不同濃度他達(dá)那非對(duì)感音神經(jīng)性聾聽(tīng)力損傷的修復(fù)作用

梁媛 郭霞 劉吉娜 趙雷 郝然 曹靜 張淑君

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河北 承德 067000；2河北大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科)

感音神經(jīng)性耳聾是導(dǎo)致患者聽(tīng)覺(jué)損傷的常見(jiàn)類型，患者出現(xiàn)聽(tīng)力障礙，對(duì)人們的日常生活帶來(lái)嚴(yán)重的影響。感音神經(jīng)性聾是因?yàn)闄C(jī)體聽(tīng)神經(jīng)、內(nèi)耳、聽(tīng)覺(jué)中樞發(fā)生器質(zhì)性病變，對(duì)聲音感受、分析起到一定的阻礙作用，導(dǎo)致聽(tīng)力減退，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致聽(tīng)力完全喪失〔1〕。目前臨床中主要通過(guò)擴(kuò)血管藥物進(jìn)行治療感音神經(jīng)性聾，有助于內(nèi)耳血流量提高，對(duì)血管痙攣也起到改善作用〔2〕，但是治療效果不明顯。Liu等〔3〕研究指出，5-磷酸二酯酶(PDE5)蛋白在耳蝸中顯示高表達(dá)，提示在聽(tīng)覺(jué)損傷方面PDE5抑制劑具有潛在治療價(jià)值。他達(dá)那非屬于一種選擇性的PDE5抑制劑，能有效提高機(jī)體血液中環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)、一氧化氮(NO)水平，在選擇性擴(kuò)張肺血管方面發(fā)揮著重要作用〔4〕。目前關(guān)于他達(dá)那非治療感音神經(jīng)性聾相關(guān)研究較少。本研究探討不同濃度他達(dá)那非對(duì)感音神經(jīng)性聾豚鼠模型聽(tīng)力損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取60只健康雄性豚鼠，鼠齡2個(gè)月，體重220～300 g，均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK(冀)2018-008。所有豚鼠耳廓反射靈敏，均在室溫22℃、濕度50%的安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1感音神經(jīng)性聾豚鼠模型建立及分組 60只豚鼠中隨機(jī)選取12只為正常組，其余48只參考文獻(xiàn)〔5〕建立感音神經(jīng)性聾模型：采用40 mg/kg戊巴比妥鈉對(duì)48只豚鼠給予腹腔麻醉，無(wú)菌條件下在豚鼠顱頂雙側(cè)皮質(zhì)聽(tīng)區(qū)，通過(guò)硬膜手術(shù)將不銹鋼絲慢性電極植入其中，牙科水泥固定1 w，將每只豚鼠單籠飼養(yǎng)，在暴露倉(cāng)中，白噪音為20～2 000 Hz，通過(guò)擴(kuò)音器(GY型400W)放大，通過(guò)揚(yáng)聲器在暴露倉(cāng)中播放，頻率分析儀(B&K 2107型)完成連續(xù)監(jiān)測(cè)，暴露聲壓級(jí)110 dB，1次/d，每次持續(xù)1.5 h，連續(xù)干預(yù)1 w。正常組只做不銹鋼絲慢性電極植入手術(shù)。48只模型豚鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各12只。豚鼠對(duì)外界聲刺激無(wú)反應(yīng)，耳廓無(wú)抖動(dòng)，耳反射完全消失，耳廓下垂，說(shuō)明模型建立成功。

1.2.2藥物干預(yù) 待模型建立成功后，正常組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，低、中、高劑量組給予他達(dá)那非(分別為0.1、1.0、2.0 mg/kg生理鹽水稀釋)腹腔注射，1次/d。各組豚鼠連續(xù)干預(yù)4 w。

1.2.3耳廓豎立、耳動(dòng)反射檢查 模型建立后，各組豚鼠均在距離其30 cm位置用力擊掌，觀察各組耳廓豎立、抖動(dòng)等狀況，擊掌5次，每次間隔2 s，在安靜無(wú)雜音的環(huán)境中進(jìn)行，全程錄像記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：①豚鼠耳廓無(wú)抖動(dòng)，耳反射完全消失為(-)；②豚鼠耳廓有微弱抖動(dòng)，耳反射閾值有明顯提高為(+)；③豚鼠耳廓有明顯的抖動(dòng)，耳反射閾值有提高為()；④豚鼠耳廓抖動(dòng)靈敏，耳反射閾值無(wú)變化為()。

1.2.4聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值、Ⅰ波潛伏期檢查 在豚鼠清醒狀態(tài)下將其關(guān)在隔音電屏蔽室中，對(duì)豚鼠顱頂部位電極進(jìn)行記錄，選擇豚鼠同側(cè)及對(duì)側(cè)乳突部位置入?yún)⒖己徒拥仉姌O。參考數(shù)值設(shè)置：濾波帶30～3 000 Hz，1 024次疊加，掃描15 ms，方波脈沖刺激0.1 ms，頻率為20 Hz，統(tǒng)計(jì)各組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期數(shù)據(jù)。

1.2.5氧化應(yīng)激、炎癥因子相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 抽取豚鼠腹部靜脈血3 ml，以3 000 r/min離心速度，離心處理10 min后，分離上層血清。采用硫代巴比妥酸檢測(cè)丙二醛(MDA)水平；采用黃嘌呤氧化酶反應(yīng)檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)水平；采用催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧反應(yīng)產(chǎn)生NO，與親核性物質(zhì)形成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下計(jì)算誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平：將提前稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl加入相應(yīng)的微孔板反應(yīng)空中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37℃下處理90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；將準(zhǔn)備好的抗體加入到每孔中0.1 ml，在37℃下處理60 min，底物四甲基聯(lián)苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔內(nèi)液體，每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光處理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS終止液，即藍(lán)色變?yōu)辄S色。在波長(zhǎng)450 mm處分析IL-6、TNF-α水平。

1.2.6耳蝸組織病理學(xué)觀察 處死豚鼠，在枕骨大孔處解剖后快速提取耳蝸組織制作標(biāo)本，將其置于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定，制作常規(guī)石蠟切片，在濃度0.5%蘇木素-伊紅染色10 min，自來(lái)水沖洗1次；使用乙醇梯度進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

1.2.7Notch2、hes1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡檢測(cè)，將采集到的血液標(biāo)本10 000 r/min離心處理10 min，對(duì)上清液進(jìn)行提取后，二喹啉甲酸(BCA)進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(Notch2、hes1一抗為1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動(dòng)孵育時(shí)間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時(shí)間為5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組豚鼠耳廓豎立、耳動(dòng)反射比較 正常組聽(tīng)覺(jué)及耳動(dòng)反射表現(xiàn)為()，經(jīng)過(guò)外界聲刺激耳廓豎起。模型組經(jīng)過(guò)外界聲刺激，耳廓表現(xiàn)為無(wú)抖動(dòng)，無(wú)反射，耳廓下垂，耳動(dòng)反射為(-)。低劑量組經(jīng)過(guò)外界聲刺激耳廓抖動(dòng)較弱，耳動(dòng)反射為(+)，耳廓下垂；中劑量組經(jīng)過(guò)外界聲刺激耳廓有抖動(dòng)，耳動(dòng)反射為()，耳廓半豎起半下垂；高劑量組經(jīng)過(guò)外界聲刺激耳廓明顯抖動(dòng)，耳動(dòng)反射為()，耳廓豎起，下垂不明顯。見(jiàn)圖1。

2.2各組豚鼠ABR閾值、Ⅰ波潛伏期比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組豚鼠耳廓豎立情況比較

表1 各組豚鼠ABR閾值、Ⅰ波潛伏期、氧化應(yīng)激及炎癥因子相關(guān)指標(biāo)比較

2.3各組豚鼠氧化應(yīng)激及炎癥因子相關(guān)指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組SOD水平降低，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組豚鼠耳蝸組織病理學(xué)觀察 正常組耳蝸組織未見(jiàn)淋巴積水，前庭膜完整、平直，鼓階、前庭階、蝸管結(jié)構(gòu)完整。模型組耳蝸組織出現(xiàn)不同程度的積水，前庭階方向隆起擴(kuò)張，有前庭膜發(fā)生破裂。低劑量組、中劑量組、高劑量組積水程度均有不同程度的緩解，其中中劑量組前庭膜膨隆程度較輕，高劑量組淋巴積水消失，前庭膜正常，病理學(xué)狀況得到明顯改善。見(jiàn)圖2。

圖2 各組耳蝸組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.5各組Notch2、hes1蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組Notch2、hes1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組Notch2、hes1蛋白表達(dá)比較

圖3 各組Notch2、hes1蛋白表達(dá)

3 討 論

感音神經(jīng)性聾屬于一種常見(jiàn)的聽(tīng)力損傷疾病，其發(fā)病原因是因?yàn)槎佒械拿?xì)胞被損害，堅(jiān)持早發(fā)現(xiàn)、早治療，能最大程度地恢復(fù)患者聽(tīng)力〔6〕。豚鼠與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比具有發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)聲音的敏感性較高，一方面試因?yàn)殡嗍鬄榇蠖?，?tīng)覺(jué)耳動(dòng)反射較為明顯；另一方是豚鼠的耳蝸結(jié)構(gòu)與人有共同之處，通過(guò)解剖能得到完整的耳蝸〔7，8〕，因此本文研究選擇豚鼠作為研究動(dòng)物。

本研究結(jié)果提示，高濃度他達(dá)那非對(duì)豚鼠形態(tài)學(xué)變化起到一定的保護(hù)作用。ABR屬于一種神經(jīng)源性電活動(dòng)，在聽(tīng)力測(cè)試中被廣泛應(yīng)用，能清晰地顯示各波段的起源，常被用來(lái)診斷聽(tīng)覺(jué)損傷〔9〕。相關(guān)研究證實(shí)，短聲會(huì)導(dǎo)致ABR耳蝸底回，短聲引起的低頻刺激會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ波，一旦發(fā)生損傷，行波會(huì)出現(xiàn)延遲，與耳蝸鋪片底回尤其是鉤端毛細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷有關(guān)〔10，11〕。本研究結(jié)果提示，高濃度他達(dá)那非能減輕對(duì)豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷，對(duì)其聽(tīng)覺(jué)起到一定的保護(hù)作用。

MDA是膜脂過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，其水平大量增加會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生損傷，臨床中常用來(lái)反映膜脂過(guò)氧化過(guò)程損傷程度〔12〕。SOD屬于一種抗氧化酶，在機(jī)體中廣泛存在，其生理活性特殊，對(duì)機(jī)體中的自由基有清除作用，常用SOD含量反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度〔13〕?；钚匝?ROS)是氧氣正常代謝的產(chǎn)物，在其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中NO、過(guò)氧化氫等發(fā)揮著重要作用。他達(dá)那非對(duì)加內(nèi)皮型NO釋放有一定的促進(jìn)作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能有一定的改善作用〔14〕。本研究中他達(dá)那非干預(yù)后，豚鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)被抑制，呈現(xiàn)濃度依賴。Shin等〔15〕研究指出，噪音誘導(dǎo)耳蝸損傷，IL-6在螺旋神經(jīng)節(jié)、側(cè)壁細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)有研究證實(shí)，IL-6能對(duì)急性耳蝸損傷有誘導(dǎo)作用〔16〕。TNF-α?xí)龠M(jìn)促炎細(xì)胞在耳蝸組織中大量累積〔17〕。本研究證實(shí)，高劑量他達(dá)那能明顯抑制感音神經(jīng)性聾豚鼠模型炎癥反應(yīng)。

Notch蛋白主要存在于細(xì)胞膜受體中，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有直接調(diào)節(jié)作用，通過(guò)對(duì)細(xì)胞分化信號(hào)、特化基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，保留細(xì)胞特化的潛力〔18〕。hes1屬于Notch信號(hào)通路下游中重要的效應(yīng)因子，在耳蝸的發(fā)育中起到參與作用，對(duì)毛細(xì)胞的分化有調(diào)節(jié)功能〔19，20〕。Liu等〔21〕研究指出，hes1過(guò)表達(dá)會(huì)抑制毛細(xì)胞分化，從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，Notch2/hes1信號(hào)通路在毛細(xì)胞損傷、修復(fù)過(guò)程中至關(guān)重要。本研究提示，通過(guò)調(diào)控Notch2/hes1信號(hào)通路，參與毛細(xì)胞損傷、修復(fù)過(guò)程，可修復(fù)豚鼠聽(tīng)力損傷。

綜上，他達(dá)那非對(duì)感音神經(jīng)性聾豚鼠模型干預(yù)效果顯著，能改善豚鼠聽(tīng)力，通過(guò)調(diào)控Notch2/hes1蛋白，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，對(duì)聽(tīng)力損傷起到一定的修復(fù)作用。