血漿miRNA-145、miRNA-183水平在慢性阻塞性肺疾病急性加重期診斷及預(yù)后評估中的應(yīng)用

高健敏，朱勇德，符國平

三亞中心醫(yī)院(海南省第三人民醫(yī)院)急診科 海南三亞 572000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)以不完全可逆性氣流受限為主要特征，患者常伴有呼吸困難、喘息、胸悶等癥狀[1-2]。慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)表現(xiàn)為短期內(nèi)的呼吸系統(tǒng)癥狀明顯，并可見咳嗽、咳痰、喘息等癥狀加重，肺功能快速下降，嚴重時發(fā)生呼吸衰竭，引發(fā)不良預(yù)后[3]。上呼吸道-支氣管細菌、病毒感染為AECOPD發(fā)生的主要誘因，而有效的抗感染治療雖可一定程度上改善患者氣道痙攣現(xiàn)象，緩解臨床癥狀，但仍需生物學(xué)指標(biāo)用于早期診斷，以降低AECOPD的病死率[4]。微小核糖核酸(miRNA)通過影響靶基因的表達，調(diào)控信號通路及炎癥反應(yīng)，參與疾病的發(fā)生及發(fā)展[5]。miRNA-145(miR-145)及miRNA-183(miR-183 )均為miRNA重要成員，兩者在炎癥性肺疾病中表達異常，均參與炎癥及免疫調(diào)節(jié)，在COPD發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6]。本研究探討了血漿miR-145與miR-183水平在AECOPD診斷及預(yù)后評估中的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019年6月至2021年6月海南省第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的COPD患者164例為研究對象，其中AECOPD 102例，穩(wěn)定期COPD 62例。病例納入標(biāo)準：①符合《COPD基層診療指南(2018年)》中的COPD診斷標(biāo)準，且入院后經(jīng)病史、胸片X射線及肺功能等檢查確診。②AECOPD表現(xiàn)為咳嗽、咳痰及喘息等癥狀加重且痰量增多，可伴發(fā)熱，需改變藥物治療方案[7-8]。③穩(wěn)定期COPD表現(xiàn)為呼吸道癥狀輕微或穩(wěn)定，病情與加重前一致[9]。④了解研究內(nèi)容，知曉利弊，簽署知情同意書。排除標(biāo)準：①重要臟器受損者，合并有肺膿腫、肺結(jié)核者，免疫系統(tǒng)疾病者，合并感染性、炎癥性疾病者，合并惡性腫瘤者。②研究及隨訪期間因除病情外其他原因?qū)е碌乃劳稣?。另根?jù)AECOPD組患者年齡、性別、BMI等基本資料匹配同期來院體檢且接受肺功能試驗的健康者82人為對照。本研究符合《赫爾辛基宣言》內(nèi)容。

1.2 肺功能測試使用德國耶格FGY-200型測試儀對受試者進行肺功能測試。記錄第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、FEV1占預(yù)計值的百分比(FEV1%)、FEV1占用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)的百分比(FEV1/FVC)。

1.3 血漿miR-145和miR-183水平的檢測采用實時熒光定量PCR法檢測。采集受試者肘靜脈血5 mL，收集于無菌無RNA離心管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)錅y。采用血漿RNA提取純化試劑盒提取總RNA，并測定總RNA純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行實時熒光定量PCR。miR-145檢測試劑盒、miR-183檢測試劑盒為上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品。以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR條件：95 ℃10 min預(yù)變性；95 ℃15 s變性，60 ℃30 s退火，72 ℃30 s延伸，共45個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算目的mRNA的表達水平。每例重復(fù)測3次，取平均值。

表1 PCR引物

1.4 治療與隨訪AECOPD患者的治療均為常規(guī)擴張支氣管并藥物祛痰，經(jīng)鼻吸入復(fù)方異丙托溴銨(法國勃林格殷格翰公司)2.5 mL/d，連用10 d。治療結(jié)束后采用門診、電話等方式隨訪，截至2021年12月底，記錄患者存活情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。3組性別構(gòu)成、年齡、BMI、血漿miR-145和miR-183水平、肺功能指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估AECOPD患者血漿miR-145、miR-183水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性。繪制血漿miR-145、miR-183水平鑒別診斷AECOPD和穩(wěn)定期COPD的ROC曲線。以死亡為終點事件，分別以血漿miR-145、miR-183水平單獨和聯(lián)合為自變量，輔以性別、年齡作調(diào)整因素，進行Cox回歸，繪制模型預(yù)測預(yù)后的ROC曲線。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組一般情況的比較3組性別、年齡、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組基線資料比較

2.2 3組血漿miR-145、miR-183水平及肺功能的比較AECOPD組血清miR-145、miR-183水平高于穩(wěn)定期組和對照組，穩(wěn)定期組高于對照組。AECOPD組FEV1、FEV1%、FEV1/FVC均小于穩(wěn)定期組和對照組，穩(wěn)定期組小于對照組。見表3。

表3 3組血漿miR-145、miR-183水平及肺功能的比較

2.3 AECOPD患者血漿miR-145和miR-183水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，AECOPD患者血漿miR-145、miR-183水平與FEV1、FEV1%、FEV1/FVC均負相關(guān)，見表4。

表4 AECOPD患者血漿miR-145、miR-183水平與肺功能的相關(guān)系數(shù)

2.4 血漿miR-145、miR-183水平鑒別診斷AECOPD和穩(wěn)定期COPD的價值繪制血漿miR-145、miR-183水平鑒別診斷AECOPD和穩(wěn)定期COPD的ROC曲線，結(jié)果見圖1、表5，兩者均有較高的鑒別診斷價值。

圖1 血漿miR-145、miR-183水平鑒別診斷AECOPD和穩(wěn)定期COPD的ROC曲線

表5 血漿miR-145、miR-183水平鑒別診斷AECOPD和穩(wěn)定期COPD的ROC曲線分析結(jié)果

2.5 血漿miR-145、miR-183水平對AECOPD預(yù)后的預(yù)測價值本研究無失訪病例。以死亡為終點事件，將患者血清miR-145、miR-183水平單獨、聯(lián)合納入Cox回歸模型，輔以性別、年齡作調(diào)整因素，得到3個模型，見表6。對所得3個模型進行ROC分析，結(jié)果見圖2、表7。

表6 各模型中變量的回歸系數(shù)β(SE)

圖2 3個模型的ROC曲線

表7 3個模型的預(yù)后預(yù)測價值分析

3 討論

miRNA的異常表達與感染性炎癥及慢性炎癥的發(fā)生緊密相關(guān)，其在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定及免疫調(diào)節(jié)等方面意義重大[10]。趙盼盼等[11]發(fā)現(xiàn)，miRNA與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，持續(xù)性的炎癥反應(yīng)可造成miRNA的表達失調(diào)及組織修復(fù)、重建，這也是造成支氣管大、小氣道重構(gòu)、血管重塑及肺氣腫等形成的主要因素之一，進而造成COPD發(fā)生。miR-145、miR-183均為miRNA家族成員。研究[12]發(fā)現(xiàn)，miR-145可負調(diào)控KLF5的表達，進而參與香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者血漿miR-183水平明顯升高，且與肺功能指標(biāo)密切相關(guān)。曾宗鼎等[14]研究指出，血漿miR-145及miR-183表達水平升高與COPD患者病情嚴重程度及預(yù)后相關(guān)，兩項聯(lián)合檢測對COPD患者預(yù)后評估具有較高的價值。

本研究結(jié)果顯示，AECOPD患者血漿miR-145、miR-183水平高于穩(wěn)定期COPD患者及對照組，且與FEV1、FEV1%、FEV1/FVC均呈負相關(guān)，提示二者血漿水平與AECOPD病情相關(guān)。二者對AECOPD和穩(wěn)定期COPD的鑒別均具有一定的應(yīng)用價值，對AECOPD預(yù)后也有較高的預(yù)測價值。

綜上所述，AECOPD患者血漿miR-145、miR-183水平與肺功能指標(biāo)均相關(guān)，二者表達升高提示預(yù)后不良，可作為AECOPD患者的診斷及預(yù)后評估指標(biāo)。但目前臨床關(guān)于miR-145、miR-183與AECOPD的研究仍處于探索階段，其作用仍需進一步行大樣本、前瞻性及多中心臨床研究證實，對二者的進一步研究有望為AECOPD的治療提供新思路。