神經(jīng)病理性疼痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)中SIRT3表達的變化

任秀花，楊慶慶，張晶晶，張義丹，臧衛(wèi)東

鄭州大學基礎醫(yī)學院人體解剖學系 鄭州 450001

組蛋白去乙酰化酶Sirtuin3(SIRT3)作為一種煙酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)依賴性去乙?；?，廣泛表達于腦、心臟、肝臟等代謝旺盛的器官組織[1]。研究[2-3]顯示，SIRT3可通過激活超氧化物歧化酶和過氧化氫酶，促進線粒體對活性氧的清除，保護線粒體免受氧化應激損傷，與線粒體代謝、細胞死亡、免疫和炎癥等生物功能息息相關。背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)為初級感覺神經(jīng)元的胞體所在部位，其氧化應激水平在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展中起著重要作用[4]。本研究通過免疫印跡和免疫熒光標記法，對小鼠DRG中SIRT3的表達及其在神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下的表達變化進行了探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器SIRT3抗體購自Affinity公司，DRG大直徑神經(jīng)元標志物NF200、膠質(zhì)細胞標志物GS、β-actin抗體以及HRP標記的山羊抗兔IgG抗體和山羊抗鼠IgG抗體購自美國Abcam公司，DRG小直徑非肽能神經(jīng)元標志物IB4和中小直徑肽能神經(jīng)元標志物CGRP抗體購自美國Sigma公司，Cy3標記的山羊抗兔IgG和488標記的山羊抗鼠IgG抗體購自美國Jackson ImmunoResearch公司。多聚甲醛、組織裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、抗熒光淬滅劑購自北京索萊寶科技有限公司。Von-Frey絲購自法國Bioseb公司，體視顯微鏡、正置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司，小動物氣體麻醉機購自深圳瑞沃德公司，全自動超薄切片機購自德國Leica公司，生物分光光度計購自德國Thermo公司，電泳、轉(zhuǎn)膜及化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，低速瞬時離心機、磁力攪拌器購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組體重22～25 g的健康成年雄性C57BL/6小鼠購自河南省實驗動物中心(合格證號DW2020070025)。小鼠購買后正常飼養(yǎng)至少7 d以適應環(huán)境(12 h/12 h光照周期，水食自取)，采用隨機數(shù)字表法分為正常組(3只)、假手術組(共12只)和坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)組(12只)。所有動物實驗均已獲得鄭州大學動物保護和使用委員會批準。

1.3 CCI模型的建立使用異氟烷麻醉(體積分數(shù)4%異氟烷用于誘導，體積分數(shù)2%異氟烷用于維持)健康成年雄性C57BL/6小鼠，剃除手術部位及周圍毛發(fā)，隨后使其處于俯臥位并固定左后肢，使用碘伏對去毛部位進行消毒，在股骨外側(cè)上方縱行切開皮膚以及順肌紋鈍性分離股二頭肌，暴露并分離坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)主干的中部，用手術縫合線以1 mm 的間距進行3次結(jié)扎，結(jié)扎強度以引起腿部肌肉輕度顫動為宜。結(jié)扎完畢后逐層縫合傷口，傷口再次消毒。假手術組小鼠僅做皮膚切口和肌肉鈍性分離，不做坐骨神經(jīng)結(jié)扎。

1.4 各組小鼠機械痛行為學測試采用經(jīng)典的Von-Frey絲測試法(0.07 g和0.40 g)進行機械痛行為學測試。假手術組和CCI組小鼠分別于術前1 d(-1 d)、術后7 d進行測試。每次測試前將小鼠隨機放置于測試位適應30 min，安靜(不來回走動，舔爪)后，先用0.07 g Von-Frey絲垂直作用于小鼠掌跖部無毛處(Von-Frey絲呈“S”形，作用時間6～8 s，相鄰刺激間隔至少7 s，每只腳測量10次)。0.07 g絲測試完畢30 min后開始進行0.40 g Von-Frey絲測試。作用時間內(nèi)，小鼠縮足或舔舐被刺激側(cè)記為陽性反應。機械痛閾值為10次刺激中陽性反應的百分比，即機械縮足頻率(paw withdrawal frequency,PWF)。

1.5 各組小鼠DRG中SIRT3蛋白表達的Western blot檢測術后7 d使用體積分數(shù)4%異氟烷深度麻醉小鼠后快速斷頭處死并取出L3～5腰椎DRG。每組6只小鼠，每2只共6個術側(cè)L3～5DRG合為一個測試樣，用于后續(xù)檢測(因單只動物組織量過小，無法檢測，故合并標本進行檢測)。向每個樣本加入65 μL裂解液，使用低溫研磨儀充分研磨，1 000 r/min 4 ℃離心10 min并取上清液，使用蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度；取30 μg總蛋白進行電泳，260 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，含50 g/L牛血清白蛋白的TBST溶液封閉2 h，隨后使用SIRT3和β-actin一抗(均按1∶1 000稀釋)4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗膜3次后使用山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗(均按1∶10 000稀釋)孵育2 h；TBST洗膜3次；使用ECL發(fā)光試劑盒曝光成像。使用Image J軟件分析，以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.6 SIRT3在DRG中神經(jīng)元的定位使用體積分數(shù)4%異氟烷深度麻醉小鼠3 min，隨后快速打開小鼠胸腔，暴露心臟。使用輸注器于左心室進針，并于右心耳剪口用于液體流出，使用注射用生理鹽水快速灌流至小鼠右心耳造口無血液流出，肝臟變?yōu)槿榘咨ｋS后使用預冷的40 g/L多聚甲醛溶液灌流20 min，灌流結(jié)束后取術側(cè)L3～5DRG組織，置于40 g/L多聚甲醛中4 ℃過夜固定。固定后組織常規(guī)脫水及包埋，4 μm厚切片，每個蠟塊連續(xù)切片6張，60 ℃烤片2 h備用。經(jīng)常規(guī)脫蠟至水的切片使用ddH2O清洗3遍，使用檸檬酸緩沖液(pH 6.0)進行高溫抗原修復，使用PBS清洗3遍，經(jīng)體積分數(shù)10%的山羊血清封閉1 h后，分別用SIRT3(抗體按1∶200稀釋)、SIRT3+NF200(抗體按1∶500稀釋)、SIRT3+IB4(抗體按1∶500稀釋)、SIRT3+CGRP(抗體按1∶500稀釋)、SIRT3+GS(按1∶500稀釋)進行免疫標記(4 ℃過夜)。隨后加入對應的熒光二抗(Cy3標記的羊抗兔IgG或488標記的羊抗小鼠IgG抗體，均按1∶300稀釋)，避光室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，10 min/次。DAPI(按1∶200稀釋)襯染胞核，使用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。每張切片使用Imaging J軟件進行陽性細胞數(shù)的統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計學處理采用Graphpad Prism數(shù)據(jù)分析軟件。應用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較不同時間點各組小鼠機械縮足頻率的差異，應用單因素方差分析比較各組小鼠SIRT3蛋白表達水平的差異，組間兩兩比較使用Sidak′s多因素檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SIRT3在正常小鼠DRG神經(jīng)元中的定位免疫熒光雙標結(jié)果顯示，在正常小鼠DRG中，SIRT3與NF200、CGRP和IB4均有共標(圖1A～C)，且定位于細胞質(zhì)中。SIRT3與GS不共標(圖1D)。SIRT3與各類神經(jīng)元標志物共標率的統(tǒng)計結(jié)果顯示：分別有95.7%的NF200陽性神經(jīng)元(圖1E)、79%的CGRP陽性神經(jīng)元(圖1F)和80.5%的IB4陽性神經(jīng)元與SIRT3共標(圖1G)；在SIRT3陽性神經(jīng)元中，分別有46.4%、51.9%和36%的神經(jīng)元與NF200、CGRP和IB4共標(圖1E～G)。該結(jié)果提示，SIRT3廣泛分布于小鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)的各類神經(jīng)元而非膠質(zhì)細胞中。

A～D：SIRT3分別與NF200、CGRP、IB4和GS雙標示例；藍色為DAPI指示的細胞核；E～G：SIRT3和NF200、CGRP、IB4的免疫熒光陽性率以及共標率統(tǒng)計圖

2.2 假手術和CCI組小鼠機械痛閾值的比較見表1。由表1可知，CCI組小鼠術后7 d機械縮足頻率較術前升高，且高于假手術組，說明CCI手術導致小鼠術側(cè)足底出現(xiàn)了顯著的機械痛覺敏化，模型建立成功。

表1 假手術和CCI組小鼠機械痛閾值的比較

2.3 2組DRG中SIRT3蛋白表達的比較術后7 d，與假手術組(1.00±0.08)相比，CCI組小鼠DRG中SIRT3蛋白(0.46±0.18)表達量降低(t=3.882,P=0.018)。

2.4 2組不同類型DRG神經(jīng)元中SIRT3的表達變化見表2和圖2。神經(jīng)損傷誘導的神經(jīng)病理性疼痛小鼠DRG中SIRT3的下降主要發(fā)生于大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元中。

表2 假手術組與CCI組小鼠不同類型DRG神經(jīng)元中SIRT3表達的比較 %

A～F：假手術組和CCI組小鼠DRG中SIRT3分別與NF200、CGRP以及IB4的雙標結(jié)果

3 討論

初級感覺神經(jīng)元(傷害性感受器)在痛覺傳導通路中負責感知外界傷害性刺激類型、強度、位置并將其轉(zhuǎn)化為電信號，其功能是保證痛覺感知可正常進行的關鍵因素。神經(jīng)損傷、炎癥、化療等刺激均可導致DRG神經(jīng)元發(fā)生如離子通道表達、線粒體損傷、氧化應激等變化而使其處于過度興奮狀態(tài)，參與多種慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展[5-8]。

DRG是初級感覺神經(jīng)元的胞體聚集部位。SIRT3作為Sirtuin家族中主要成員之一，主要定位于線粒體，通過參與線粒體代謝，對多種細胞生理狀態(tài)起著重要調(diào)控作用[9-12]。我們的研究結(jié)果顯示SIRT3在DRG的NF200陽性的有髓神經(jīng)元、CGRP陽性的肽能傷害性感受器以及IB4陽性的非肽能傷害性感受器中均有廣泛表達；在CCI誘導的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下小鼠DRG中SIRT3表達減少，且SIRT3表達減少主要發(fā)生在大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元中，提示SIRT3可能通過影響這兩類神經(jīng)元的功能而參與神經(jīng)病理性疼痛。

隨著近年來針對SIRT3的研究逐漸深入，越來越多的研究成果[7,11]證明，SIRT3可通過調(diào)節(jié)能量代謝和氧化應激而參與如糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，SIRT3在疾病發(fā)生過程中的作用機制也開始被深入探索。作為機體內(nèi)功能活動最為旺盛、ATP需求量最大的細胞之一，神經(jīng)元的生存與活動均極大地依賴于線粒體的正?；顒?。線粒體功能異?？蓪е律窠?jīng)元ROS生成增多，最終導致神經(jīng)元凋亡[13]。有研究[14]表明，SIRT3可以通過抑制線粒體氧化應激來控制細胞存活、代謝和應激反應。SIRT3敲除可使線粒體出現(xiàn)嚴重的呼吸酶缺陷，導致細胞內(nèi)ATP水平降低，提示SIRT3可通過去乙?；せ詈粑付龠M線粒體功能[15]。此外，SIRT3敲除小鼠表現(xiàn)出蛋白乙?；皆黾?，超氧化物歧化酶2活性降低，氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞[15-16]。相反，SIRT3過表達可抑制氧化應激導致的線粒體Ca2+超載，保護神經(jīng)元免受氧化應激損傷[17]。

在腎臟疾病中的研究[18]顯示，近端腎小管SIRT3表達下降和線粒體功能障礙是腎小管損傷與應激的發(fā)生因素之一；在急性腦缺血過程中，SIRT3蛋白表達下降可通過破壞線粒體功能導致神經(jīng)元損傷[19]。結(jié)合我們的研究結(jié)果，在CCI誘導的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元中SIRT3陽性細胞比例減少，我們高度假設SIRT3的減少可能參與了大直徑神經(jīng)元和小直徑非肽能神經(jīng)元的線粒體損傷，進而介導小鼠的痛覺敏化。

我們將進一步在不同的疼痛模型中上調(diào)或下調(diào)SIRT3，繼而觀察對疼痛的行為學影響，以明確SIRT3是否是參與疼痛的重要分子，以及其影響下游的分子機制。同時，我們也將進一步針對SIRT3在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展乃至治療中的作用進行深入研究，以期為將SIRT3作為神經(jīng)病理性疼痛的治療靶點轉(zhuǎn)化為安全可靠的臨床治療手段提供充分的依據(jù)。