CRAMP對小鼠心臟成纖維細(xì)胞激活、增殖和膠原分泌功能的影響

董 偉，羅 強(qiáng)，高 路，肖莉麗

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

當(dāng)心臟損傷時，心臟中靜止的成纖維細(xì)胞開始激活分化成為具備增殖能力的肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞大量表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，分泌大量的膠原[1]。這種應(yīng)激反應(yīng)在早期對損傷的心臟具有代償作用，然而持續(xù)不斷的肌成纖維細(xì)胞激活和膠原分泌，導(dǎo)致心臟細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，心臟僵硬度增加，心肌傳導(dǎo)受損，最終影響心臟的舒縮功能[2-3]。因此阻斷心臟急性損傷所致的心肌纖維化對預(yù)防心力衰竭至關(guān)重要?？咕脑谛∈笾袨閷?dǎo)管素相關(guān)抗菌肽(cathelicidin-related antimicrobial peptide,CRAMP)，在人類中為白細(xì)胞介素-37，多表達(dá)于免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞和生殖細(xì)胞[4-5]。CRAMP是一種免疫調(diào)節(jié)劑，在人類多種疾病中發(fā)揮重要作用，如動脈粥樣硬化、1型糖尿病[6]。最近研究[4-5，7-8]發(fā)現(xiàn)CRAMP可以抑制心臟缺血/再灌注損傷，改善心肌梗死心臟功能障礙，還可以通過激活A(yù)KT通路抑制心肌肥厚。但是CRAMP是否能夠抑制成纖維細(xì)胞的激活、增殖和膠原分泌功能，尚不清楚。因此，我們采用小鼠心臟成纖維細(xì)胞，探討CRAMP對成纖維細(xì)胞激活、增殖和膠原分泌功能的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑小鼠重組CRAMP蛋白購于Innovagen AB公司，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)購于Sigma公司。本實(shí)驗(yàn)所用一抗包括總的(total，T-)Smad2、Smad3以及磷酸化的(phosphorylated，p-)Smad2、Smad3，購于Cell Signaling Technology公司，Smad4、GAPDH購于Santa Cruz公司，α-SMA抗體和Ⅲ型膠原抗體購于Abcam公司；二抗為羊抗鼠IgG，購于LI-COR公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Roche公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購于Gibco公司。

1.2 小鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取6～8周齡的C57BL6J小鼠(購于北京華阜康生物公司)，頸椎脫臼處死后，在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中消毒后剪開胸腔，快速取出心臟，去除心房和右心室后置于預(yù)冷的D-Hank′s液中沖洗，在含1.25 g/L胰蛋白酶和1 g/L膠原酶的DMEM-F12培養(yǎng)基中剪碎后消化5次，每次10 min，收集消化液離心去上清，將細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM-F12中重懸，用40 μm過濾網(wǎng)過濾后接種于直徑10 cm大皿中，90 min后貼壁細(xì)胞即為心肌成纖維細(xì)胞，采用α-SMA染色進(jìn)行鑒定[9]。

1.3 細(xì)胞處理第一部分實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，每組6復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對照組：細(xì)胞不給予任何處理；TGF-β1組：細(xì)胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h；CRAMP組：細(xì)胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h后再給予0.5 mg/L CRAMP處理24 h[8]。

第二部分實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，每組6復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。TGF-β1組：細(xì)胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h；SIS3組：細(xì)胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h后再給予Smad 3抑制劑SIS3 10 μmol/L處理24 h；CRAMP+SIS3組：細(xì)胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h后再給予CRAMP 0.5 mg/L和SIS3 10 μmol/L處理24 h。

1.4 細(xì)胞增殖活性的MTT檢測在96孔板加入10 μL 5 g/L MTT溶液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度值。設(shè)置只加細(xì)胞不做任何處理的孔板作為對照孔。細(xì)胞增殖活性=樣本吸光度值/對照孔吸光度值。

1.5 α-SMA、Ⅲ型膠原和PCNA蛋白的免疫熒光染色細(xì)胞處理后加入40 g/L多聚甲醛固定5 min，采用體積分?jǐn)?shù)0.02% Triton100 通透5 min，PBS洗滌后用體積分?jǐn)?shù)8%羊血清封閉1 h，采用抗α-SMA和抗Ⅲ型膠原抗體(1∶100稀釋)共同孵育細(xì)胞過夜，采用紅色和綠色熒光二抗孵育細(xì)胞，采用DAPI進(jìn)行核染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照；對于PCNA染色，采用抗PCNA(1∶1 000稀釋)孵育細(xì)胞過夜，采用紅色熒光二抗孵育細(xì)胞，采用DAPI進(jìn)行核染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件分析α-SMA和Ⅲ型膠原的熒光亮度；PCNA陽性細(xì)胞即細(xì)胞染色為紅色，核染色為藍(lán)色，PCNA陰性細(xì)胞只有核染色為藍(lán)色，每組選擇6個200倍視野，計數(shù)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測采用Trizol進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，測定RNA濃度和純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用LightCycler 480 SYBR Green Master Mix體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：5 min 95 ℃；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，循環(huán)42次。引物序列如下：Ⅲ型膠原上游5’-AAGGCTGCAAGATGGAT GCT-3’，下游5’-GTGCTTACGTGGGACAGTCA-3’；α-SMA上游5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’，下游5’-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’；GAPDH上游5’-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3’，下游5’-TCTCCATGGTGGTGAAGACA-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達(dá)量。

1.7 Smad信號通路蛋白表達(dá)的Western blot檢測采用SDS裂解液裂解細(xì)胞，使用BCA 蛋白檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)樣品(50 μg)通過 SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon-FL轉(zhuǎn)移膜(Millipore,美國)。采用 50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃孵育過夜。采用二抗羊抗鼠IgG(1∶100 000稀釋)孵育，DAB顯色。采用Image Lab軟件進(jìn)行條帶分析，內(nèi)參為GAPDH，結(jié)果取目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有觀察指標(biāo)的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組成纖維細(xì)胞增殖活性及PCNA、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖1、2和表1。TGF-β1組成纖維細(xì)胞增殖活性及PCNA、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達(dá)水平均高于對照組，而CRAMP組上述指標(biāo)均低于TGF-β1組。

表1 各組成纖維細(xì)胞增殖活性及PCNA、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達(dá)水平的比較

A:對照組；B：TGF-β1組；C：CRAMP組；紅色表示PCNA，藍(lán)色表示細(xì)胞核

2.2 各組成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達(dá)水平的比較TGF-β1組成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達(dá)水平高于對照組，而CRAMP組Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達(dá)水平低于TGF-β1組，見表2。

表2 各組成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達(dá)水平的比較

2.3 各組成纖維細(xì)胞Smad信號通路蛋白表達(dá)水平的比較TGF-β1組成纖維細(xì)胞p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達(dá)水平高于對照組，而CRAMP組上述指標(biāo)均低于TGF-β1組，見圖3、表3。

A:對照組；B：TGF-β1組；C：CRAMP組；紅色表示Ⅲ型膠原，綠色表示α-SMA，藍(lán)色表示細(xì)胞核

A:對照組；B：TGF-β1組；C：CRAMP組

表3 各組成纖維細(xì)胞Smad信號通路蛋白表達(dá)水平的比較

2.4 Smad抑制劑阻斷CRAMP的作用觀察SIS3組、CRAMP+SIS3組Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)水平均低于TGF-β1組，見圖4、表4。

A:TGF-β1組；B：SIS3組；C：CRAMP+SIS3組；紅色表示Ⅲ型膠原，綠色表示α-SMA，藍(lán)色表示細(xì)胞核

表4 3組成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原和α-SMA表達(dá)水平的比較

3 討論

心臟纖維化是心臟損傷、心肌梗死和其他心臟病共同的病理重塑過程。心臟纖維化破壞心臟中的心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞的通訊和功能，導(dǎo)致收縮功能障礙和心律失常。以往研究[2,10]發(fā)現(xiàn)CRAMP能夠改善心肌梗死后的心功能惡化。CRAMP能夠減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)，改善心功能[11]。但是CRAMP對心肌纖維化的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)CRAMP能夠直接作用于心肌成纖維細(xì)胞，抑制其活化增殖和膠原蛋白的合成，從而遏制心肌纖維化的發(fā)展。

在心臟中，心臟成纖維細(xì)胞可以分化為具有收縮、遷移和分泌特性的成肌纖維細(xì)胞。成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是心臟纖維化的標(biāo)志，肌成纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的活化形式[12]。α-SMA表達(dá)于成肌纖維細(xì)胞的收縮束中，是其分化的主要特征，后者增加細(xì)胞的收縮功能。成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞受多種生長因子和細(xì)胞因子的控制[13]。早期研究[8,14]表明在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心力衰竭模型中，CRAMP可以抑制心臟纖維化的發(fā)展。但是其是否能夠直接作用于成纖維細(xì)胞尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)小鼠重組CRAMP蛋白可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活和增殖，減弱其分泌膠原的能力。

TGF-β1是TGF-β超家族的重要成員，其復(fù)雜的信號通路具有多種作用，可參與調(diào)控多種生物學(xué)功能，例如細(xì)胞生長、分化、凋亡、運(yùn)動和侵襲、組織重塑、血管生成和免疫反應(yīng)[14]。早期TGF-β1信號功能異常發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞中，這些功能異常在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[2]。隨后，研究者[2]發(fā)現(xiàn)TGF-β1是主要的纖維化介質(zhì)，在纖維化的發(fā)展中起著重要的作用。本研究采用TGF-β1作為刺激因子，發(fā)現(xiàn)CRAMP能夠抑制經(jīng)典的TGF-β1-Smad纖維化通路。TGF-β1結(jié)合于成纖維細(xì)胞表面的TGF-β1受體，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Smad2和Smad3磷酸化，p-Smad2和p-Smad3共同結(jié)合于Smad4形成蛋白復(fù)合體，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，直接調(diào)控膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CRMAP可減少心臟成纖維細(xì)胞中Smad2和Smad3的磷酸化，降低Smad4蛋白表達(dá)水平，當(dāng)采用Smad3抑制劑時，CRAMP的抗纖維化作用被消除。因此Smad信號通路是CRMAP在心臟成纖維細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，CRAMP能夠直接作用于心臟成纖維細(xì)胞，抑制其激活和增殖，減弱其分泌Ⅲ型膠原和α-SMA的能力，抑制TGF-β1-Smad纖維化通路。