微生物修復劑S35對氯氰菊酯污染棚室土壤修復研究

陳 銳, 陳智坤,瞿 佳, 門 欣,孫曉宇 ,鄧 媛,趙玲俠,沈衛(wèi)榮

(1.陜西省微生物研究所微生物資源研究中心, 陜西 西安 710043; 2.陜西省科學院秦嶺天然產(chǎn)物工程中心, 陜西 西安 710043; 3. 陜西省科學院土壤資源與生物技術應用重點實驗室，陜西省西安植物園(陜西省植物研究所),陜西 西安 710061 )

氯氰菊酯是目前最為廣泛使用的菊酯類殺蟲劑之一。使用后，殘留農(nóng)藥大部分進入土壤或水體。殘留于土壤中的氯氰菊酯不僅會改變土壤酶活[1]，影響土壤微生物菌群結構[2～3]，影響作物生長[4]，改變土壤中無脊椎物的數(shù)量[5]，對脊柱動物具有發(fā)育毒性[6～7]，可促進脂肪積累并導致小鼠肥胖[8]。人類長期接觸可能引起皮質神經(jīng)元凋亡[9]、帕金森癥[10]、卵巢功能障礙[11]。針對可能存在的潛在危害，研究學者提出利用微生物的生命代謝活動，在污染地區(qū)使用微生物菌劑，使其在土壤中降解特定的污染物[12～13]，可在短時間內加速土壤中污染物的降解，恢復土壤健康，降低農(nóng)產(chǎn)品安全風險[14]。目前已報道的氯氰菊酯降解微生物多集中于細菌類微生物上[15～22]，不產(chǎn)生芽孢及可能屬于條件致病性微生物限制了這類降解細菌的應用開發(fā)。降解微生物在土壤中能否定殖也決定了該類微生物在土壤環(huán)境中發(fā)揮其降解能力的關鍵。在前期自70余份土壤樣本中分離獲得可高效降解氯氰菊酯菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)SSCL-3 及草酸青霉(penicillium oxalicum)SSCL-5，經(jīng)紫外分光光度法及HPLC驗證其在無機鹽培養(yǎng)基(含氯氰菊酯400mg/L)中，對氯氰菊酯的降解率達85%以上[23～24]。這兩株降解微生物屬于真菌微生物，不具致病性，可產(chǎn)生大量孢子適于應用開發(fā)。這兩株菌對其他菊酯家族成員也有一定的降解效果并且其降解類型不完全重疊，為驗證其在土壤中降解氯氰菊酯的實際效果，將該兩株菌制備成復合菌劑S35，通過40 d棚室土壤田間試驗，監(jiān)測土壤中氯氰菊酯殘留，菌劑S35中效能微生物SSCL-3及SSCL-5在土壤中的定殖，土壤真菌多樣性，土壤理化指標及觀測作物生長的變化，對菌劑S35的應用開發(fā)做全面的評估。

1 材料與方法

1.1 菌劑制備

分別將SSCL-3及SSCL-5斜面孢子接種于均勻接種于麩皮稻殼固體培養(yǎng)基。

SSCL-3固體培養(yǎng)基:麩皮60%，稻殼5%，水30%，豆粕 0.112%，葡萄糖0.5%，大米粉0.2%，植物油0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%。培養(yǎng)：溫度28℃，pH6，發(fā)酵接種量10-4個孢子/100mL，培養(yǎng)192 h。

SSCL-5固體培養(yǎng)基：麩皮55%，稻殼10%，水30%，豆粕 0.112%，葡萄糖0.5%，大米粉0.2%，植物油0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%。培養(yǎng)：溫度28℃，pH7，發(fā)酵接種量10-4個孢子/100 mL，培養(yǎng)168 h。

將培養(yǎng)物低溫烘干約72 h(<45℃)。在粉碎機中以間歇模式進行粉碎至約60目大小。以SSCL-3粉碎物:SSCL-5粉碎物:麩皮:高嶺土=1∶1∶10∶8，攪拌混合均勻，獲得固體制粉狀制劑，制劑自封袋分裝，在常溫條件下保存。

1.2 田間試驗設計

田間試驗設置4 個組，每組用地長5 m，寬4 m。分別為S35對照組(菌劑對照組)、S35-SY修復組(修復實驗組)、SY對照組(農(nóng)藥對照組)及CK對照組(空白對照)。菌劑及農(nóng)藥用量如下：

S35組(菌劑S35施用400 g/m2用量)，S35-SY組(菌劑S35施用400 g/m2用量，氯氰菊酯農(nóng)藥大功達10%乳油 450 mL/m2使終濃度達到約100 mg/kg)，SY組(氯氰菊酯農(nóng)藥100 mg/kg)。農(nóng)藥及菌劑施用后翻耕深度約25 cm，6 d后栽種番茄(金鵬1號)作為觀測作物，每7～10 d澆水一次。

1.3 土樣采集

從施工日開始作為0d，每10天取樣一次，至50 d取樣結束，共計取樣6次。五點取土法，取土深度5～20 cm，取樣后合并成為1個樣本，每組取平行3個，取樣總數(shù)為72個。

1.4 土壤中氯氰菊酯殘留量的測定

土壤中氯氰菊酯的提取及測定 稱取土壤15 g于250 mL三角瓶，加入5 g無水硫酸鈉和50 mL乙酸乙酯，震蕩萃取30 min，萃取3次，合并萃取液。將萃取液過無水硫酸鈉后，35℃旋轉蒸發(fā)儀蒸干，用15 mL乙腈定容。HPLC HP-1100 C18柱，柱溫35℃ 波長235 nm，流動相：乙腈∶水=80∶20，流速 1 mL/min，上樣量10 uL[25]。

1.5 功能菌株在土壤中的定殖監(jiān)測

稱取土壤樣本5 g加入45 mL無菌生理鹽水中梯度稀釋，將10-3,10-4,10-5的稀釋液涂布于含氯氰菊酯的PDA平板上，28℃，靜置培養(yǎng) 48 h，觀察平板上菌落的生長。

1.6 土壤樣本微生物多樣性監(jiān)測

取土壤樣本每份4 g，置于無菌EP管，干冰寄送至聯(lián)川生物(Omicstudio)進行土壤樣本的基因組提取，提取后進行高通量 ITS V3-4區(qū)測序，進行土壤真菌多樣性分析。

1.7 土壤樣本理化指標監(jiān)測

取土壤樣本1kg寄送至中科院水土保持研究所進行土壤理化指標測定。測定指標包括土壤土壤含水量(烘干法)、含鹽量(土壤總鹽量測定法)、pH(玻璃電極法)、NPOC(重鉻酸鉀容量法—外加熱法)、微生物碳(氯仿熏蒸浸提法)、全氮(凱式定氮法)、硝態(tài)氮(流動分析法)、銨態(tài)氮(流動分析法)、微生物氮(氯仿熏蒸浸提法)、全磷(鉬銻抗比色法)、速效磷(NaHCO3浸提鉬銻抗比色法)、速效鉀(NH4OAc浸提，火焰光度法)的測定。

1.8 作物指標測定

從番茄種下第2日起進行番茄苗株高及葉片大小的測定。番茄苗隨機選取5株量其整株的高度。葉片隨機選中段分支5個，測量第1葉片大小。觀測葉片上是否有異常色斑等病變。每10天測定一次，測定至50 d后結束。

2 結果與分析

2.1 氯氰菊酯殘留量監(jiān)測

土壤樣本經(jīng)乙酸乙酯萃取后，HPLC檢測其殘留含量。其結果如下圖所示，初始氯氰菊酯濃度約為85 mg/kg以上，經(jīng)過40 d修復期后，S35-SY修復組土壤中殘留的氯氰菊酯濃度降至9.25 mg/kg，下降了約89%，SY對照組殘留量為48.34，下降了約47%。與對照相比具有顯著差異(T-test p=0.04)。

注 *同列差異達顯著水平(P<0.05)，**同列差異達極顯著水平(P<0.01)，

2.2 菌株SSCL-3及SSCL-5在土壤中的定殖觀察

通過重新從土壤中分離培養(yǎng)可在氯氰菊酯平板上正常生長的真菌微生物，來觀察菌株SSCL-3及SSCL-5在40 d修復過程中在土壤中的定殖過程(圖2)。結果表明0～40 d，加入菌劑的S35對照組及S35-SY修復組均可觀察到類似于草酸青霉及米曲霉形態(tài)的真菌菌落生長，而在沒有菌劑的SY對照組則未觀察到真菌菌落的生長。

圖2 菌劑S35在土壤中的定殖

2.3 菌劑微生物的定殖監(jiān)測

進一步通過高通量測序分析可以更加準確的了解菌劑S35在土壤中的定殖情況。如圖3所示，S35對照組及S35_SY修復組在種水平上持續(xù)檢出黃曲霉(Aspergillus flavus)，而SY對照組及CK對照組黃曲霉水平則非常低。黃曲霉與米曲霉在基因測序中幾乎無法區(qū)分，這應當是外源添加米曲霉后定殖的結果。在S35對照組中， 0 d及10 d可以監(jiān)測到草酸青霉(Penicillium oxalicum)，在S35_SY修復組中0 d至40 d均可以檢出一定比例的草酸青霉(Penicillium oxalicum)，當土壤中含有一定濃度的氯氰菊酯殘留時有利于草酸青霉的定殖。

圖3 種水平的土壤樣本中目標菌株的檢出

在種水平上比較不同天數(shù)相對含量有差異的微生物(如圖4所示)，米曲霉及草酸青霉在S35對照組，S35-CY修復組與SY對照組，CK對照組具有顯著差異。通過高通量測序結果可以認為外源引入的米曲霉(Aspergillus oryzae)SSCL-3在土壤中的定殖與土壤殘留氯氰菊酯無相關性，但草酸青霉SSCL-5可能具有一定的相關性。

圖4 種水平上不同天數(shù)測序相對量差異顯著微生物

2.4 土壤真菌微生物多樣性監(jiān)測

土壤真菌的α多樣性主要通過Chao1,Shannon,Simpson等指數(shù)變化來反應，測序結果如圖5所示，S35對照組、S35-SY修復組及SY對照組土壤的Chao1, Otu, Shannon, Simpson指數(shù)均比對照低，隨著天數(shù)的增加S35對照組，S35-SY修復組微生物多樣性指數(shù)均有所恢復，SY對照組恢復則的較慢。通過多樣性測序結果可以認為菌劑的加入有助于土壤微生物菌群的恢復。

圖5 土壤修復過程中真菌α多樣性變化監(jiān)測

真菌群落屬水平上的聚類分析結果如圖6所示，基本聚為兩簇，A組中為S35-SY 0D , S35-SY 10D, S35-SY 20D,S35 0D, S35 10D, S35 20D, S35 30D屬于添加了修復菌劑的S35早中期樣本，B組中為CK 組 SY組以及S35-SY 30D , S35-SY 40D，屬于加入菌劑后期樣本與對照，聚類顯示在修復初期由于菌劑的加入確實對土壤微生物菌群多樣性產(chǎn)生了影響，但到修復后期逐步恢復與對照接近。菌劑對土壤真菌多樣性的影響是暫時性的。

圖6 修復土壤真菌群落聚類圖

2.5 土壤理化指標監(jiān)測

對5 -20 cm 土壤樣本進行含水量、pH、土壤有機質(SOM)、有機碳(SOC)、全氮(Total-N)、銨態(tài)氮(NH4-N)、硝態(tài)氮(NOx-N)、微生物氮(TNb)、全磷(Total-P)、速效磷(Olsen-P)、速效鉀(Olsen-K)及土壤團聚體(GMD)指標的監(jiān)測。土壤理化結果顯示(表1)，除有機碳，全氮，全磷，速磷及速鉀以外其他土壤樣本的理化指標無差異。分析認為這些差異與菌劑輔料及農(nóng)藥有關，而與微生物本身無相關性。菌劑輔料中的麩皮、高嶺土等成分以及摻入土壤的氯氰菊酯增加了土壤有機碳，氮，磷，鉀的水平。

2.6 作物生長的監(jiān)測

經(jīng)過50 d對觀測作物番茄的監(jiān)測，其植株及葉片的生長未受到氯氰菊酯菌劑S35的影響(圖7)，在植株及葉片上未觀察到有病變，在后期其掛果及產(chǎn)果過程中也未觀察到與對照組有差異，S35菌劑對觀測作物番茄生產(chǎn)無不良影響。

圖7 菌劑對作物生長的影響

3 討論

擬除蟲菊酯是具有低哺乳動物毒性的合成有機殺蟲劑，已在全世界的農(nóng)村和城市地區(qū)廣泛使用，擬除蟲菊酯已在多種環(huán)境包括土壤，水，沉積物和生物中被廣泛檢測到。在長江三角洲的農(nóng)業(yè)土壤中調查四種常見擬除蟲菊酯的污染水平，241個土壤樣品中檢出了擬除蟲菊酯(檢出率88.8%)。四種擬除蟲菊酯的平均濃度：聯(lián)苯丙菊酯(4.92 ng / g)、氯氰菊酯(1.10 ng /g)、溴氰菊酯(0.89 ng/g)、氯氟氰菊酯(0.20 ng/g)[26]。廣州地區(qū)的調查顯示在水和沉積物中都觀察到八種擬除蟲菊酯濃度的顯著增加[27]。對中國堅果種植土壤中的29種農(nóng)藥殘留進行了調查。在65.8%的土壤中檢出的六種擬除蟲菊酯(聯(lián)苯菊酯，聯(lián)苯丙菊酯，氯氟氰菊酯，氯氰菊酯，氰戊菊酯和溴氰菊酯)的殘留量為1.5μg/ kg至884.3μg/ kg[28]。在中國20個省份的溫室和露天土壤中擬除蟲菊酯的水平和分布調查中，擬除蟲菊酯(PYs)的總濃度在1.30到113 ng / g之間，溫室中發(fā)現(xiàn)的污染要比在露天田地高。80%的溫室中總擬除蟲菊酯的含量顯著高于附近的田間土壤(p<0.05)。在中國北方省份PYs的污染普遍更為嚴重[29]。

殘留擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對環(huán)境生物產(chǎn)生威脅，對人類具有發(fā)育毒性、生殖毒性，神經(jīng)毒性等問題，快速降殘留擬除蟲菊酯水平有利于生態(tài)及人類健康發(fā)展。去除環(huán)境中殘留的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留可采用物理、化學及生物學的方法，例如：冷等離子體[30]，光解[31]，海藻[32]、植物[33]、微生物吸收及降解[34]等手段。目前研究報道顯示微生物降解手段安全有效并且廉價，最具有應用潛能?？稍谝后w介質中有效降解擬除蟲菊酯的微生物有：芽孢桿菌屬[35]，短桿菌屬[15]，假單胞菌屬[16]，沙門氏菌屬[17]、克雷伯氏菌[18]和鞘氨醇菌屬[19]等細菌以及黑曲霉[20]、白腐真菌[21]、曲霉[22]等真菌。

土壤中可有效去除擬除蟲菊酯的微生物研究主要集中在細菌上，最高可將200 mg/kg的氯氰菊酯在42 d降解90%[15]。在本研究的前期初篩中也分離出可降解氯氰菊酯的假單胞屬、鞘氨醇菌屬及沙雷氏屬等細菌。但考慮到部分細菌菌株屬于條件致病菌，一方面可能造成健康風險，另一方面可能會導致土壤微生物耐藥性加重。另一些篩選出的細菌菌株不產(chǎn)生芽孢，在環(huán)境中抗逆性較差，因此從實際應用及生物安全角度考慮，最終采用米曲霉及草酸青霉菌株作為菌劑出發(fā)菌株。在已報道的真菌降解土壤擬除蟲菊酯農(nóng)藥的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真菌具有比細菌更好的農(nóng)藥降解潛力，其代謝和生態(tài)潛力更適合生物修復和廢物處理[36～37]。在一項在土壤中進行的生物強化實驗中，真菌曲霉可顯著降低100 mg/kg氯氰菊酯殘留量及其半衰期[16]。本研究基本達到類似水平。在前期的土壤盒及盆栽實驗過程中同時證實[23～24]，土壤中氯氰菊酯的降解效率與土壤活菌量，土壤溫度高度相關。滅菌的土壤其農(nóng)藥降解速度顯著低于不經(jīng)滅菌的土壤。土壤修復過程中溫度過低也會影響其代謝速率。前期實驗中證實在其他類型的菊酯類農(nóng)藥中本菌劑的兩個微生物菌株具有不同的耐受特性，是否可降解其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有待下一步研究驗證。

4 結論

通過在土壤中添加氯氰菊酯并施用菌劑S35，定期監(jiān)測土壤中殘留氯氰菊酯，功能菌株定殖，土壤真菌微生物多樣性，土壤理化指標及種植作物生長，從而評估菌劑施用效果及其使用安全性。初始土壤中氯氰菊酯濃度約為85 mg/kg以上，經(jīng)過40 d修復期后，施用菌劑S35的土壤中氯氰菊酯濃度降至9.25 mg/kg，下降了約89%。對照組殘留量為48.34 mg/kg，下降了約47%。與對照相比具有顯著差異(T-test p=0.04)。復合菌劑S35中的效能微生物SSCL-3,SSCL-5可在土壤中穩(wěn)定的定殖并發(fā)揮降解氯氰菊酯的作用。土壤真菌菌群由于S35菌劑的加入與對照相比有顯著的下降，S35菌劑的施用可逐步改善污染土壤真菌微生物多樣性。土壤理化指標未受到菌劑S35的負面影響。觀測作物番茄作物在株高，葉片大小均無差異。通過田間土壤實驗證實氯氰菊酯降解菌劑S35在土壤中具有較好的降解氯氰菊酯效果，并改善污染土壤真菌微生物多樣性，對土壤及觀測作物無負面影響。