新型蛋白互作識(shí)別系統(tǒng)的研究進(jìn)展

于海波

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

蛋白質(zhì)之間的相互作用（Protein-protein interac?tion，PPI）對(duì)于許多生物過(guò)程至關(guān)重要，已得到了廣泛研究［1］。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種傳統(tǒng)的PPI研究方法，這些方法各具優(yōu)勢(shì)，但也有其自身的局限性。為了克服傳統(tǒng)PPI 的局限性，近年來(lái)開(kāi)發(fā)出了幾種新型PPI 識(shí)別系統(tǒng)，這些系統(tǒng)能夠高效地應(yīng)用于PPI 研究。本研究綜述了傳統(tǒng)PPI 研究方法的優(yōu)勢(shì)及其局限性、新型PPI 識(shí)別系統(tǒng)的設(shè)計(jì)以及新型PPI 識(shí)別系統(tǒng)的特點(diǎn)，以期為開(kāi)發(fā)更多高效的PPI 識(shí)別系統(tǒng)提供幫助。

1 傳統(tǒng)PPI研究方法

免疫共沉淀可用于大規(guī)模篩選，然而，這種技術(shù)卻不能區(qū)分直接的相互作用和間接的相互作用［2-4］。酵母雙雜交技術(shù)是一種強(qiáng)大的檢測(cè)PPI 的方法，其可以用于全基因組篩選，并有潛力識(shí)別相對(duì)較弱的PPI，然而，酵母雙雜交技術(shù)經(jīng)常出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性率和假陰性率［5］。熒光共振能量轉(zhuǎn)移能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的PPI，但是，該方法需要靶蛋白高度表達(dá)［4］。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的檢測(cè)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，報(bào)告蛋白熒光可以用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)［6］。由于重組熒光蛋白自身帶有熒光，因此，雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)可以在活細(xì)胞中直接觀察到相互作用，從而避免了用外源性試劑處理細(xì)胞可能引起的一些問(wèn)題［4］。這種直接觀察也有助于PPI 的亞細(xì)胞定位分析［7］。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)可以分析活細(xì)胞中穩(wěn)定的PPI，也可以分析活細(xì)胞中短暫的或經(jīng)過(guò)特殊處理誘導(dǎo)的PPI［4］。例如，使用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)證明了Phot1 在黑暗中以單體的形式存在，而在藍(lán)光處理后可以形成同型二聚體［8］。截至目前，已有超過(guò)10 種熒光蛋白被用于雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)［9］。然而，目標(biāo)蛋白的功能可能會(huì)受雙分子熒光互補(bǔ)片段的影響；此外，還應(yīng)控制融合蛋白的表達(dá)，以排除因融合蛋白過(guò)多而導(dǎo)致的雙分子熒光互補(bǔ)復(fù)合物的非特異性形成；雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的另一個(gè)局限性是發(fā)色團(tuán)成熟緩慢，這意味著該方法不適合檢測(cè)瞬態(tài)和動(dòng)態(tài)的PPI［4］。并且，雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)發(fā)色團(tuán)的成熟在體內(nèi)是不可逆的，這可能導(dǎo)致對(duì)相互作用蛋白定位的錯(cuò)誤判斷［6］。

2 新型PPI識(shí)別系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

2.1 PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)

PafA 介導(dǎo)Pup 與底物蛋白的賴(lài)氨酸結(jié)合［10］。在2018 年，利用細(xì)菌的Pup 蛋白結(jié)合系統(tǒng)，將PafA基因與誘餌蛋白（Bait）進(jìn)行基因融合，它會(huì)將脫氨后的Pup（E）連接到附近的Bait 的賴(lài)氨酸上，同時(shí)，也可以標(biāo)記與Bait 相互作用的獵物蛋白（Prey），從而可以研究PPI，該系統(tǒng)被稱(chēng)為PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)（圖1），在體外試驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)中均證實(shí)了PUP-IT對(duì)較弱的PPI 的識(shí)別作用。此外，因?yàn)镻up（E）停留在PafA 上，底物上的賴(lài)氨酸是否被修飾取決于PafA和Prey 之間的幾何形狀和方向，因此需要在PafA 和Bait 之間添加相對(duì)靈活且長(zhǎng)的連接肽，以便允許結(jié)合的Prey 能夠以不同的幾何形狀呈現(xiàn)，在該系統(tǒng)的所有設(shè)計(jì)中，設(shè)計(jì)者在PafA 和Bait 之間使用了15~20 個(gè)氨基酸的連接肽，同時(shí)，設(shè)計(jì)者也建議在未來(lái)對(duì)分子較大的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)考慮使用較長(zhǎng)的連接肽進(jìn)行有效標(biāo)記［11］。

圖1 PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)

2.2 Mito-docking 系統(tǒng)

基于蛋白質(zhì)的重新定位和富集，2019 年選擇線粒體作為錨定平臺(tái)，將A 錨定到線粒體外膜上作為Bait，從而捕獲并富集其與蛋白B 的相互作用，而不與蛋白A 相互作用的蛋白C 的定位不會(huì)受影響，這樣當(dāng)?shù)鞍譇 和蛋白B 標(biāo)記不同的熒光蛋白時(shí)，通過(guò)使用熒光顯微鏡觀察蛋白B 在線粒體上的重新定位和富集，可以簡(jiǎn)單有效地確定蛋白A 和B 之間的相互作用，此方法被命名為Mito-docking系統(tǒng)（圖2）［12］。

圖2 Mito-docking 系統(tǒng)

設(shè)計(jì)者選擇了外膜移位酶20 kDa 亞基（Translo?case of the outer membrane 20 kDa subunit，Tom20）的膜靶向序列的1~40 位氨基酸和干擾素β 啟動(dòng)子刺激蛋白1（Interferon beta promoter stimulator protein 1，IPS-1）的462~540 位氨基酸分別作為氨基端（Mi?toN）和羧基端（MitoC），將融合蛋白固定在線粒體，首先確定它們是否能將常用的熒光蛋白EGFP 和DsRed2 靶向線粒體，研究發(fā)現(xiàn)融合蛋白在線粒體上的定位是正確的，這表明MitoN 和MitoC 可以有效地將蛋白靶向到線粒體外膜；隨后，設(shè)計(jì)者應(yīng)用該方法檢測(cè)到G 蛋白亞基γ2（Gγ2）和亞基β1（Gβ1）之間的已知相互作用，確定了Mito-docking 系統(tǒng)可以在體內(nèi)有效檢測(cè)PPI［12］。運(yùn)輸受體與貨物蛋白之間的PPI在蛋白質(zhì)的核運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用［13］。但由于這種PPI 是高度動(dòng)態(tài)的，因此通過(guò)傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測(cè)存在困難，設(shè)計(jì)者使用Mito-docking 系統(tǒng)，首次使SV40 核定位信號(hào)和人類(lèi)核輸入蛋白α 受體的PPI 可視化，有助于進(jìn)一步理解核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制［12］。

2.3 splitFAST 系統(tǒng)

光敏黃色蛋白是一種來(lái)自嗜鹽藻的藍(lán)光感光體，Y-FAST 是其工程化變體，Y-FAST 以可逆方式結(jié)合HBR 或HMBR 2 種熒光素，HBR 和HMBR 本身不發(fā)熒光，但是當(dāng)與Y-FAST 結(jié)合時(shí)，它們會(huì)在藍(lán)光激發(fā)時(shí)發(fā)出黃光，Y-FAST 不僅能夠特異性地、瞬時(shí)地結(jié)合熒光素，而且結(jié)合還具有高度動(dòng)態(tài)性和完全可逆性，因此，可以簡(jiǎn)單地通過(guò)添加或去除熒光素來(lái)快速打開(kāi)和關(guān)閉熒光，能夠很好地控制整個(gè)系統(tǒng)［14］。此后，有研究報(bào)道了HBR-3，5DOM 這種新的熒光素可以與Y-FAST 形成緊密復(fù)合物，在綠光激發(fā)下能快速發(fā)出紅光，因此，除了允許對(duì)活細(xì)胞中Y-FAST 標(biāo)記的蛋白進(jìn)行多色成像外，因?yàn)閅-FAST標(biāo)記的可逆性，這些熒光素還可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)顏色切換［15］。有研究對(duì)Y-FAST 做了進(jìn)一步的改進(jìn)，使其形成綠色和紅色熒光報(bào)告基因，能夠分別比綠色熒光蛋白EGFP 和紅色熒光蛋白mCherry 亮1.6 倍和2倍［16］。基于Y-FAST，在2019 年設(shè)計(jì)者將Y-FAST拆分為2 個(gè)片段，即NFAST（1~114 位氨基酸）和CFAST11（115~125 位氨基酸），這是一種可逆的拆分熒光報(bào)告基因，允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)組合的形成和解離，該系統(tǒng)被命名為splitFAST（圖3），通過(guò)連續(xù)除去CFAST11 羧基端的殘基得到CFAST10、CFAST9 和CFAST108，可以進(jìn)一步降低Y-FAST 2個(gè)拆分片段的表觀親和力［17］。

圖3 splitFAST 系統(tǒng)

雷帕霉素是一種天然產(chǎn)物，與FKBP 蛋白結(jié)合，然后，F(xiàn)KBP-雷帕霉素復(fù)合物與FRB 結(jié)合，形成三元 復(fù) 合 物［18］。設(shè) 計(jì) 者 將NFAST 和CFAST10 或CFAST11 分別與FKBP 和FRB 融合，依賴(lài)于雷帕霉素誘導(dǎo)的FRB-FKBP 互作，splitFAST 兩片段互補(bǔ)結(jié)合，引起了熒光的大幅增加，證明了splitFAST 系統(tǒng)具有檢測(cè)經(jīng)HMBR 或HBR-3，5DOM 預(yù)處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PPI 的能力；在胞質(zhì)中表達(dá)FKBPCFAST10 或FKBP-CFAST11 并在質(zhì)膜上表達(dá)FRBNFAST，雷帕霉素的添加導(dǎo)致HMBR 處理的細(xì)胞在質(zhì)膜處快速形成splitFAST 熒光，證明其能夠?qū)崟r(shí)識(shí)別 質(zhì)膜上 的PPI［17］。K-Ras 與Raf1 互作，并將Raf1從細(xì)胞質(zhì)招募到細(xì)胞膜［19］。設(shè)計(jì)者將NFAST 與KRas 融 合 表 達(dá)，CFAST10 與mcherry 融 合 后，再 與Raf1 融合表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)splitFAST 熒光與mCherry熒光共定位并集中在膜上，使用splitFAST 系統(tǒng)驗(yàn)證了K-Ras 與Raf1 的PPI［17］。MEK1 與ERK2 的PPI 發(fā)生 在 胞 質(zhì) 中［20］。將MEK1 與NFAST 融 合 表 達(dá)，ERK2 與CFAST10 融合后，再與mCherry 融合表達(dá)，研究能夠觀察到特異性的胞質(zhì)splitFAST 熒光，這說(shuō)明使用splitFAST 系統(tǒng)也可以驗(yàn)證MEK1 與ERK2 的PPI［17］。核磷酸酶MKP1 能夠?qū)е翬RK2 去磷酸化并失活［21，22］。使用splitFAST 系統(tǒng)能夠檢測(cè)到ERK2 和MKP1 之間位于細(xì)胞核的PPI［17］。

2.4 SIMPL 系統(tǒng)

內(nèi)含肽在自然界中廣泛分布，其有著古老的起源，在細(xì)菌、古細(xì)菌和單細(xì)胞真核生物中均有分布，但在多細(xì)胞生物中是不存在的［23］。內(nèi)含肽被認(rèn)為是一種單一的轉(zhuǎn)換酶，其可以在沒(méi)有任何外部輔助因子或能量的幫助下從前體蛋白中去除自身［24］。內(nèi)含肽作為一種可動(dòng)的遺傳元件，通過(guò)蛋白質(zhì)剪接實(shí)現(xiàn)前體翻譯后自切除，產(chǎn)生活性蛋白［25］。將內(nèi)含肽拆分為2 個(gè)部分，并分別與2 種蛋白相連，在2 個(gè)拆分內(nèi)含肽的作用下，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行反式剪接［26］。GP41-1 拆分內(nèi)含肽是目前已知的反應(yīng)最快的蛋白質(zhì)反式剪接內(nèi)含肽［27］。在2020 年，設(shè)計(jì)者將Bait 在其羧基端與V5 標(biāo)簽和內(nèi)含肽氨基端片段（IN）融合，Prey 在其氨基端與1 個(gè)FLAG 標(biāo)簽和內(nèi)含肽羧基端片段（IC）融合，Bait 和Prey 在選定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)，以研究它們的體內(nèi)PPI，Bait 和Prey 的結(jié)合使IN 和IC 緊密相連，從而使它們能夠重新構(gòu)建功能齊全的內(nèi)含肽，然后催化自身的切除以及Bait 和Prey（包括V5 和FLAG 標(biāo)簽）的連接，可以通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)解析所得的剪接蛋白，而V5 和FLAG 標(biāo)簽的存在允許使用常規(guī)生化技術(shù)可視化或純化蛋白（圖4），設(shè)計(jì)者在該系統(tǒng)中選用GP41-1 拆分內(nèi)含肽，對(duì)其進(jìn)行了重新改造，成功地降低了IN 和IC 2 個(gè)片段的內(nèi)在親和力，并具有良好的剪接性能［28］。

圖4 SIMPL 系統(tǒng)

使用SIMPL 系統(tǒng)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系中驗(yàn)證了雷帕霉素誘導(dǎo)的FKBP1A 和FRB 的PPI，且呈現(xiàn)雷帕霉素濃度依賴(lài)性，在穩(wěn)態(tài)細(xì)胞系中，經(jīng)過(guò)不同劑量的四環(huán)素孵育，誘導(dǎo)細(xì)胞具有不同表達(dá)水平的FRB 和FKBP1A，使用雷帕霉素處理后，在所有樣品中均觀察到FRB 和FKBP1A 的PPI 引起的剪接，這些結(jié)果證明了SIMPL 系統(tǒng)可以用于PPI 研究，并且可以在各種Bait和Prey 表達(dá)水平上研究PPI；為了進(jìn)一步擴(kuò)展系統(tǒng)的檢測(cè)能力，設(shè)計(jì)者設(shè)計(jì)了多種SIMPL 的形式，并驗(yàn)證了多種形式的SIMPL 系統(tǒng)均能有效檢測(cè)PPI［28］。EGFR 發(fā)生自磷酸化后，可以招募SHC1［29］。EGFR 突變體（L858R）活性增強(qiáng)，而EGFR 突變體（D855A）是激酶死亡突變體［30，31］。在表皮生長(zhǎng)因子刺激前，EGFR 以非活性單體或二聚體形式存在，在表皮生長(zhǎng)因子刺激后，EGFR 活性二聚體或多聚體占主導(dǎo)地位［32］。SIMPL 系統(tǒng)能夠有效地檢測(cè)到EG?FR 和SHC1 的PPI，并且PPI取決于EGFR 的活性，因?yàn)镋GFR 突變體（L858R）增強(qiáng)了PPI 信號(hào)，突變體（D855A）消除了PPI。然而，在沒(méi)有表皮生長(zhǎng)因子處理的情況下，在瞬時(shí)過(guò)表達(dá)EGFR 和SHC1 的細(xì)胞中可以發(fā)生剪接，并且在表皮生長(zhǎng)因子刺激后信號(hào)僅略有增強(qiáng)，這可能是由于EGFR 的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了非配體依賴(lài)性的自發(fā)激活，并隨后招募SHC1，剪接是不可逆的。因此，會(huì)導(dǎo)致剪接蛋白積累，這種積累的剪接蛋白可能掩蓋了表皮生長(zhǎng)因子刺激誘導(dǎo)的信號(hào)?？朔@個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵是減少Bait 和Prey 表達(dá)的水平和持續(xù)時(shí)間，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)態(tài)細(xì)胞系可以有效地解決這一問(wèn)題；SIMPL 系統(tǒng)也能夠檢測(cè)K-Ras 和Raf1 的PPI；SIMPL 系統(tǒng)能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白激酶及底物的短暫和相對(duì)較弱的PPI 進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別率高于

50%［28］。

3 新型PPI識(shí)別系統(tǒng)的特點(diǎn)

3.1 PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)

PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)不可避免地會(huì)產(chǎn)生不必要的自我修飾，這可能會(huì)使酶失活，消耗底物，并在質(zhì)譜試驗(yàn)中引入背景信號(hào)，更精確的時(shí)間和局部控制可能會(huì)減少標(biāo)記背景；PafA 酶的連接不能保證被標(biāo)記的蛋白質(zhì)會(huì)直接與Bait 相互作用，任何在PafA標(biāo)記半徑內(nèi)的間接相關(guān)蛋白也可以被修飾［11］。

BioID 是對(duì)原核生物素連接酶BirA 進(jìn)行了突變（R118G）的酶，BioID 能夠催化生物素和ATP 生成反應(yīng)性生物素-AMP（bioAMP），bioAMP 被釋放并可以與相鄰的胺類(lèi)（例如賴(lài)氨酸）發(fā)生共價(jià)反應(yīng)［33］。在H2O2存在的情況下，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascor?bate peroxidase，APEX）將生物素酚氧化為苯氧基，從而生物素化附近的蛋白質(zhì)［34］。在體外試驗(yàn)和細(xì)胞試驗(yàn)中，PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)比BioID 更活躍，能夠提供更具特異性的標(biāo)記和富集［11］。PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)不像APEX 那么活躍，因此可能不適合用于快速信號(hào)循環(huán)中的PPI 研究［11，35，36］。H2O2處理細(xì)胞可能會(huì)影響細(xì)胞的氧化狀態(tài)并導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激，而PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)不需要使用H2O2處理細(xì)胞，并且PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)有潛力應(yīng)用于動(dòng)物模型，其他的標(biāo)記方法需要將化合物輸送到細(xì)胞中，這在活體動(dòng)物中很難實(shí)現(xiàn)，而PUP-IT 鄰近標(biāo)記系統(tǒng)的所有成分都可以在細(xì)胞中表達(dá)，因此，可以通過(guò)遺傳方法進(jìn)行修飾［11］。

3.2 Mito-docking 系統(tǒng)

設(shè)計(jì)者也同時(shí)使用了雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)和傳統(tǒng) 的共定位 方法對(duì)Gγ2和Gβ1之間 的PPI 進(jìn) 行了檢測(cè)，分析比較后發(fā)現(xiàn)，雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，這可能是由拆分熒光蛋白片段的不可逆互補(bǔ)和拆分片段具有自發(fā)進(jìn)行重組的趨勢(shì)所導(dǎo)致的，傳統(tǒng)共定位方法檢測(cè)到mCherry-Gβ1與EGFPGγ2在細(xì)胞質(zhì)中的共定位，而在對(duì)照細(xì)胞中，EGFP 與mCherry-Gβ1共定位，mCherry 與EGFP-Gγ2共 定位，Mito-docking 系統(tǒng) 通 過(guò)MitoN 將EGFP 或EGFP-Gγ2錨定到線粒體外膜上，可特異性檢測(cè)到mCherry-Gβ1和MitoN-EGFP-Gγ2共表達(dá)的細(xì)胞在線粒體上的相互作用，與正常表達(dá)mCherry-Gβ1和MitoN-EGFP 或mCherry 和MitoN-EGFP-Gγ2的細(xì)胞線粒體上的信號(hào)明顯不同，這說(shuō)明了Mito-docking 系統(tǒng)優(yōu)于雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，并且與傳統(tǒng)的共定位方法相比Mitodocking 系統(tǒng)具有更特異性的共定位效果［12］。

3.3 splitFAST 系統(tǒng)

用HMBR 或HBR-3，5DOM 預(yù)處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，設(shè)計(jì)者使用splitFAST 系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞中PPI時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入雷帕霉素后的延時(shí)成像在幾分鐘內(nèi)顯示出熒光飽和，這說(shuō)明splitFAST 系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成［17］。雷帕霉素能夠解離AP1510 誘導(dǎo)的FKBP 同源二聚體［37］。設(shè)計(jì)者將共表達(dá)FKBPNFAST 和FKBP-CFAST10 或FKBP-CFAST11 的 細(xì)胞與AP1510 一起孵育2 h 以形成FKBP 同源二聚體并用HMBR 處理，雷帕霉素的添加導(dǎo)致80%~90%的splitFAST 熒光損失，證明了splitFAST 組裝的可逆性，加入雷帕霉素后觀察到在幾分鐘內(nèi)熒光快速喪失，證明當(dāng)2 種蛋白質(zhì)解離時(shí)splitFAST 的快速分解［17］。在受到刺激后，ERK2 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中誘導(dǎo)增殖和分化等生理過(guò)程，ERK2能夠通過(guò)核輸出機(jī)制返回到細(xì)胞質(zhì)［38，39］。在用表皮生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞后，觀察到splitFAST 熒光減少和mCherry 熒光的核積累，這說(shuō)明了mCherry-ERK2-CFAST10 從MEK1-NFAST 解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，mCherry-ERK2-CFAST10 的核積累是短暫的，split?FAST 熒光和胞質(zhì)mCherry 熒光的同時(shí)增加，說(shuō)明了mCherry-ERK2-CFAST10 返回細(xì)胞質(zhì)并與MEK1-NFAST 重新組裝，這些結(jié)果證明了splitFAST 系統(tǒng)能夠?qū)崟r(shí)觀察信號(hào)通路中的動(dòng)態(tài)PPI，splitFAST 系統(tǒng)對(duì)鈣調(diào)蛋白和M13 肽之間鈣離子依賴(lài)性的瞬時(shí)PPI的檢測(cè)，進(jìn)一步證明了其具有檢測(cè)快速、瞬時(shí)PPI 的能力，并且splitFAST 系統(tǒng)在細(xì)胞生物傳感器設(shè)計(jì)方面也具有巨大潛力［17］。

3.4 SIMPL 系統(tǒng)

SIMPL 系統(tǒng)具有檢測(cè)短暫和相對(duì)較弱的PPI 的能力；SIMPL 系統(tǒng)可以使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)剪接進(jìn)行檢測(cè)，因此，該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量的、可量化的PPI 檢測(cè)；SIMPL 系統(tǒng)還可以被用作一種基于活細(xì)胞的藥物篩選測(cè)定方法［28］。SIMPL 系統(tǒng)能夠識(shí)別線粒體中參與氧化磷酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)、嵴形成等過(guò)程的蛋白之間的PPI，識(shí)別率為80%［28，40-42］。但是，由于需要Bait 和Prey 的異源表達(dá)，因此，除非通過(guò)基因編輯將標(biāo)簽整合到目標(biāo)基因中，否則SIMPL系統(tǒng)無(wú)法測(cè)量?jī)?nèi)源性PPI，另外，由于SIMPL 系統(tǒng)的作用具有不可逆性，因此該系統(tǒng)不能追蹤蛋白質(zhì)的解離［28］。

4 展望

傳統(tǒng)PPI 研究方法已經(jīng)得到較為廣泛的使用，但也存在其各自的問(wèn)題，近年來(lái)開(kāi)發(fā)出的新型PPI識(shí)別系統(tǒng)能夠較好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)PPI 研究方法的局限性。總體而言，這幾種新型PPI 識(shí)別系統(tǒng)使用了鄰近標(biāo)記、蛋白質(zhì)共定位、拆分蛋白的設(shè)計(jì)思路。盡管仍然有很多問(wèn)題需要繼續(xù)進(jìn)行改進(jìn)，理解這幾種新型PPI 識(shí)別系統(tǒng)將對(duì)未來(lái)研究開(kāi)發(fā)更高效的PPI 識(shí)別系統(tǒng)具有很大的指導(dǎo)價(jià)值。