當(dāng)歸多糖減輕大鼠肢體缺血再灌注后肝損傷及其機(jī)制

李巖 劉婭楠 李文娟 呂理澆 劉志漢 趙曉紅 張凌云 薛建軍

(1甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省中醫(yī)院麻醉科；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué))

急性肢體缺血是指各種原因?qū)е碌闹w灌注減少，并可能危害肢體活力，其中主要的發(fā)病原因是缺氧〔1〕，常見(jiàn)于止血帶使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、血栓、肢體急性創(chuàng)傷的等。急性肢體缺血除了可引起遠(yuǎn)端肢體的缺血損傷外，還可通過(guò)內(nèi)分泌-免疫機(jī)制引起全身臟器的損傷〔2〕。在缺血后的再灌注階段液體轉(zhuǎn)移進(jìn)入周圍組織間隙，血管松弛因子如一氧化氮生成減少導(dǎo)致血管阻力增加，同時(shí)血管本身也通過(guò)抑制血管擴(kuò)張和促進(jìn)血管收縮的自我調(diào)節(jié)來(lái)應(yīng)對(duì)全身炎癥反應(yīng)，其結(jié)果周圍動(dòng)脈血管強(qiáng)烈收縮，導(dǎo)致外周器官缺血缺氧并形成惡性循環(huán)〔3〕。缺血再灌注損傷時(shí)通常伴有全身炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞募集激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞黏附分子和選擇素進(jìn)入血循環(huán)并引發(fā)全身性補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活〔4〕，因此缺血再灌注損傷的主要機(jī)制是大量的氧自由基釋放及復(fù)雜的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)風(fēng)暴，使遠(yuǎn)端器官的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激持續(xù)產(chǎn)生，臨床上可表現(xiàn)為多器官功能障礙，如急性腎衰竭和急性肺損傷，除此以外，肝臟也被認(rèn)為是潛在的受累器官，其中炎癥和氧化應(yīng)激是主要的損傷機(jī)制〔5〕，因此，抗炎和抑制氧化被認(rèn)為是減輕急性肢體缺血再灌注導(dǎo)致的肝損傷的重要途徑。

當(dāng)歸是一種多年生草本植物，由于其具有營(yíng)養(yǎng)、補(bǔ)血和抗炎等作用，已廣泛應(yīng)用于心血管疾病、肝纖維化和風(fēng)濕性疾病的治療中。當(dāng)歸多糖(AP)是當(dāng)歸中最重要的生物活性成分，具有促進(jìn)造血功能、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生物學(xué)功能〔6,7〕。有研究發(fā)現(xiàn)AP可以抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的脊髓細(xì)胞凋亡和炎癥，保護(hù)細(xì)胞活性〔8〕。此外有研究顯示AP通過(guò)抑制核因子(NF)-κB及雙面激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(AK2/STAT3)通路調(diào)節(jié)HT22細(xì)胞中miR-10a水平，減輕LPS誘導(dǎo)的炎性損傷〔9〕。然而對(duì)于AP對(duì)肢體缺血再灌注后肝損傷的保護(hù)效應(yīng)，目前尚無(wú)相關(guān)研究。為了進(jìn)一步對(duì)AP的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究，本文通過(guò)構(gòu)建大鼠肢體缺血再灌注后肝損傷模型，探究AP減輕大鼠肢體缺血再灌注后肝損傷及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，2月齡，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，倫理編號(hào)為：2018-102。大鼠雄性體重150～200 g，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)：2019002，大鼠在SPF環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，常規(guī)飲食，自由飲水。

1.1.2試劑 戊巴比妥鈉(用生理鹽水配制為1%溶液)，Tris·HCl緩沖液，4%多聚甲醛溶液，1%四氧化鋨等均購(gòu)自蘭州科寶實(shí)驗(yàn)器材有限公司；甲基丙二醇(MPO)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司；NF-κB抗體和Nrf2抗體均購(gòu)買自美國(guó)CST公司。

1.1.3儀器 電子天平，恒溫水浴鍋，低溫離心機(jī)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，722紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和DH164電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海君恒醫(yī)療。

1.1.4受試藥物 AP購(gòu)自MCE公司(中國(guó))，為果膠酶法提取，利用苯酚-硫酸法測(cè)定得率約25%，經(jīng)蘭州大學(xué)藥理學(xué)教研室鑒定符合藥典規(guī)定，質(zhì)量合格，藥物純度99%，批號(hào)N-30SIK2。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6 組：正常對(duì)照組(不做任何缺血處理，只灌胃給予生理鹽水)、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(依達(dá)拉奉)，AP低劑量組，AP中劑量組、AP高劑量組，每組10只。

1.2.2AP給藥處理 AP的臨床給藥劑量為20 mg/kg，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》〔10〕附錄里有關(guān)于各種動(dòng)物之間給藥劑量換算系數(shù)的表，根據(jù)相應(yīng)的系數(shù)計(jì)算，大鼠AP各劑量組灌胃劑量分別以50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg，用生理鹽水配制，每天1次(早晨9∶00)。陽(yáng)性對(duì)照組依達(dá)拉奉以3 mg/kg灌胃，正常對(duì)照組、模型組用等量無(wú)菌生理鹽水灌胃處理。各組均連續(xù)灌胃7 d。灌胃期間每日嚴(yán)格觀察并記錄大鼠的生理狀況、活動(dòng)狀況。

1.2.3肢體缺血再灌注損傷造模 用藥7 d后開(kāi)始缺血再灌注損傷造模，造模前所有大鼠禁水2 h，1% 戊巴比妥鈉(25 mg/kg)腹腔注射麻醉，將麻醉完畢的大鼠四肢和頭部束縛于自制鼠板上，左后肢脫毛后，根部環(huán)扎橡皮筋?yuàn)A閉左后肢股動(dòng)脈，造成左后肢缺血，缺血2 h后，立即松開(kāi)橡皮筋持續(xù)灌注6 h后再標(biāo)本取樣。大鼠均采用相同彈性強(qiáng)度的橡皮筋，缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間均嚴(yán)格控制，保證實(shí)驗(yàn)對(duì)象間的均一性。

1.2.4標(biāo)本采集和處理 各組大鼠，心臟采血4 ml；全血離心(4℃，1 000 r/min，離心20 min)后分裝血清，-20℃冰箱凍存，用于生化分析。收集血液后，解剖大鼠，迅速取肝臟，置于冰凍生理鹽水中反復(fù)漂洗，濾紙吸干，精密稱量臟器的重量，計(jì)算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝臟重量/大鼠體重×100%。取小塊肝臟組織保存于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，其余凍存于-80℃冰箱。

1.2.5MPO檢測(cè) 肝臟勻漿的制備方法：采用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris·HCl)50 mmol/L，pH7.4制備肝勻漿。MPO檢測(cè)時(shí)，在96孔細(xì)胞板中加入待測(cè)血清20 μl或者肝臟組織勻漿液20 μl，加入200 μl過(guò)氧化氫反應(yīng)液，然后加入200 μl顯色液(茴香胺反應(yīng)液)65℃ 反應(yīng)30 min，在酶標(biāo)儀中波長(zhǎng) 420 nm下測(cè)定各孔的OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算各孔MPO水平。

1.2.6檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β水平 TNF-α,IL-1β水平主要運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)，ELISA 操作主要步驟：用已經(jīng)將TNF-α或IL-1β抗體吸附在固相載體的表面的試劑盒，加入相應(yīng)血清反應(yīng)30 min后，TBST洗板，加入TNF-α或IL-1β抗體反應(yīng)2 h后，TBST洗板，加入酶的耦聯(lián)物反應(yīng)30 min后洗板，最后加入酶相應(yīng)的底物，反應(yīng)顯色。顏色的深淺與固相載體上的抗原/抗體呈正比，用酶標(biāo)儀讀取吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算，即得所檢測(cè)因子的濃度。

1.2.7肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè) 4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，石蠟切片脫蠟。切片充分脫蠟和水化后，將切片入蘇木素染3～8 min，蒸餾水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min染細(xì)胞質(zhì)將切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min-95%酒精Ⅱ 5 min-無(wú)水乙醇Ⅰ5 min-無(wú)水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.8TUNEL染色 4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟切片，切片充分脫蠟和水化，依次將切片放入二甲苯Ⅰ10 min-二甲苯Ⅱ10 min-無(wú)水乙醇Ⅰ5 min-無(wú)水乙醇Ⅱ5 min，然后切片水化：95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸餾水洗反應(yīng)充分、均勻。蛋白酶k孵育20 min細(xì)胞通透，加入TUNEL 37℃ 反應(yīng)30 min，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)充分清洗，顯微鏡鏡檢并拍照，圖像采集分析。

1.2.9Western印跡檢測(cè) 肝臟組織利用液氮粉碎組織塊，加入RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)震蕩勻漿，冰上孵育30 min，4℃ 14 500 r/min離心15 min，上清液為組織裂解液，加等體積的2×電泳加樣緩沖液，沸水浴中6 min，電泳上樣，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，然后經(jīng)過(guò)封閉，一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h后，Western印跡試劑盒顯色，分析比較記錄。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠身體情況和肝臟指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠無(wú)死亡情況和明顯的體重降低情況。造模后模型組大鼠夾閉左后肢股動(dòng)脈后血管搏動(dòng)消失，肢體蒼白伴有攣縮，2 h后松開(kāi)橡皮筋后，血管搏動(dòng)恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)中大鼠麻醉后均蘇醒，模型組及藥物治療的造模大鼠均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，弓背，毛發(fā)聳立，而正常對(duì)照組無(wú)上述癥狀。

模型組肝臟指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，表明模型組大鼠肝臟充血明顯增多。陽(yáng)性對(duì)照組、AP各劑量組肝臟指數(shù)較模型組顯著降低(P<0.05，P<0.001)，提示肝臟充血損傷減輕。AD高、中劑量組較AP低劑量組肝臟指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而AP中劑量組和高劑量組肝臟指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示AP對(duì)肝臟充血損傷具有一定的改善作用，但并未呈現(xiàn)劑量依賴式增加，而是具有一定的濃度域。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠肝損傷病理比較 模型組肝臟充血明顯，局部肝臟細(xì)胞片狀壞死，伴有肝臟細(xì)胞脂肪變性、水泡樣變性及炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞損傷明顯，表明模型組大鼠存在明顯的肝臟損傷。在陽(yáng)性對(duì)照組肝臟充血壞死明顯改善，僅可見(jiàn)少許肝臟脂肪樣變及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。AP各劑量組肝臟中細(xì)胞壞死同樣較模型組改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，僅表現(xiàn)為部分肝臟細(xì)胞水泡樣變。見(jiàn)圖1。

表1 AP對(duì)大鼠肝臟指數(shù)及TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的影響

圖1 各組大鼠肝臟HE染色結(jié)果(×200)

2.3各組大鼠肝細(xì)胞凋亡水平比較 模型組大鼠肝臟組織中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增多(P<0.01)，表明模型組肝臟細(xì)胞凋亡明顯。陽(yáng)性對(duì)照組肝臟細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯較少(P<0.01)，表明依達(dá)拉奉對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可明顯降低肝細(xì)胞凋亡水平。AP各劑量組肝臟細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較模型組明顯減少(P<0.05，P<0.01)，表明AP處理后的大鼠肝細(xì)胞凋亡減少，提示依達(dá)拉奉及AP處理后，大鼠肢體缺血再灌注所致的肝細(xì)胞凋亡水平改善。見(jiàn)表1、圖2。

2.4各組大鼠血清MPO、TNF-α、IL-1β水平比較 模型組血清MPO水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。各給藥組血清中MPO水平較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)。模型組TNF-α,IL-1β水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，各給藥組TNF-α,IL-1β水平較模型組顯著降低(P<0.05，P<0.01)。AP中劑量組的MPO、TNF-α、IL-1β水平較AP低劑量組明顯降低，而AP劑量組和高劑量組MPO、TNF-α、IL-1β水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.5大鼠肝臟組織中HO-1/Nrf2及TLR4/NF-κB通路激活水平 與正常對(duì)照組比較，模型組NF-κB表達(dá)升高，Nrf2下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組與模型組比較，NF-κB表達(dá)下調(diào)的同時(shí)Nrf2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2、圖3。

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡水平比較(TUNEL，×200)

表2 AP對(duì)大鼠血清MPO、TNF-α、IL-1β的影響及HO-1/Nrf2、TLR4/NF-κB通路的激活

1～6：正常對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，AP低劑量組，AP中劑量組，AP高劑量組圖3 AP對(duì)HO-1/Nrf2及TLR4/NF-κB通路的激活

3 討 論

急性肢體缺血再灌注損傷期間，缺血組織釋放大量的炎癥因子及代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，如肌酸酐磷酸激酶、肌紅蛋白、乳酸脫氫酶及鉀離子會(huì)干擾整個(gè)機(jī)體并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而使肝臟、肺等非缺血器官發(fā)生炎癥反應(yīng)，甚至多器官衰竭〔4〕，對(duì)于腎臟，血漿肌紅蛋白過(guò)量會(huì)導(dǎo)致腎小球的小動(dòng)脈閉塞，誘發(fā)急性腎衰竭〔11〕，對(duì)于肺臟，急性肢體缺血損傷導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)使血管通透性的增加，從而導(dǎo)致肺水腫〔12〕，對(duì)于遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注后各器官的易損程度，研究發(fā)現(xiàn)各個(gè)器官均易導(dǎo)致再灌注損傷，且組織之間再灌注損傷的嚴(yán)重程度沒(méi)有差異〔13〕，因此這一研究提示在肢體缺血再灌注后，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)端各臟器的功能。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)大鼠遠(yuǎn)端肢體缺血再灌注后，可引起肝臟明顯的充血，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大鼠肝臟細(xì)胞凋亡增加，本研究的大鼠肝損傷表型也與相關(guān)研究結(jié)果一致〔14,15〕。

雖然改善血流(再灌注)是克服肢體缺血的重要方法，然而，不適當(dāng)?shù)脑俟嘧⒖捎|發(fā)促炎介質(zhì)的激活和活性氧(ROS)的形成，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征〔16〕，因此抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是改善肢體缺血再灌注損傷的重要途徑，有研究發(fā)現(xiàn)給予肢體缺血再灌注大鼠模型生物堿千金藤素(Cepharanthine)后，由于Cepharanthine可抑制腫瘤壞死因子TNF-α介導(dǎo)的NF-κB激活，實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注模型大鼠的氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)明顯降低〔17〕。AP具有眾多的生物學(xué)效應(yīng)，AP目前已被證實(shí)在調(diào)節(jié)炎癥中具有一定的作用，研究發(fā)現(xiàn)AP給藥后不僅增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，也顯著提高了特異性免疫球蛋白(IgG)免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子水平，誘導(dǎo)了輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2混合免疫應(yīng)答〔18〕。AP可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激水平，提高軟骨細(xì)胞的活性，改善骨關(guān)節(jié)炎〔19〕，因此上述研究提示AP對(duì)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激具有一定的抑制作用。

本結(jié)果表明，在大鼠肢體缺血再灌注后，肝細(xì)胞凋亡水平增加，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激水平增加，表現(xiàn)為TUENL染色陽(yáng)性細(xì)胞增多，MPO、TNF-α和IL-1β水平顯著升高。當(dāng)給予AP后，大鼠肝細(xì)胞凋亡水平及炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平均顯著降低，表明AP可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平對(duì)肢體缺血再灌注后的大鼠肝損傷具有一定的保護(hù)效應(yīng)。AP的肝臟保護(hù)作用目前已有研究證實(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)AP可降低過(guò)量對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的大鼠肝損傷，改善脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激，并抑制細(xì)胞凋亡〔20〕，因此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示AP可能是一種有潛力的肝保護(hù)劑。

為了進(jìn)一步研究AP的潛在的肝損傷保護(hù)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵信號(hào)通路HO-1/Nrf2通路及與炎癥免疫機(jī)制密切相關(guān)的TLR4/NF-κB通路的激活水平，發(fā)現(xiàn)AP激活Nrf2/HO-1通路，抑制TLR4/NF-κB通路，降低肢體缺血再灌注后的肝損傷。有研究顯示AP可顯著提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活力，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1、堿性磷酸酶(ALP)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化〔21〕，此外研究發(fā)現(xiàn)AP通過(guò)環(huán)腺苷酸(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合信號(hào)通路顯著調(diào)控凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔22〕，那么AP是否通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡減輕肢體缺血再灌注后的肝損傷，將是下一步的研究重點(diǎn)。

綜上，AP通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)HO-1/Nrf2通路抑制氧自由基釋放及復(fù)雜的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)風(fēng)暴，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，緩解肢體缺血再灌注后的肝損傷，本研究為臨床治療肢體缺血再灌注后肝損傷提供了一種可能的治療策略。