)現(xiàn)在平板培養(yǎng)皿中，1-辛烯-3-醇抑制雙孢蘑菇子實(shí)體的形成但不抑制菌絲的生長(zhǎng)[97]。在微培養(yǎng)系統(tǒng)中有1-辛烯-3-醇揮發(fā)，能夠提高覆土中細(xì)菌的總數(shù)和假單胞菌的數(shù)量，但對(duì)原基的形成和發(fā)育有顯著抑制作用[16]。在空氣中流加0.035%的1-辛烯-3-醇，可抑制雙孢蘑菇原基的形成[98]。空間中短暫或連續(xù)揮發(fā)1-辛烯-3-醇，第一潮菇產(chǎn)量顯著降低，但對(duì)第二潮菇?jīng)]有影響?？臻g中短暫或連續(xù)揮發(fā)1-辛烯-3-醇5天，覆土中的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)沒有差異，到第12 天才出現(xiàn)差異，但到第19天短暫揮發(fā)則沒有差異，只有連續(xù)揮發(fā)才會(huì)升高。空間中短暫或連續(xù)有1-辛烯-3-醇揮發(fā)5天、12天，熒光假單胞菌的數(shù)量均顯著增加，但到第19天，僅連續(xù)揮發(fā)下菌數(shù)才顯著增加[99]。

在雙孢蘑菇出菇實(shí)驗(yàn)中所使用的1-辛烯-3-醇的濃度可能過高[16,98]。Turner 等在雙孢蘑菇栽培室內(nèi)沒有檢測(cè)到1-辛烯-3-醇[17]，Pfeil1等[21]在培養(yǎng)室空氣中僅檢測(cè)到痕量的1-辛烯-3-醇，只有在菌絲受到損傷時(shí)才合成較多的1-辛烯-3-醇。另外也忽視了雙孢蘑菇合成1-辛烯-3-醇時(shí)，同時(shí)還合成有10-氧-反-8-癸烯酸（10-Oxo-trans-8-decenoic acid，10-ODA）[100]。低濃度10-ODA能夠促進(jìn)雙孢蘑菇菌絲的生長(zhǎng)及子實(shí)體菌柄的伸長(zhǎng)[101,102]。覆土中補(bǔ)充雙孢蘑菇子實(shí)體粉能夠合成更多的1-辛烯-3-醇和10-ODA，同時(shí)提高雙孢蘑菇產(chǎn)量[103]。高濃度的10-ODA則抑制雙孢蘑菇菌絲的生長(zhǎng)[101]。因此，1-辛烯-3-醇應(yīng)當(dāng)不是雙孢蘑菇出菇的自抑物質(zhì)。高劑量的1-辛烯-3-醇抑制出菇的機(jī)制可能是使細(xì)胞膜和線粒體膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞中積累的活性氧進(jìn)一步對(duì)菌絲細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使得菌絲不能正常生長(zhǎng)發(fā)育。一旦消除1-辛烯-3-醇或菌絲對(duì)其產(chǎn)生了適應(yīng)性，這種毒害作用即是可逆的。

我們用1-辛烯-3-醇處理雙孢蘑菇菌絲，菌絲中活性氧得到積累，而用乙烯利處理的菌絲細(xì)胞中的活性氧則被清除（圖4）。具體方法：在分割平板的一側(cè)裝有加富PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)雙孢蘑菇，將蓋玻片滅菌后斜插入菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；取3 g乙烯利溶于1 mL 5 M的氫氧化鈉中或0.5 mL 20 μM的1-辛烯-3-醇，加入分割平板的另一側(cè)，分別于10 min、20 min、30 min取長(zhǎng)有菌絲的蓋玻片，采用DCHF-DA（2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate）進(jìn)行染色檢測(cè)細(xì)胞中的活性氧，用激光共聚焦顯微鏡觀察菌絲中活性氧的變化。以無(wú)菌水處理為對(duì)照。

圖4 乙烯利和1-辛烯-3-醇處理對(duì)雙孢蘑菇菌絲中活性氧的影響

5 結(jié) 論

抑制雙孢蘑菇子實(shí)體形成的氣體自抑物質(zhì)應(yīng)滿足的條件：在原基形成前后合成量較高，對(duì)原基形成有抑制作用，能夠被特定細(xì)菌類群所利用。顯然，乙烯比1-辛烯-3-醇更能滿足這些條件。乙烯抑制雙孢蘑菇出菇的機(jī)理：在低溫誘導(dǎo)出菇和原基形成時(shí)，雙孢蘑菇菌絲中因低溫誘導(dǎo)乙烯合成并積累活性氧，再加上木質(zhì)素降解酶作用積累的活性氧，導(dǎo)致活性氧迸發(fā)，活性氧又進(jìn)一步誘導(dǎo)乙烯的合成；乙烯通過其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)抗氧化酶和合成抗氧化物質(zhì)的基因的表達(dá)，從而清除活性氧，消除了活性氧對(duì)原基形成的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致不能出菇；覆土中的ACC脫氨酶產(chǎn)生菌能夠利用菌絲合成的乙烯前體物ACC，減少菌絲合成的乙烯量，從而消除乙烯對(duì)原基形成的抑制作用（圖5）。盡管高濃度的1-辛烯-3-醇能夠損傷細(xì)胞膜和改變細(xì)胞代謝，對(duì)菌絲有一定的抑制作用，但1-辛烯-3-醇在雙孢蘑菇原基形成前后并沒有大量合成。另外，1-辛烯-3-醇是在菌絲受到損傷時(shí)才大量合成，也不存在被特定的細(xì)菌類群所利用。因此，1-辛烯-3-醇不應(yīng)是雙孢蘑菇出菇的氣體自抑物質(zhì)。

圖5 乙烯抑制雙孢蘑菇出菇的機(jī)制示意圖

注：ACDS，ACC脫氨酶；ACO，ACC氧化酶；ACS，ACC合成酶；Met，甲硫氨酸；ROS，活性氧；SAM，S-腺苷甲硫氨酸。

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Recent advances in the volatile self-inhibitor for mushroom formation of the button mushroom,

Zhang Jun1, 2Qi Man1Guo Jiawen1Zhang Chaohui3Qiu Liyou1

(1. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Key Laboratory of Enzyme Engineering of Agricultural Microbiology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhengzhou, Henan 450002, China; 2. Institute of Biology, Sanmenxia Academy of Agricultural Sciences, Sanmenxia, Henan 472000, China; 3. College of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, Henan 453003, China)

The mechanism of the mushroom formation in the button mushroom () must be induced by casing soils remains uncertain. Other than the casing layer, the mushroom primordia can be stimulated and promoted by sterile activated charcoal or sterile air, indicating that the self-inhibitor of the mushroom formation synthesized by the mushroom mycelia should be volatiles. Currently, one view is that the volatile self-inhibitor is ethylene, and the other view proposes it is 1-octen-3-ol. Referring to the relevant literature in recent years, the synthesis pathway, function and the mechanism of inhibiting the mushroom formation of the two volatile compounds are reviewed. It is suggested that the characteristics of the volatile self-inhibitor of the mushroom formation should be that the synthesis amount increased dramatically before and after the primordia formation, inhibition the formation of the primordia, and could be utilized by specific bacterial community.Based on these characteristics, the volatile self-inhibitor synthesized by the mushroom mycelia is ethylene, not 1-octen-3-ol.

; casing soil; volatile self-inhibitor; primordia; ethylene; 1-octen-3-ol; reactive oxygen species

S646

A

2095-0934（2022）04-248-13

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（202102110044、202102110019）

張君（1992—），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌研究工作。E-mail：961810203@qq.com。

邱立友，男，博士，教授，主要從事食用菌分子生物學(xué)研究。E-mail：qliyou@henau.edu.cn。