五味子發(fā)芽特性及特征成分研究

劉永紅，李教社，蔡云波，張軍義，王 芳

(1.西安職業(yè)技術學院生物工程系,陜西 西安 710077； 2.楊凌森禾農(nóng)業(yè)科技有限公司,陜西 楊凌 712100；3.楊凌新天地設施農(nóng)業(yè)有限公司, 陜西 楊凌 712100 )

南五味子和北五味子分別是木蘭科植物華中五味子(Schisandrasphenanthera)和五味子(Schisandrachinensis)的干燥成熟果實[1]。自2000年版《中國藥典(一部)》起,國家標準將五味子與南五味子分開,作為兩味藥收載[2]。南五味子主要產(chǎn)于我國長江流域及西南地區(qū)，陜西秦嶺地帶廣泛分布。北五味子主要產(chǎn)于東北。南五味子大多野生，秦嶺山區(qū)每年8月份由綠轉(zhuǎn)紅時基本被搶購采收，野生資源供不應求[3]。篩選優(yōu)質(zhì)南五味子品種，開展規(guī)范化栽培研究，可以彌補南五味子的市場需求。

1 材料和方法

1.1 試驗地點

西北農(nóng)林科技大學新天地設施農(nóng)業(yè)有限公司育苗大棚。

1.2 材料

樣品1(南五味子)于2017年7月28日采自陜西省西安市長安區(qū)五臺街辦石砭峪小馬勺村；樣品2(南五味子)于2017年8月13日采自陜西省西安市長安區(qū)五臺街辦石砭峪小馬勺村；樣品3(南五味子)于2017年8月30日采自陜西省西安市長安區(qū)五臺街辦石砭峪小馬勺村。樣品4(北五味子)于2017年9月2日采自陜西省柞水縣豐北河鎮(zhèn)土橋村。

1.3 方法

1.3.1 種子前處理方法 將樣品3(南五味子)與樣品4(北五味子)果實用清水浸泡72 h后搓去果肉，洗凈種子，再于水中將秕粒漂出去。取沉于水中下部的飽滿種子為供試種子。

1.3.2 發(fā)芽處理 第一次發(fā)芽試驗：清水浸泡南、北五味子1 400粒，分別用不同藥劑不同條件(GA350200 mg/kg、6-BA 50200 mg/kg、KT 50200 mg/kg、低溫)浸泡5 d、7 d，置于4℃冰箱放置2周，然后放入25℃恒溫箱催芽。

第二次發(fā)芽試驗：清水浸泡南、北五味子5 d后進行脫皮處理，一周后開始進行藥劑處理(GA350200 mg/kg、6-BA 50200 mg/kg、KT 50200 mg/kg、ABA 50200 mg/kg、清水)，分別用不同藥劑不同的濃度浸泡5 d，直播穴盤，南、北五味子共18處理，每處理25孔125粒，共播9個穴盤，然后放入25℃催芽室進行催芽。

1.3.3 顯微結(jié)構(gòu)觀察 取五味子樣品，分別研磨成粉，過20目篩，取少量細粉于載玻片上，滴2～3滴水合氯醛至粉末上,然后蓋上載玻片(蓋的時候注意少產(chǎn)生氣泡,粉末應全部分散在水合氯醛中)，至酒精燈上加熱,至水合氯醛沸騰,反復2～3次，至顯微鏡下觀察。

1.3.4 成分測定

1.3.4.1 供試品溶液的制備。 分別稱取不同樣品各10.000 g，于40℃烘干至恒重，粉碎，過 40目篩。精密稱定各樣品粉末0.500 g，置50 mL量瓶中，用無水甲醇提取，超聲處理20 min，取出，用無水甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

1.3.4.2 色譜條件。 溫度為室溫；五味子甲素、五味子乙素的流動相為無水甲醇-水(75∶25，V/V);五味子甲素和五味子乙素檢測的波長為 224 nm。

1.3.4.3 總糖、總酸、粗蛋白、粗脂肪的測定。采用費林氏試劑法測定總糖的含量，酸堿滴定法測定總酸的含量；粗蛋白測定(凱氏定氮法，GB5009.5-2003標準)；粗脂肪測定(索氏抽提法，GB5009.6-2003標準)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽處理

第一次發(fā)芽試驗時間為2017年11月20日開始。2017年11月20日清水浸泡南、北五味子1 400粒，11月25-27日分別用不同藥劑不同的濃度浸泡5 d、7 d，置于4℃冰箱放置2周，然后放入25度恒溫箱催芽。到 2018年1月2日有北五味子GA3200 mg/kg 5 d處理和7 d處理的約有3個發(fā)芽，KT 200 mg/kg 5 d處理有1個發(fā)芽，KT 200 mg/kg 7d處理1個發(fā)芽。2018年1月22日GA3200 mg/kg 5 d處理有3個芽長1～1.5 cm; GA3200 mg/kg 7 d處理有發(fā)芽后表現(xiàn)較差，胚芽沒有伸長；6-BA 50 mg/kg 5 d處理有一個發(fā)芽。全部撒播入50孔穴盤，放入溫室常溫條件下出苗，溫度10～25℃。3月16日北五味子GA3200 mg/kg 7 d處理出苗2株，4月6日基本出苗整齊。

表1 4月15日北五味子分苗統(tǒng)計數(shù)據(jù)

第二次五味子發(fā)芽實驗時間為2018年9月7日開始。2018年9月7日清水浸泡南、北五味子5 d后進行脫皮處理，9月14日開始進行藥劑處理(GA350200 mg/kg、6B A50200 mg/kg、KT50200 mg/kg、脫落酸50200 mg/kg、清水)，分別用不同藥劑不同的濃度浸泡5 d，9月19日然后直播穴盤，南、北五味子共18處理，每處理25孔125粒，共播9個穴盤，然后放入25度催芽室進行催芽。 2019年1月發(fā)現(xiàn)沒有出苗跡象，然后做了低溫處理1月2日將穴盤全部移出催芽室，放入溫室常溫條件，當時溫度大概4度左右。直到2月2日再放入催芽室，3月11日發(fā)現(xiàn)有2個北五味子出苗是ABA兩個處理，移出催芽室。4月20日統(tǒng)計：北五味子GA3 200 mg/kg有2個出苗，KT 50 mg/kg有1個出苗，ABA 50 mg/kg有5株出苗，清水處理有2株出苗。5月5日統(tǒng)計：北五味子：GA350 mg/kg有4個出苗，GA3200 mg/kg有8個出苗，KT 50 mg/kg有1個出苗，KT200 mg/kg有2個出苗。ABA 50 mg/kg有15株出苗，ABA 200 mg/kg有2株出苗；6-BA 50 mg/kg有2 株出苗，清水處理有6株出苗。5月10日統(tǒng)計：北五味子GA350 mg/kg有8個出苗，GA3200 mg/kg有14個出苗。KT 50 mg/kg有1個出苗，KT 200 mg/kg有3個出苗。ABA 50 mg/kg有21株出苗，ABA 200 mg/kg有2株出苗；6-BA 50 mg/kg有3株出苗，6-BA 200 mg/kg有1株出苗，清水處理有11株出苗。

南五味子：6-BA 200 mg/kg有1 株出苗。

表2 6月3日北五味子分苗統(tǒng)計數(shù)據(jù)

從兩年的實驗數(shù)據(jù)可以看出，北五味子在不同藥劑間，同一藥劑不同濃度間，同一藥劑不同天數(shù)間的處理后發(fā)芽數(shù)量對比不是很明顯，甚至在清水處理和藥劑處理間也沒用差異，說明這兩次的五味子發(fā)芽都是常規(guī)時間的正常出苗，和藥劑沒有什么關系。

2.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察

1號五味子，種皮外層石細胞壁厚，紋孔細密，呈多角形。種皮內(nèi)層石細胞壁厚，紋孔較大，有脂肪粒。果皮分泌細胞及角質(zhì)層紋由多個維管束圍成，有角質(zhì)紋線。螺紋導管無壁。2號五味子，種皮外層石細胞壁較厚，呈長多角形，紋孔較大，含棕色物。種皮內(nèi)層石細胞壁較厚，呈類圓形，紋孔較大。淀粉粒圓形，內(nèi)含棕色物。果皮表皮分泌細胞呈多角形，有角質(zhì)紋線。3號五味子，種皮外層石細胞壁薄，紋孔較大，呈多角形。種皮內(nèi)層石細胞呈類圓形，壁稍厚，紋孔大。胚乳細胞含脂肪油，壁稍厚。淀粉粒較多，呈圓形。螺紋導管壁薄，細密。4號五味子，種皮外層石細胞壁較薄，紋孔小，類圓形。種皮內(nèi)層石細胞壁薄，紋孔小，呈多角形。胚乳細胞壁薄，含脂肪油。淀粉粒較多，圓形。

研究結(jié)果顯示南五味子樣品由綠變紅的成熟過程中，種皮石細胞壁由厚變薄，紋孔由細密變大，淀粉粒增多。胚乳細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪油。

圖1 南、北五味子顯微結(jié)構(gòu)圖(1 1號樣品，a石細胞，b棕色物；2 2號樣品，a石細胞，b分泌細胞；3 3號樣品，a 石細胞，b脂肪油；

2.3 成分測定

五味子含有揮發(fā)油、有機酸、維生素、木質(zhì)素、三萜、多糖等化學成分。五味子具有明顯的抗肝臟損傷、抗氧化的作用，五味子所含木脂素因具有降低肝臟細胞SGPT作用而備受重視。《中國藥典》中，五味子是以其所含的五味子醇甲作為藥材的質(zhì)量控制指標，而五味子甲素、五味子酯甲亦是其重要的木脂素類成分之一。

表3 不同南、北五味子樣品成分比較

3 討論

張麗萍報道，赤霉赤和低溫處理有打破種子休眠的作用，但裂口率還是很低，且不整齊，表現(xiàn)出較強的野生特性[4]。高玉剛報道，常規(guī)層積20 d后浸泡赤霉素能夠顯著的促進五味子種子萌發(fā)，但是種子清洗后直接進行GA3參與處理無顯著效果[5]。研究報道GA3、6-BA、KT和脫落酸有促進植物胚狀體或愈傷組織分化、抽芽的效果[6、7]，我們兩年的試驗數(shù)據(jù)表明，北五味子用GA3、6-BA、KT和脫落酸不同濃度間、不同天數(shù)間的處理后發(fā)芽數(shù)量對比不是很明顯，甚至在清水處理和生長調(diào)節(jié)劑處理間也沒用差異，說明這兩次的五味子發(fā)芽都是低溫處理后的正常出苗，和生長調(diào)節(jié)劑關系不大。這和張彩麗報道的沙藏前用GA3和CuSO4處理五味子種子極顯著提高了發(fā)芽率不同[8]，可能和五味子品種不同及具體試驗條件有關。第一年試驗中，南五味子沒有發(fā)芽，分析可能和南五味子種子提前采收沒有達到生理后熟有關。第二年專門挑選了成熟的南五味子果實，結(jié)果只有6-BA 200 mg/kg處理有1 株出苗，說明南五味子的催芽試驗研究有待繼續(xù)深入研究。

顯微鑒定表明，南五味子樣品在7到8月份的成熟過程中，種皮石細胞壁由厚變薄，紋孔由細密變大，淀粉粒增多，胚乳細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪油，這和其外在的性狀特征有一定的對應性。南、北五味子也可以通過其顯微結(jié)構(gòu)的不同鑒別出來。總糖、總酸、粗蛋白及粗脂肪檢測結(jié)果表明，南五味子成熟過程中，糖分增加，酸度性成分變化不大，粗蛋白和粗脂肪降低。南五味子所含五味子甲素和五味子酯甲在7-8月份成熟過程中含量變化不大。北五味子和南五味子比較，總糖、粗蛋白、粗脂肪含量變化不大，北五味子總酸含量245.52 g/kg顯著高于南五味子總酸含量23.98 g/kg。但南五味子五味子甲素和五味子酯甲含量(3.66 mg/g、2.04 mg/g)高于北五味子(0.60 mg/g、0.20 mg/g)。五味子的五味子醇甲、酯甲、甲素是五味子中木酯素的主要成分，也是評價五味子質(zhì)量標準的依據(jù)[9，10]， 這表明秦嶺地帶南五味子品種相比東北引進的北五味子有一定優(yōu)勢，開展南五味子規(guī)范化栽培有一定現(xiàn)實意義。另外，程敏報道，北五味子及北五味子南移栽培品種含有五味子醇甲、五味子甲素，但都不含五味子酯甲[11]，但我們的試驗結(jié)果表明北五味子南移栽培品種含有五味子酯甲。