單激發(fā)雙發(fā)射氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備及其在生物成像和熒光油墨中的應(yīng)用

張長(zhǎng)波,何文柔,田豐玲，姜 麗,易 偉，2,唐 珊,吳 韻,王興益,張仟春*

(1.興義民族師范學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院,貴州 興義 562400;2.黔西南州食品和環(huán)境污染物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 興義 562400)

0 引言

碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots, CDs)是一種新型的零維碳納米材料，自2004年首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)受到了研究者們的持續(xù)關(guān)注[1-2]。與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)和有機(jī)熒光染料相比，CDs具有優(yōu)異的光學(xué)性能及良好的生物相容性[3-4]，并在傳感、生物成像等前沿研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5-6]。有研究顯示，目前人們已發(fā)展了多種合成CDs的方法，如水熱法、溶劑熱法、微波輔助法、電化學(xué)氧化法和激光消蝕法等等，其中水熱法，因其操作簡(jiǎn)單、條件可控、穩(wěn)定性好，應(yīng)用較為廣泛[5-8]。

以往研究顯示，CDs大多發(fā)射波長(zhǎng)較短的藍(lán)光或綠光，與生物體自身的背景熒光相近[9-11]，且多數(shù)CDs其熒光性能和穩(wěn)定性易受酸堿、鹽或生物小分子的影響，從而限制了它們?cè)谏锕鈱W(xué)成像等領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，樣品不均勻、光源不穩(wěn)定等外界因素也會(huì)嚴(yán)重影響單發(fā)射熒光探針的信號(hào)強(qiáng)度[12]。因此，如何制備出能夠發(fā)射長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光的CDs，尤其是單激發(fā)雙發(fā)射的CDs引起了相關(guān)研究者們的關(guān)注。有研究表明，CDs的發(fā)光特性可以在制備過(guò)程中通過(guò)原子摻雜(氮、磷、硫、硼等)進(jìn)行調(diào)控[3-4,7,10,13-18]。這是因?yàn)椋旱优c碳原子的大小相似，且外層具有的五價(jià)電子與碳原子有著很強(qiáng)的鍵合，當(dāng)通過(guò)摻雜其它原子對(duì)碳量子點(diǎn)的熒光進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)，氮是較為理想的摻雜原子[3-4,7,14]；硼、磷、硫等原子也可以與氮一起被摻雜進(jìn)碳量子點(diǎn)中[16-18]。如：Li等[17]以亞甲膦酸和間苯二胺為前驅(qū)體合成了氮、磷共摻雜的碳量子點(diǎn)，此碳量子點(diǎn)在440 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)出綠色熒光；Shi等[18]提出以水熱法來(lái)制備藍(lán)光發(fā)射的氮、磷共摻雜的碳量子點(diǎn)，并將其用于Fe3+的測(cè)定；Liu等[16]制備了硼、氮、硫共摻雜的紅光碳量子點(diǎn)，其發(fā)射峰位于600 nm，熒光量子產(chǎn)率約為6%。但采用較簡(jiǎn)單的合成路線(xiàn)制備出發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)且熒光量子產(chǎn)率較高的碳量子點(diǎn)仍然挑戰(zhàn)巨大。

基于此，本研究以L(fǎng)-蘋(píng)果酸為碳源、3,3′-二氨基二丙胺和氟化銨為氮源，采用簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的一鍋水熱法制備了氮摻雜碳量子點(diǎn)(Nitrogen-doped carbon quantum dots, N-CDs)，并對(duì)所合成的N-CDs的發(fā)光性能和穩(wěn)定性進(jìn)行探究，結(jié)果表明該N-CQDs具有單激發(fā)雙發(fā)射的熒光特性和出色的穩(wěn)定性，同時(shí)，經(jīng)驗(yàn)證其可應(yīng)用于生物成像或作為熒光油墨。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

L-蘋(píng)果酸(98%)、3,3′-二氨基二丙胺(>98%)、硫酸奎寧(98%)、谷胱甘肽、Y-氨基丁酸、褪黑素、鏈霉素、脫落酸、甲基睪酮和孕三烯酮，購(gòu)自中國(guó)上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氟化銨和L-抗壞血酸，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；鹽酸、硫酸、氯化鈉和氫氧化鈉，購(gòu)自重慶川東化工有限公司；L-半胱氨酸，購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；酪氨酸、色氨酸、噻苯咪唑和3-吲哚乙酸，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，用水均為超純水。

高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM, Hitachi-F20)；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜(FT-IR, 美國(guó)賽默飛世爾)；X射線(xiàn)粉末衍射(XRD, Bruker D8)；AL104電子天平(瑞士梅特勒-托麗多)；KQ5200DE超聲波清洗機(jī)(中國(guó)昆山)；RF-6000熒光分光光度計(jì)(日本島津)；UV-5500分光光度計(jì)(上海元析)；高溫試驗(yàn)箱(上海力辰邦西)；pH計(jì)(瑞士梅特勒-托利多)、紫外燈(ZF-20D手持式)。

1.2 氮摻雜碳量子點(diǎn)的制備

氮摻雜碳量子點(diǎn)的典型制備過(guò)程如下：首先，將2 mmol(0.074 g)的氟化銨、2 mmol (0.262 g)的3,3′-二氨基二丙胺和4 mmol(0.536 g)的L-蘋(píng)果酸溶于10 mL水中，超聲10 min將其混合均勻；然后轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜內(nèi)，密封后置于200 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)18 h，結(jié)束反應(yīng)；最后，反應(yīng)釜取出后冷卻至室溫，將反應(yīng)溶液超聲分散10 min，后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾純化，放置于4 ℃冰箱中保存待用，實(shí)驗(yàn)前用超純水稀釋。

1.3 氮摻雜碳量子點(diǎn)的表征

通過(guò)HRTEM、XRD、FT-IR等研究了N-CDs的形貌及結(jié)構(gòu)。將硫酸奎寧溶解于0.1 mol/L的H2SO4溶液中作為標(biāo)準(zhǔn)溶液(其熒光量子產(chǎn)率為54%，激發(fā)波長(zhǎng)350 nm)進(jìn)行參照[8]，測(cè)量其熒光量子產(chǎn)率。

1.4 氮摻雜碳量子點(diǎn)的生物成像及熒光油墨

1)生物成像：取50 μL的N-CDs溶液(87.2 mg/mL)加至含50 mL水的燒杯內(nèi)，然后與3月齡斑馬魚(yú)在室溫條件下共培育72 h后，用水清洗斑馬魚(yú)，在365 nm紫外燈照射下成像；將黃豆在室溫條件下浸泡12 h，放到打孔的塑料瓶中，室溫條件下待其發(fā)芽，用N-CDs溶液(87.2 μg/mL)共培育12 h，于365 nm紫外燈照射下成像。

2)熒光油墨：用棉簽蘸取N-CDs溶液，在無(wú)熒光濾紙上進(jìn)行繪畫(huà)與書(shū)寫(xiě)，于365 nm紫外燈照射下拍攝成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮摻雜碳量子點(diǎn)制備條件優(yōu)化

為得到熒光性能優(yōu)異的N-CDs，探討了3,3′-二氨基二丙胺、氟化銨和L-蘋(píng)果酸的摩爾比、濃度、制備溫度及制備時(shí)間等制備條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。經(jīng)驗(yàn)證，3,3′-二氨基二丙胺、氟化銨和L-蘋(píng)果酸的摩爾比、濃度、制備溫度及制備時(shí)間在N-CDs合成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由圖1(A)可見(jiàn)，在3,3′-二氨基二丙胺、氟化銨和L-蘋(píng)果酸的摩爾比為2∶2∶4的條件下熒光信號(hào)最強(qiáng)；由圖1(B)可知，當(dāng)N-CDs濃度在58.1～87.2 mg/mL的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度會(huì)先隨著濃度的增加而增大，并在87.2 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)N-CDs的濃度繼續(xù)增大超過(guò)87.2 mg/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度不升反降，原因可能是較高濃度N-CDs聚集誘導(dǎo)熒光淬滅所致[6]，因此，制備N(xiāo)-CDs的最佳濃度為87.2 mg/mL；由圖1(C)可見(jiàn)，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨反應(yīng)溫度的升高而增強(qiáng)，并在220 ℃時(shí)達(dá)到最大值，考慮高壓反應(yīng)釜的承壓上限及實(shí)驗(yàn)的安全性，最佳制備溫度選擇220 ℃；最終考察了N-CDs的反應(yīng)時(shí)間，見(jiàn)圖1(D)，反應(yīng)時(shí)間為18 h時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度最佳。綜上可知，最優(yōu)的制備條件為3,3′-二氨基二丙胺、氟化銨和L-蘋(píng)果酸的摩爾比為2∶2∶4，濃度為87.2 mg/mL，制備溫度為220 ℃和反應(yīng)時(shí)間為18 h。

圖1 N-CDs制備條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of preparation conditions of N-CDs

2.2 氮摻雜碳量子點(diǎn)的表征

N-CDs的TEM表征結(jié)果如圖2(A)所示，所合成的N-CDs是近圓球狀的納米顆粒，且單分散性良好；從圖2(A)的插圖可知，該N-CDs的平均粒徑為3.3 nm。圖2(B)為N-CDs的高分辨透射電鏡圖，晶格常數(shù)為0.27 nm；對(duì)N-CDs進(jìn)行XRD表征得到圖2(C)，2θ=22.8°處的衍射峰與石墨烯量子點(diǎn)的(002)面相對(duì)應(yīng)，這與HRTEM分析結(jié)果一致[7]。

圖2 N-CDs的形貌和結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Images of the morphology and structure of N-CDs

通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對(duì)N-CDs表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖2(D)所示，3 130 cm-1處的寬峰歸因于O-H和N-H的伸縮振動(dòng)，1 640 cm-1處的峰是由C=O和C=C的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)所致，1 410 cm-1處的吸收峰歸因于C-N的拉伸振動(dòng)；而744 cm-1處的吸收峰歸因于C-H的面外彎曲振動(dòng)[6-7]。FT-IR分析結(jié)果表明，該N-CDs表面可能含有-COOH、-OH和-NH2三種親水的官能團(tuán)，由此導(dǎo)致所合成N-CDs具有親水性且易均勻分散，這有利于生物成像和作為熒光油墨。

2.3 氮摻雜碳量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)

利用熒光分光光度計(jì)測(cè)試N-CDs的三維熒光光譜，如圖3(A)所示。非常有趣的是，激發(fā)范圍在300～420 nm，發(fā)射范圍在350～500 nm和700～900 nm，即在不同激發(fā)波長(zhǎng)下，該N-CDs具有明顯的單激發(fā)雙發(fā)射熒光特性，且發(fā)射光譜顯示出激發(fā)依賴(lài)性，這可能是源自共軛π域的發(fā)射以及表面缺陷所致[19]。進(jìn)一步通過(guò)UV-vis和熒光分光光度計(jì)考察了N-CDs的光學(xué)吸收光譜，如圖3(B)所示。N-CDs在紫外和可見(jiàn)光區(qū)均有明顯的吸收，340 nm處特征吸收峰(黑線(xiàn))歸因于C=O雙鍵的n-π*躍遷[20-21]。在熒光光譜中，N-CDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)(紅線(xiàn))為350 nm、最佳發(fā)射波長(zhǎng)(藍(lán)線(xiàn))為425 nm和850 nm。所得N-CDs溶液在日光下呈淺黃色，在手持紫外燈下(365 nm)呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光(圖3(B)插圖)。如圖4所示，以硫酸奎寧(QYQS=54.0%)為熒光標(biāo)準(zhǔn)物，測(cè)得所制備N(xiāo)-CDs量子產(chǎn)率為17.5%。

圖3 N-CDs的光譜圖Fig.3 The spectra of N-CDs

圖4 N-CDs的熒光量子產(chǎn)率Fig.4 Fluorescence quantum yield of N-CDs

2.4 氮摻雜碳量子點(diǎn)的穩(wěn)定性

量子點(diǎn)的穩(wěn)定性是決定其能否成功應(yīng)用的重要參數(shù)之一。實(shí)驗(yàn)考察了所制備N(xiāo)-CDs的光學(xué)、酸堿、抗鹽和抗生物小分子的穩(wěn)定性。由圖5(A)可見(jiàn)，白光照射長(zhǎng)達(dá)14 h，N-CDs在425 nm和850 nm處的發(fā)射峰熒光強(qiáng)度基本保持不變，這表明所合成N-CDs在水溶液中具有優(yōu)異的光學(xué)穩(wěn)定性。為探究溶液酸堿度對(duì)N-CDs熒光強(qiáng)度的影響，利用HCl和NaOH調(diào)控溶液pH為1.0～13.0，于激發(fā)波長(zhǎng)350 nm下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，pH測(cè)試結(jié)果如圖5(B)所示，pH的變化對(duì)N-CDs熒光強(qiáng)度的影響基本不大，425 nm和850 nm處的發(fā)射峰熒光強(qiáng)度在pH為2.0～12.0較大的范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。為考察N-CDs受離子和共存生物小分子的干擾情況，分別加入不同濃度的NaCl和生物小分子后測(cè)定425 nm和850 nm處的熒光強(qiáng)度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，425 nm和850 nm處的熒光強(qiáng)度值(見(jiàn)圖5(C)和圖5(D))幾乎不發(fā)生改變。綜上可見(jiàn)，所合成N-CDs具有優(yōu)異的光學(xué)、酸堿、抗鹽和抗生物小分子穩(wěn)定性，這有利于N-CDs在生物成像、熒光油墨等方面的應(yīng)用。

圖5 N-CDs的熒光穩(wěn)定性Fig.5 Fluorescence stability of N-CDs

2.5 氮摻雜碳量子點(diǎn)應(yīng)用于生物成像和熒光油墨

為了證實(shí)N-CDs在活體生物成像應(yīng)用的可行性，將3月齡斑馬魚(yú)(圖6(A1))和豆芽(圖6(B1))與質(zhì)量濃度為87.2 μg/mL的N-CDs共培育后，并在365 nm紫外光照射下進(jìn)行觀(guān)察拍攝。結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)經(jīng)12 h共培育后，只有頭部出現(xiàn)熒光(圖6(A2))，24 h后魚(yú)身部分出現(xiàn)熒光(圖6(A3))，隨著共培育時(shí)間延長(zhǎng)至36 h，斑馬魚(yú)全身出現(xiàn)熒光，熒光成像效果極佳(圖6(A4))；浸泡發(fā)芽的黃豆(圖6(B1))與N-CDs溶液共培育12 h后，熒光無(wú)法穿過(guò)厚度較厚的子葉，只有豆芽的胚根和胚軸部分出現(xiàn)熒光(圖6(B2～B4))。該結(jié)果表明N-CDs具有良好的滲透性能和生物相容性，可作為生物體成像的探針使用。

圖6 斑馬魚(yú)和豆芽與0.872 mg/L N-CDs培育的圖像Fig.6 Photographic images of zebrafish and bean sprouts incubated with 0.872 mg/L N-CDs

時(shí)至今日，熒光油墨正被普及用于印刷領(lǐng)域，將來(lái)還可以用于信息存儲(chǔ)和信息加密。由于其優(yōu)異且穩(wěn)定的熒光性能，所制備的N-CDs溶液可用作熒光油墨。經(jīng)驗(yàn)證，在無(wú)熒光的濾紙上，利用N-CDs可繪制各種各樣的卡通形象(圖7(A))，在365 nm紫外光照射下，生動(dòng)的卡通形象顯現(xiàn)出獨(dú)特的亮藍(lán)色熒光(圖7(B))。

圖7 利用N-CDs作為熒光墨水在濾紙上繪制的不同卡通形象分別在自然光和紫外線(xiàn)照射條件下的圖像Fig.7 Photographic images of different cartoon stamps using N-CDs as a fluorescent ink on filter paper under day light and UV light illumination

3 結(jié)論

以L(fǎng)-蘋(píng)果酸、3,3′-二氨基二丙胺和氟化銨為前驅(qū)體，通過(guò)簡(jiǎn)單的水熱法一步成功地合成了N-CDs。該N-CDs擁有特殊的單激發(fā)雙發(fā)射的熒光特性，最大的激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為425 nm和850 nm，其熒光量子產(chǎn)率為17.5%。此外，N-CDs具有優(yōu)異的光學(xué)、酸堿、抗鹽和抗生物小分子穩(wěn)定性，既可用于斑馬魚(yú)和豆芽的生物成像，又可作為熒光油墨用于成像。